国家标准 GB/T36191一2018 真鲷虹彩病毒病诊断规程 breamiridovirusdisease(RSIVD) Protolofdiagnosticmethodsforredsea 2018-05-14发布 2018-12-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36191一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TcC156)归口本标准起草单位;深圳出人境检验检疫局、中山大学,深圳市检验检疫科学研究院本标准主要起草人:兰文升、刘莹、于力、王津津、史秀杰、董传福,刘豇、贾鹏、郑晓聪、何俊强、叶奕优、王红英
GB/36191一2018 真绸虹彩病毒病诊断规程范围本标准规定了真绸虹彩病毒病(Redseabreamiridovirusdisease，RSIVD)临床诊断,采样和病毒分离鉴定和综合判定的方法本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件 BLAsT:局部序列比对检索工具(basiclocalalignmentsearchtool p,喊基对(asepair) CTAB;十六烧基三甲基嗅化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) athiceffect CPE细胞病变效应(eytopa DMEM.DulbecoEagle'sminimumessentialmedium Imbromide EB:溴化乙锭(ethidiun esceinisothiocyanate FITC:异硫酸荧光素(luore IEAT:间接荧光抗体实验(indireectluorescentantibodytest) fectiousspleenandkidneynecrosisvirus) ISKNV:传染性脾肾坏死病毒(infd mandarinfishfrycellline) MFF-1;蹶鱼鱼苗细胞系(n bufferedsaline PBS;磷酸盐缓冲液(phosphate PHBsT:含0,05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(0.05% phosphatebufferedsaline tween一 PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction breamiridoviralvirus) RSIV:真绸虹彩病毒(redsea seabreamiridoviraldisease RsIVD:真鲷虹彩病毒病(red 试剂和材料 4.1水:符合GB/T6682中一级水的规格 4.2RSIV参考株注;由农业部相关部门指定提供
GB/T36191一2018 4.3PCR反应试剂dNTPs,Taq酶等),保存一20'C 4.4引物;引物浓度为20umol/L 引物序列 1-F:5'-CTCAAACACTCTGGCTCATC3' L-R.5'-G;CAcCcAACACATcTccTATCc-3'" 4.5MFF-1细胞系注由农业部相关部门指定提供 4.6细胞培养液:含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液 4.7胎牛血清(FBS). 4.8抗RSIV的单克隆抗体(鼠源. 注由农业部相关部门指定提供 4.9异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠抗体 o 器材和设备器材和设备包括如下 a) 超净工作台冷冻离心机 b 生化培养箱 c 普通冰箱和低温冰箱 d 荧光显微镜 e 倒置显微镜 PCR仪 g h核酸电泳系统凝胶成像仪临床诊断 6 6.1临床症状该病主要症状为鱼体色变黑,游动缓慢,呼吸加快,外表症状不明显,个别眼球突出、出血,体表出血内脏诸器官褪色,牌脏肿大 6.2组织病理检测制备脾脏的印片或组织切片,经吉姆萨(Giemsa)染色,见附录A中A.1,患病样品镜检可见异常肿大的细胞 6.3结果判定 6.3.1符合6.1的临床症状典型特征,并且经组织病理检测可见异常肿大的细胞,临床诊断结果阳性 6.3.2不符合6.1的临床症状典型特征,并且经组织病理检测未见异常肿大的细胞,临床诊断结果阴性
GB/36191一2018 采样 7.1采样对象牙邹、美国红鱼、真绷、鱼和撅鱼等易感鱼类 7.2采样数量采样数量应符合sC/T7103的要求 7.3样品采集按GB/T18088的规定执行,且体长<4cm的鱼苗取整条,体长4cm6cm的鱼取内脏;体长大于6cm的鱼则取脾、肾、心脏、肠和病毒分离和鉴定 8.1病毒分离 8.1.1样品处理每5尾鱼为1个样品,若有症状成鱼每1尾为1个样品采集的组织样品(最少不低于5因)立刻研磨匀浆,用细胞培养液将研磨后的组织稀释10倍,置于25C一27C培养箱中孵育24h,待用 8.1.2病毒分离培养 8.1.2.1将MFF-1细胞经细胞消化液(见A.2)消化后,加细胞培养液转接至96孔板,培养24h,制备单层细胞,待用 8.1.2.2将孵育的组织样品8000g离心15min，收集组织匀浆上清液 8.1.2.3组织匀浆上清液做10倍稀释,在无菌条件下,分别接种到MFF-1细胞的96孔板,每孔中加人的组织上清液的量与细胞培养液的比例为l:1o 同时设立阳性对照(接种RsIV参考株)和阴性对照未接种病毒的细胞),置于25C27C培养 8.1.3细胞病变效应的观察 8.1.3.1倒置显微镜下观察细胞变化 8.1.3.2被检样品接种7d后没有观察到CPE(阳性对照已出现CPE),需盲传一次传代程序;将接种细胞反复冻融,收集细胞培养液,8000g离心15min,上清液分别接种到新制96孔板的单层细胞中,继续培养7d并观察 8.1.3.3如果细胞培养板的孔中出现CPE,细胞培养液进行IFAT试验或PCR鉴定 8.1.4结果判定 8.1.4.1以感染RSIV参考株的细胞培养物为阳性对照,以未感染RSIV的细胞为阴性对照如果阳性对照出现CPE,阴性对照无CPE,则实验成立,否则,重新实验 8.1.4.2如果病毒分离培养中出现CPE,则判定病毒分离结果阳性 8.1.4.3如果病毒分离培养和盲传培养没有出现CPE,则判定病毒分离结果阴性
GB/T36191一2018 8.2聚合酶链式反应 8.2.1对照设置以已知感染RSIV或ISKNV的鱼采集的组织样品作为阳性对照,以已知未感染RSIV或ISKNV 的健康鱼采集的组织样品作为阴性对照 8.2.2DNA抽提样品组织加约10倍体积灭菌生理盐水匀浆,取100AL组织匀浆,或者直接取出现CPE的细胞培养液100AL,加人到有500AlLcTAB溶液(见A.3)的1.5mL离心管中,65C作用30min 然后加人 20L蛋白酶K20mg /ml),55笔孵育301 继续向离心管中加人600pL抽提液1(见A.4),震荡 min 混匀30s 12000g离心5min,取上层水相(约600AL) 加人600AL抽提液2(见A.5),震荡混匀30 s 12000离心5min,小心取上层水相(约600pL) 加人1.5倍体积的预冷无水乙醇(900AL)上下颠倒混匀后,放置一20C冰箱8h以上然后,l2000g离心30min,弃上清液将离心管倒置于吸水纸上吸干残液,37C干燥20min 加llAL12AL水溶解后,作为PCR模板可使用等效的商业化试剂盒代替以上方法,操作步骤按照试剂盒操作手册进行 8.2.3DNA扩增 8.2.3.1 引物的选用在PCR扩增中,选用引物1-F和1-R,该对引物对RsIV和ISKNV基因组中的部分基因片段均可有效扩增,产物大小为570bp(见附录B) 8.2.3.2反应体系反应体系见表1 表1CR反应体系(50L体系) 反应试剂加样体积抽提的模板DNA 4AL 10×DNA聚合酶缓冲液含20mmol/I.Mg十 54L dNTPMixture(各2.5mmol/L 44L 1-FPrimer(20Amol/L) 1AL nol/1 1-RPrmer(20mol 1儿 1AL DNA聚合酶(5U/L 双蒸水 34L 总体积 50L 注:反应体系可以根据比例相应扩大或者缩小 8.2.3.3PCR反应条件 95C2nmin;94C30s,58C60s72C60s,30个循环;72C延伸5min,C保存
GB/36191一2018 8.2.3.4电泳和基因测序 PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像仪观察结果如果观察到结果阳性,对PCR扩增产物进行基因测序,并将测序结果与参考序列(见附录B)进行比对,或在GenBank进行BLAST比对分析 8.2.4结果判定 8.2.4.1阳性对照样品能够扩增570bp片段,而阴性对照不能扩增出目的大小的核酸片段,表明实验成立,否则实验不成立 8.2.4.2扩增出大小为570bp片段,结合测序结果,判定PCR结果阳性 8.2.4.3无扩增或扩增条带大小不是570bp,或测序结果不符,则判定PCR结果阴性 8.3间接荧光抗体实验 8.3.1对照设置用感染RSIV参考株的单层细胞作为阳性对照,用未接种任何病毒的单层细胞作为阴性对照 8.3.2玻片的制备在8孔板中置人飞片并加人新鲜MFF-1细胞,25C一27C培养24h制备玻片 8.3.2.1 无菌条件下.,将10倍稀释的出现cPE的细胞培养液接种到MFF1细胞培养孔;同时设立财 8.3.2.2 性对照和阴性对照;2527C培养24h一72h 8.3.2.3吸出细胞培养液,用PS(见A.6)漂洗3次,然后用预冷固定液(见A.7)漂洗3次,取出玻片，空气中干燥20min,预冷丙酮固定10min 8.3.2.4待检组织玻片的制备放尽鱼血,取脾脏,横切,将组织压抹于载玻片上,制备成玻片将玻片在空气中干燥20min,预冷丙酮固定10min 8.3.3玻片的处理和显色 8.3.3.1用0.01mol/L,pH7.2的PBST(见A.8)将抗RsIV单克隆抗体稀释到工作浓度加人稀释后的抗RsIV的单克隆抗体,每2em细胞加2504L 37C湿盒中孵育30nmin 用PBST清洗玻片 3次 8.3.3.2加人异硫氢酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠的荧光抗体,每2enm细胞加250AL 37C湿盒中孵育30min 用PBST清洗玻片3次,然后甘油封片 8.3.4观察结果荧光显微镜观察 8.3.5结果判定 8.3.5.1阳性对照显示黄绿色荧光,阴性对照无荧光或显示微弱绿色背景荧光,实验成立 8.3.5.2细胞层或组织样品有特异的黄绿色荧光,整个细胞质充满弥散性的荧光,判定IFAT结果阳性 8.3.5.3细胞层或组织样品只有微弱的绿色背景,判定IFAT结果阴性
GB/T36191一2018 9 综合判定 g.1当被检样品的检测结果符合如下之一时,判定为RsIVD疑似病例临床诊断结果阳性 a b 病毒分离结果阳性 g.2疑似病例,符合下列条件两项时,确诊RSIVD阳性组织样直接PCR结果阳性 a b 病毒分离出现CPE的细胞培养液PCR结果阳性 c 组织样IFAT试验结果阳性 d 病毒分离出现CPE的细胞培养液IFAT结果阳性 9.3临床诊断结果阴性的被检样品,检测结果符合下列条件两项时,判定为RSIV携带者; 组织样直接cR结果阳性 a b 病毒分离出现CPE的细胞培养液PCR结果阳性组织样IFAT试验结果阳性 c d 病毒分离出现CPE的细胞培养液IFAT结果阳性
GB/36191一2018 附录 A 规范性附录) 试剂及其配制 A.1吉姆萨染色液及染色方法 A.1.1贮备液先将1gGiemsa粉置于研钵中,取66g甘油并且将少量加人研钵,充分研磨成无颗粒的糊状后,再将剩余甘油加人,搅拌均匀后,放人56C温箱中2h,然后加人66mL甲醇,保存于茶色瓶中,一般两周后使用为好 A.1.2工作液临用时将贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按1;20混合 A.1.3染色方法切片用甲醇固定5min,pH6.8的磷酸缓冲液漂洗,吉姆萨工作液染色20min一30min,染色后的标本在pH6.8缓冲液中洗涤后,晾干,然后用显微镜观察 A.2细胞消化液在10L.双蒸水中按顺序加人以下试剂:NaCl80g;Kcl2g;KH,PO1g;NaHPO12H,o 23 EDTA2g;胰酶6g;NaHCO大约4g6g,调pH7.48.0,正压过滤除菌,分装，一20C保存 g; A.3cTAB溶液 CTAB(hexadeeyltrimethyammoniumbromide),按2%CTAB，1.4mol/儿NaCI,20.0mmol/L EDTA.20.0nmol/LTris-HC缓冲液pH7.5配制,用前加硫基乙醇到终浓度为0.25% A.4抽提液1 酚/三氧甲烧/异戊醉,用1.0nmol/1pH(7.9士0.2)Iis饱和酚:三氧甲婉:异戊醇按25:24:1的比例混合,密闭避光保存 A.5抽提液2 三氯甲熔/异戊醇,将三氯甲熔和异戊醇按24:1的比例混合,密闭避光保存 A.60.01moL/LPBspl7.2~7.4) 取NagHPO,(1.19g、NaHPO,(0.22g)和NaCl(8.50g)加人800ml去离子水中,充分搅拌溶解
GB/T36191一2018 后,定容至1o00mL,4C保存固定液 30%丙酮/70%乙醇(体积比)的混合物 A.8PBST 含0,05%吐温80的PBS溶液
GB/36191一2018 附录B 规范性附录引物1-F和1-R扩增RSIV基因组的umknown基因部分序列 cTGCAGTTGccGcTCAAACACTcTGGcTcATcTATGTCATcGTAGTcGTc 50 51 CATTcCGcTGCC CccCCATcGTcAAGCAGTGTAGGCcGGTGG.AGTAACATTAT 100 01 150 151GATG7 200 GAT(GCGGC" N 201CAGCTTGATGACAGAC 250 251TCAGGACTTCACTGCTGTTG 300 301 350 351 400 401 GCAAC 450 451AGAAGAAGTAGCAGG6 500 501 550 551CACTGTGCTTGAGATAGGAGATGTGTTGGTGCTAGTGTCGCGTGACGACA 600 其中带下划线的基因片段为扩增引物

真鲷虹彩病毒病诊断规程GB/T36191-2018

真鲷虹彩病毒病是由真鲷虹彩病毒感染引起的一种急性、高度致死性疾病。该病毒主要侵染真鲷科鱼类，包括真鲷、黄花鱼、鲳等，也会感染其他家禽和野生动物。病毒通过血液、体液、排泄物、环境水体等途径传播，具有较强的传染性和致死性。

针对真鲷虹彩病毒病的诊断，我国于2018年发布了《真鲷虹彩病毒病诊断规程GB/T36191-2018》，该规程主要包括以下内容：

一、样品采集

样品采集应选择病死、病程中和预防接种后出现异常反应的鱼类。采集时避免污染，尽量使用无菌器具，不同样本分别采集，并尽快送至实验室检测。

二、临床诊断

针对真鲷虹彩病毒病的临床表现特点，结合病史和临床症状，初步诊断病情是否为该病毒感染引起。

三、实验室检测

实验室检测主要包括直接免疫荧光试验、蛋白印迹法和PCR扩增法等。其中，PCR扩增法是目前最常用的一种检测方法，其灵敏度和特异性都非常高。

四、确诊标准

根据《真鲷虹彩病毒病诊断规程GB/T36191-2018》，在满足以下任意一条条件的情况下，可作为确诊标准：

病理学检查证实有典型的病变表现；
实验室检测结果阳性；
基于流行病学调查和病理学检查，诊断为真鲷虹彩病毒病。

总的来说，根据GB/T36191-2018规程对真鲷虹彩病毒病进行诊断，可提高诊断准确性和检测效率，为防控该病的传播起到积极的作用。