化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验雌激素激动活性法

化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验雌激素激动活性法

国家标准 GB/T35519一2017 化学品稳定转染人雌激素受体 转录活性试验雌激素激动活性法 Chemiceals一Stably transfecetedhumanestrogenreceptortranscriptional activationassay一Detectionofestrogenicagonistsactivation 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35519一2017 引 言 本标准描述利用稳定转染的细胞系检测雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法,包括原理和 功能相似的雌激素受体(Estrogenreceptor,ERs)激动剂,旨在促进类似的或者经改进的检测方法符合 经济合作与发展组织关于危害评估新方法的验证和认可的指导规范 本标准附录A和附录B已经经过验证 附录A为利用稳定转染人ER的hERa-HeLa-9903细胞 系检测化学品雕激素活性的转录激活试验,附录B为利用能够表达人ERa的BGlLuc-4E:2细胞进行的 雌激素受体转录激活试验 本标准的雌雕激素受体转录激活试验方法可以在各国间使用,有利于数据 互认 1998年经济合作与发展组织发起优先项目活动,旨在对现行指导原则进行修订,同时为筛选和测 定潜在的内分泌干扰物制定新的指导原则 经济合作与发展组织的测定、评估潜在内分泌干扰物质的 概念框架于2012年修订 概念框架由5个阶段组成,不同阶段对应生物复杂性的不同阶段 本标谁是 二阶段的"体外试验,提供内分泌作用机制/通路信息" 本标准是鉴定雕澈素受体澈动剂的体外转录 第 激活试验方法
GB/35519一2017 化学品稳定转染人雌激素受体 转录活性试验雌激素激动活性法 范围 本标准规定了利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验的术语和定义、试验原理、试验方 法与步骤、数据和报告 本标准适用于利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验评估化学品类雌激素的生物 活性 术语、定义和缩略语 2.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1.1 激动剂agnist 与特定受体结合时能产生某种反应(如转录)的物质 2.1.2 拮抗剂amtagomst 与受体结合后自身不能引起生物反应,但能阻断或抑制激动剂介导的反应的一类受体的配体或化 学品 2.1.3 抗雌激素活性 anti-estrogemicactivity -种化学品抑制173雕二醉介导的雌雕激素受体作用的能力 2.1.4 活性炭/葡聚糖处理charcoal/dextrantreatment 细胞培养中的血浆处理方法,可以去除内源性激素和激素结合蛋白 2.1.5 细胞毒性eytotoxieity 与平行的溶剂对照组相比,对细胞结构或功能产生毒害并最终导致细胞死亡的毒性效应,表现为毒 物暴露后细胞数量减少或细胞功能减弱 2.1.6 雌激素活性estrogemicactivity 二醉结合和敞活雕微索受体的能力 化学品模拟173-雌 2.1.7 性能标准perfmaee standard 评估一种试验方法在机制和功能方面是否与验证方法一致的标准 包括: 基本的试验方法; 在验证方法中用来证明试验方法可行的最少的对照化学品清单;
GB/T35519一2017 -以验证试验为标准,测试试验通过对照品验证其准确性和可靠性的水平 2.1.8 稳定转染stabletransfeetion 当DNA被转染到培养的细胞后,整合到细胞基因中,稳定的表达所转染的基因,形成的细胞克隆 用稳定标志物进行筛选(如G418抗性) 2.1.9 转录激活transactivation;TA 响应特定化学信号如雌激素与雌激素受体结合信号)的信使核糖核酸合成 2.1.10 弱阳性对照weakpositivecontrol 对照品中阳性反应较弱的化学品,用于确保试验的准确性 2.1.11 vehicleeontrol;VC 溶剂对照 溶剂单独作为对照 2.1.12 验收标准 accceptability "criteria 符合试验控制和参考标准的最低标准 2.1.13 准确性aeuraey 试验结果与公认参考值的接近程度,衡量试验方法的效能和相关性 2.1.14 熟练度profieieney 检测未知化学品前能正确使用试验方法的能力 2.1.15 参考标准referencestandard 用于证明试验方法合适的对照品 2.2缩略语 本标准所用缩略语见表1 表1缩略语 缩略语 中文全称 英文全称 STTA 稳定转染转录激活试验 StablyTransfeetedTransaetivationassay E2 178雌二醇醉 173-estradiol ER 雌激素受体 EstrogenReceptor RelativeLightUnits RLU 相对光单位 HeLa -种永生的人宫颈细胞系 Animmortalhumancervicalcellline -种能内源性表达雌激素受体Animmortalizedadenocarcinomacellthatendogenouslyexpress BG1 永生腺癌细胞 estrogenreceptor DMSO 二甲基亚碱 Dimethylsulfoxide hERa 人雌激素受体a Humanestrogenreceptoralpha
GB/35519一2017 表1(续 缩略语 中文全称 英文全称 hER8 人雕激素受体8 Humanestrogenreceptorbeta 类 洛斯维帕克研究所研发的 Roswellparkmemorialinstitute1640 RPM1640 培养基,培养基代号1640 DA 脱氧核糖核酸 deoXyribonucleicacid 试验原理 3.1基于效能的试验指导原则中试验方法原理 3.1.1雕激素与受体的相互作用调控基因转录,诱导和阻滞细胞的复制,影响细胞增殖,胎儿发育和生 殖功能 干扰正常的雌激素系统会对机体的生殖发育产生不良影响 3.1.2化学品与特异受体直接或间接作用调节报告基因的转录 转录激活试验广泛用于评估受特定 核受体(如雌激素受体)调控的特定基因表达,用于受雌激素受体调控的雌激素转录激活的检测 雌激 rogenReceptor,ER)至少存在两种亚型,即a和8亚型,由完全不同的基因编码,具有不同 素受体(Estro 只是对经典的雌微素反应进行调节,目前正在 的组织分布、配体相对结合力和生物学功能 受体ERa 研发的模型主要是测定与ERa 试验原理是化学品与配体结合后激活ER,然后受体 配体复合物结合到脱氧核糖核酸(deoxyribonuceicacid,DNA)反应元件,转录激活报告基因,使细胞中 标志蛋白表达增加 有两种不同的报告反应;在荧光素酶系统里荧光素酶使荧光素底物转变成生物荧 光产物,用光度计定量检测;利用荧光蛋白和L.ac基因,Lacz基因能编码8半乳糖,将无色底物X-gal 5-溴-4-氯-3-刚噪-D半乳糖苷)转化成蓝色产物,用光度计检测 3.2试验的使用范围和局限性 3.2.1本方法是体外检测化学品结合ERs引发的转录激活活性,因此试验结果不能直接推演到体内有 复杂信号和调控机制的正常内分泌系统 3.2.2雌激素受体介导的转录激活是内分泌紊乱的主要机制之一,还有一些其他的内分泌干扰机制 包括 与内分泌系统中其他受体和酶作用; 激素合成 激素的代谢激活和/或失活; -靶组织激素的分布; 机体中激素的清除 3.2.3本方法描述了化学品激活(如激动剂)而不是抑制如拮抗剂)ER依赖的转录能力 因此,试验 结果为阴性的化学品应在进行了ER结合试验或在检测ER拮抗剂的试验之后,才能得出化学品不能 结合ER的结论 试验方法与步骤 4.1方法 本方法是一种适用于由一个或多个雌激素反应元件调控的使用稳定转染/内源性ERa受体和稳定
GB/T35519一2017 转染报告基因的方法,但是也适用于其他的雌激素受体如ER8 4.2对照 应确定参照雌激素和对照物 合适的对照(阴性、溶剂和阳性对照),确认试验是否在同等的试验条 件下进行 4.3质量控制规程 标准质量控制规程应能确保细胞系稳定传代,无支原体污染及对雌激素反应良好 细胞系应保证 其良好的特性和不受污染(如真菌、酵母菌核病毒) 4.4实验室操作熟练程度验证 按照本方法检测未知化学品前,每个实验室应能熟练地检测已知的标准品,以确保试验系统良好 4.5验收标准的测试运行 所有的验收标准应确保试验的有效性 测试的接受与否取决于每个试验的参照雌激素和对照品的 检测结果 参照雌激素的PC或EC应符合选择的试验的验收标准(稳定转染激活试验见附录A BG1Lue雌激素受体转录激活试验见附录B),以及所有的阳性和阴性对照在试验中应有正确的分类 多个实验室参照雌激素曲线拟合参数平均值的标准差或变异系数可以用于验证实验室间的重复性 还 应符合以下验收标准 应有足够的数据以定量评估ER激活作用(效果和效力); 参照雌激素的参考浓度的平均反应活度不能小于测试方法中溶剂对照的最小特异倍数(对于 稳定转染激活试验和BG1Lue雌激素受体转录激活试验,最小特异倍数为4),以保证试验的 敏感性; 化学品浓度应在可溶性范围且不能产生细胞毒性 注1:PC，即所引起的响应水平等于同板的阳性对照物(1nmol/I17-雕二醇)诱导的响应水平.r%的受试物浓度 注2;EC即激动剂引起基线(底部)和最大响应(顶部)之间一半时的浓度 5 数据和报告 5.1数据分析 试验系统的使用应符合验收标准,但是即便符合验收标准 试验数据可用于阳性和阴性反应分类 也不能确保试验得到正确的数据 重复试验才是保证数据可靠性的最好方法,如果试验数据一致(如两 次试验都判断化学品为阳性),不用重复第三次 如两次试验结果不一致(如一次判断为阳性，一次为阴 性),或者需更大的把握,则应重复第三次 5.2数据分析标准 本试验方法的结果还没有统一的分析方法,但是ER激活能力的定性(如阳性/阴性)或定量如 E(C和PC)分析应在科学的数据分析方法下进行,在条件允许的情况下,阳性结果应同时依据反应强 度(与溶剂对照和参照雌激素比)和反应浓度(如EC,PC,受试物诱导的最大反应水平等)判断 5.3试验报告 试验报告应包括下列信息 受试物 a
GB/35519一2017 -鉴定资料和CAs号(如已知); 物理性质和纯度; 与试验实施有关的理化性质 受试物的稳定性 b 溶剂,赋形剂: -信息描述(特征、供应商及批号); 选择依据; -受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性(如已知. 细胞 -细胞种类和来源(是否表达ER或转染哪种受体); 分子,包括来源; -选择能保证稳定转染的方法(适用) -转染方法与稳定的细胞系是否相关 细胞代数(从复苏开始) 细胞复苏时的传代数; 细胞维持方法 d试验条件 溶解性; 评估活性的方法; 培养基成分和二氧化碳浓度; 受试物浓度 添加的溶媒及受试物体积 培养温度和湿度; 细胞染毒持续时间 细胞开始时和处理期间的密度 阳性和阴性对照物; 报告试剂(产品名称、供应商和批号); 判断试验结果是阴性、阳性或双向的标准 验收检查 每个测试板的诱导效果和根据历史对照判断是否达到试验方法的最低要求 阳性对照和参考化学品的lgECm,lgPC和Hil斜率值 fD 结果 原始数据和标准化处理后的数据; 最大诱导水平; 细胞毒性数据; 最低有效浓度(如有); 受试物诱导的最大反应水平,诱导最大反应水平的受试物浓度,PC和/或PC值(如适 用); -剂量-反应关系(如有); -统计分析,包括误差和可信度(如标准差、变异系数或95%置信区间及如何获取这些数 值的描述(如有. 结果讨论 8 h)结论
GB/T35519一2017 附录 A 规范性附录 用稳定转染人ERa的hERa-IHeLa9903细胞系检测化学品雌激素活性的转录激活试验 范围 A.1 本附录规定了用hERa-Hela-9903细胞株对由人雌激素受体a介导的雌激素活性物质进行检测的 试验方法 本附录适用于评估一种化学品是否具有作为ERa配体并激活雌激素介导反应的能力 试验原理 A.2.1本试验用于检测雌激素受体和配体结合后对转录活性的影响,与配体结合后,受体配体复合物 发生转移到细胞核与雌激素反应元件特异性结合,并转录激活荧光素酶报告基因,引起细胞内荧光素酶 表达增加 荧光素是一种酶作用底物,经与荧光素酶作用,可发出荧光,利用光度计能够对这种产物进 行定量测定 A.2.2本附录试验体系是hERa-HeL.a-9903细胞株,它来自于人子宫颈肿瘤细胞,具有两个稳定的插 人序列:hER表达序列(编码全长人雌激素受体)和荧光素酶报告基因序列,该序列带有鼠乳房肿瘤病 毒启动子引导的雌激素反应元件 已证明鼠乳房肿瘤病毒启动子起始基因表达效果最好,因此该试验 体系hERa-lHla9903可以测定受试物对ER转录活性的影响 解释本试验数据的依据是;受试物所诱发的效应是青等同或超过最大浓度In A.2.3 nmol/L)阳性对照 物17-雌二醇(E2)诱导效应的10% A.3试验方法与程序 A.3.1准备 A.3.1.1细胞 试验应使用外源转染稳定表达ER的hERa-HeLa-9903细胞株 细胞株均不得携带支原体 为了监测细胞株的稳定性,试验应使用17雌二醇,17a-雌二醇,17a-甲基睾激素和肾上腺酮作为 对照品,并在试验中至少测定一次该物质的剂量-反应曲线,见表A.1,测定结果应与表A.1中提供的结 果一致 表A.1稳定转染激活试验4种对照品可接受范围值(均数士2×标准差 测试范围 名称 L.ogPC50 L.ogPC10 L.ogEC50 Hil斜率 mol/L 74雌二醉(E2) -11.4一10.1 10.1 0.71.5 10-I10- 1l 1l,3 CAS;50-28-2 二醇 17a- -10.7-9.3 0.9~2.0 10-10- 9.6 -8.l -9.6" 8.4 CAS;57-91-O0
GB/35519一2017 表A.1(续》 测试范围 名称 L.ogPC50 L.ogPC10 l.ogEC50 Hil斜率 mol/L 肾上腺M 10-1010 CAS:50-22-6 7a-甲基睾丸激素 -6.0一5,1 -8.0~ 6,2 10-1l10-" CAS:58-18-4 A.3.1.2培养液和培养条件 培养基:无酚红的Eagle's基本培养基(Eagle'、MinimumEssentialMedium,EMEM)6Omg/L 的抗菌素卡那霉素十右旋糖苷包裹的木炭处理的胎牛血清dextran-coatedeharcoaltreatedfetal bovineserum,DCC-FBS);培养条件:5%二氧化碳(CO.),37C士1条件培养 A.3.1.3细胞培养 A.3.1.3.1当细胞汇合度达到75%~90%时,进行细胞传代,一般在100mm细胞培养中加10mL 细胞液,密度为0.4×10'~1×10细胞/mL 用含10%FBS-EMEM或加有DCCFBS的EMEM)悬浮 细胞.然后移人96孔细胞培养板中,每孔细胞密度为1×10细胞/100AL 孵育3h后细胞染毒 其 中试验所用塑料器皿不能有雌激素活性物质污染;细胞应至少传代1次,但不超过40次,hERa-HeLa 9903细胞株使用不应超过3个月 A.3.1.3.2DCC-FBS按本方法配置或直接购买,用右旋糖苷包裹木炭(dextran-coatedcharcoal,DCC 处理血清是清除血清含细胞培养液)中雌激素化合物的常用方法,其目的是为了排除与血清残留雌激 素有关的响应偏差 500ml的胎牛血清可以用这种方法进行处理 材料包括活性炭、右旋糖苷、氯化 镁六水合物、蔗糖、1mol/L 4-羚乙基哌嗓乙碱酸缓冲溶液(pH7.4),超纯水 设备和材料包括经高压 灭菌的玻璃容器、离心机温度可设定在4C) 具体方法为第1天配制右旋糖苷包裹的木炭悬浮液,将 含有15mnmol/IMgCl,0.25mol/I蔗糖,2.5g木炭,0.25g右旋糖苷和5mmol/L 4-羚乙基哌嗓乙瞒 酸缓冲溶液的1L超纯水在4C搅拌、过夜 第2天将配制好的悬浮液分置于多个50mL离心管中,以 10000r/min4离心10min 弃去上清液.将一半的木炭沉积物于4C储存以便第3天使用 将另 -半木炭用胎牛血清悬浮(为避免沉淀,使用胎牛血清前应对其进行缓慢溶解),在56进行加热去活 处理,时间30min,然后将其转人经高压灭菌的玻璃容器中 在4C下轻轻搅拌该悬浮液,过夜 第3 天将胎牛血清悬浮的悬浮液分置于多个离心管中,以10000r/min 1在4C离心10min,收集胎牛血清 并将其转人到第2天制备储存的新木炭的沉积物中 在4C下用经高压灭菌的玻璃容器悬浮木炭沉积 物并轻轻搅动悬浮液,过夜 第4天以10000r/min在4C将悬浮液离心10nmin,用0.24m灭菌滤膜 过滤上清液 这种DCC处理的胎牛血清应保存在一20C,在此储存条件下可使用一年 A.3.1.4受试物准备 受试物应溶于DMso或其他合适的溶剂中,并用同种溶剂按110进行梯度稀释 A.3.2试验条件 A.3.2.1溶剂 用DMso(用量不应超过0.1%)或适当溶剂(水、纯度95%100%的乙醉)作平行溶剂对照,其使
GB/T35519一2017 用浓度在阳性,阴性对照和受试物中应一致 A.3.2.2对照 A.3.2.2.1阳性和阴性对照品;试验前应对试验体系的反应性进行验证,用适当浓度的强雌激素(E22)、 弱雕激素(17Q-雕二醉,非常弱的雕激素(17a-甲基睾丸激素)和阴性化学品(肾上腺酮)进行验证 表 A.l中已列出验证试验的可接受范围值 每项试验中都应同时包括这4种对照品，且这4种物质的试 验结果应在可接受范围值之内见表A.1) A.3.2.2.2阳性和溶剂对照:在每个培养板中应至少检测3组阳性对照(1nmol!/L的E2)和溶剂对照 VvC) 若阳性对照所用溶剂不同于受试物所用溶剂时,则需另设对照 A.3.2.2.3诱导率;每个培养板中阳性对照组(1nmol/儿E2)荧光素酶反应均值应为溶剂对照组的4倍 以上,PC测量值达到同时测定的溶剂对照值的(12×标准差)倍以上,这是试验的质量控制标准 要求 A.3.2.3染毒浓度 A.3.2.3.1在开展正式试验前应进行预试验,摸清试验剂量范围,弄清楚受试物是否存在溶解性和细胞 毒性问题 受试物从低浓度到最大浓度(可用aL/mL、mg/mL和mmol/L表示)进行预试验 根据受 试物对细胞产生的毒性作用程度和受试物游解度,从最大允许浓度开始,逐级稀释(如1 nmmol/L、 00mol/儿L、10Amol/儿L等)对受试物进行首轮确证性测定,并对产生的现象如浑浊、沉淀或细胞毒性 等进行记录 基于试验结果再进行第二轮甚至第三轮的测定,并调整试验浓度避免出现沉聚物或产生 过大的细胞毒性,已获得良好的剂量-反应曲线 A.3.2.3.2对于ER激动剂来讲,细胞毒性会改变特有的s形反应曲线,可以利用细胞毒性测定试验来 提供细胞存活力的信息,若某浓度的细胞毒性大于或等于20%,可认为具有细胞毒性,在试验中应避免 使用该浓度及以上浓度进行试验 A.3.3试验操作方法 A.3.3.1受试物处理 A.3.3.1.1可以按照以下步骤对化学品进行稀释和染毒;根据预试验结果,将不同浓度的受试物加人培 养板的每孔中例如1mmol/儿L、1004mol/L、10mol/L、1umol/儿L、100nmol/L、10nnmol/儿 nmol/L、100pmol/L和10pmol/L),每个浓度3次平行试验 用溶剂将1.5L受试物稀释至 500 L,从中取出50pL稀释液加人到每孔含有10'细胞/100ML的培养板 每孔最终体积为150L 添加受试物后,孵育2oh24h,诱导荧光素酶表达 A.3.3.1.2在不同工作日用相同化学品进行重复性验证试验以确保独立性 对于强挥发性化学品,推荐使用细胞培养板密封盖,避免临近的对照孔产生假阳性结果;同 A.3.3.1.3 时为避免边缘效应可适当调整培养板的试验布局(如不用边缘孔 A.3.3.1.4每次操作应设对照组(E2,17-雌二醇、17a-甲基睾丸激素和肾上腺酮)进行检测(表A.2) 受试物及对照品的排列情况见表A.3
GB/35519一2017 表A.2试验培养板中对照品浓度安排 17a-甲基睾丸激素 肾上腺剩 17a-雌二醉 E2 列 浓度 14mol/L 10nmol/I 100Amol/I 10Mmol/L) 浓度2 0mol/L 100nmol/I 1nmol门I lmol/L 浓度3 1Amol/I 10nmol/1 100pmol/1. 100nmol/L 浓度4 100nmol/L lnmol/I 10pmol/I 10nmol/I 浓度5 0nmol/I 100pmol/I 1pmol/I 1nmol/L 浓度6 nmol/1 0pmol/几 0.1pmol/L (100pmol/L) 浓度7 00pmol/L lpmol/I 0.01pmol/I 10pmol/I) 阳性对照 溶剂对照 DMS(O nmol/LE2 表A.3试验培养板中受试物测试浓度及试验对照安排示例 受试物1 受试物3 受试物4 受试物2 列 l0 浓度1 mmol/L lmol/L 10nmol/L 10Mmol/L) 浓度2 100丝mol/1 00nmol/1 1nmol/I lMmol/I 浓度3 10mol/I 10nmol/1 100pmol/L 100nmol/L 浓度4 1nmol/1 nnmol/L 10pmol/L 10nmol/L 浓度5 100nmol/ 100pnmol/1 lpmol/L 1nmol/L 浓度6 10nmol/I 10pnmol/1 0.1pmol/L 100pmol/L 浓度7 nmol/I lpmol/L 0.01pmol/ 10pmol/I 溶剂对照 阳性对照 1 DMS(O nmol/IE2
GB/T35519一2017 A.3.3.2荧光素酶试验 可根据所用光度计的灵敏度选择相应的荧光素酶试剂 如果使用标准化荧光素酶检测体系,则在 添加试验底物前需使用细胞裂解液裂解细胞 资料和报告 A.4 A.4.1数据处理 为获得阳性对照(1nmol/几E2)的相对转录活性,按以下步骤分析来自同一块板的荧光信号(用其 他效果等同的数学方法也可以)计算溶剂对照的均值 用每孔测定数值减去溶剂对照均值,将数据标 准化 计算标准化处理过的阳性对照均值 将每孔测得的标准化处理数值除以标准化处理阳性对照的 均值阳性对照-100%) 每孔得到的最后数值是与阳性对照响应值比较的相对转录活性 计算受试 物每个浓度组的相对转录活性均值 目前存在两种形式的结果表示;平均转录活性(响应值)和产生响 应值的浓度 A.4.2结果的评价和解释 A.4.2.1Cn、PC和PCi0 A.4.2.1.1在计算EC时应有完整的剂量-反应曲线,但由于试验浓度的局限性(如由于细胞毒性或溶 解性问题),该曲线并不总能得到 但是,EC和最大诱导水平(相当于Hil方程的最大值)可以提供很 多试验信息因此应尽可能将这些试验参数在报告中体现出来 在计算EC和最大诱导水平时,应使 用合适的统计软件如GraphpadPrism统计软件) 如果用Hill、逻辑方程处理浓度反应数据时 Hills逻辑方程的底部定为零,使用式(A.1)计算EC (A.1 Y=儿十 XXH 式中 反应值,以“s”形曲线由底部开始延伸至顶部， 最小反应值; 最大反应值; lgECa最大和最小反应中间值的对数 浓度的对数值; x Hi -曲线的斜率 A.4.2.1.2每个受试物应计算以下信息RPC,是受试物诱导产生的最大反应值,以1nmol/LE2诱导 产生的反应百分率表示;应获得阳性对照诱导产生PCo的浓度以及PC的浓度(如有) A.4.2.1.3通过X-Y坐标上的两点数值可以推算出PC 值;这两点分别紧靠PC值,分别高于和低于 PC，值,坐标值分别为(a,b)和(c,d),PC，值用式(A.2)进行计算; A.2 og[PC,]=log[e]+(r一d/d一b 重复试验,试验结果应满足以下要求 操作标准要求; 阳性对照(1nmol/LE2)荧光素酶反应活性均值应大于或等于4倍同板溶剂对照均值; PC测量值达到同时测定的溶剂对照值的(l+2×标准差)倍以上 4个对照品的试验结果应在可接受范围内(表A.1. 有可重现性 10
GB/35519一2017 A.4.2.2数据阐释标准 A.4.2.2.1阳性结果的判断由效应强度和效应浓度来决定 以是否达到50%PC)或10%PC)的 浓度作为判断标准 如果在两次检测中两次或三次检测中两次所获得的受试物诱导产生的最大反应值 大于或等于阳性对照相应值10%,可判定结果为阳性 如果在两次检测中两次或三次检测中两次所获 得的受试物诱导产生的最大反应值小于阳性对照相应值10%,可判定结果为阴性 A.4.2.2.2计算PC,PC和P(C 试验应至少获得两个PCm或PC值 用于计算PC的3份平行 原始数据的变异系数值如荧光强度数据)不应超过20% A.4.2.2.3如果想通过本试验原则获得更多的有关阳性测试化学品除了筛选和优选以外的信息,特别 是化学品的PCw-PCo以及那些导致荧光素酶过度激发的可疑化学品时,应清楚试验所观察到的荧光素 酶活性只是使用ERa拮抗剂所产生的ERa-特有的反应 A.4.2.2.4可以用评估非受体介导的发光信号来评价假阳性 非ER介导的荧光素酶基因表达或非特 异荧光的产生都可产生假阳性 在剂量-反应曲线不完整或不正常的时候会产生这种情况 如果怀疑 有这种情况产生时,应检测ER拈抗剂如4-羚基三苯氧胺无毒的浓度)的作用效果 纯拮抗剂ICI1 128780可能不太适用于这方面的检测,因为在一定浓度下它会减少溶剂对照值,从而影响试验数据的 分析 为确保该方法的有效性,在同一块板中应进行以下测试;未知化合物在10Mmol/L的4-胫基三 苯氧胺存在及不存在情况下的ER转录活性检测;溶剂对照(3个平行);4-胫基三苯氧胺(3个平行 lnmol/L的E2(3个平行)作为阳性对照;lnmol/L的E2十4羚基三苯氧胺(3个平行) 板中所有孔 都应保证相同的溶剂浓度 如果未知化学品产生的诱导活性不受ER拮抗剂的影响,则试验结果归为 “阴性”;如果未知化学品产生的激活活性被完全抑制时,用判定标准进行认定;若低剂量产生的激活活 性等同于或超过PC响应时,未知化学品被抑制的程度等于或超过PCna反应,未经ER拮抗剂处理和 经ER拮抗剂处理的孔之间响应的差异可以被计算出来,且这种差异可被认为是真实响应,应用于对具 体参数的计算以便对化合物归类做出判定 最后进行数据分析,检查相同条件相同处理孔间的变异值 计算溶剂对照均值;没有添加4胫基三苯氧胺的每孔值减去溶剂对照均值;计算4-羚基三苯氧胺均值 添加4-羚基三苯氧胺的每孔值减去溶剂对照均值;计算阳性对照均值;计算与阳性对照相关的所有孔 的相对转录活性 11
GB/T35519一2017 录 附 B 规范性附录) 鉴定雌激素受体激动剂的BG1Luc雌激素受体转录激活试验方法 B.1范围 本附录规定了以BG1Lue4E22细胞系为试验体系的雌激素受体转录激活的试验方法 本附录适用于多种化学品是否具有雌激素受体转录激活能力的筛选 B.2试验原理 B.2.1本标准用化学发光法检测hERa和hER介导的转录激活 化学发光具有高信倍比的优点,在 生物试验中应用广泛,然而,化学品可能会导致试验中荧光素酶出现蛋白稳定化,造成发光抑制或增强 此外,在一些基于荧光素酶的ER报告基因试验中,当植物雌激素浓度大于1Amol/L,荧光素酶报告基 因会过度激活而产生非受体介导的基因表达 由于剂量-反应曲线提示该报告基因系统只在低浓度时 激活,在稳定转染的ER试验中植物雌激素或相似化学品浓度较高时,应特别注意其是否会产生荧光素 酶报告基因的过度激活 B.2.2雌激素受体和配体的结合后,受体配体复合物转移到细胞核与雌激素反应元件特异性结合,并 激活报告基因(ue),生成荧光素酶,在加人底物后产生荧光可用光度计检测 BG1Luc雌激素受体转录 激活试验用BGlLuc4E22细胞系来检测化学品体外雌激素激活能力 BG1Luc4E2细胞系来源于BG-1 永生的人源性腺癌细胞,可以表达雌激素受体a和3,而且稳定转染了质粒pGudLuc7.ERE 这种质粒 包含三个主要元件,包括小鼠乳房肿瘤病毒启动子、上游雌激素反应元件和荧光素酶基因 BG-1稳定 转染了lue报告基因,由小鼠乳房肿瘤病毒启动子上游的4个雌激素反应元件调控,小鼠乳房肿瘤病毒 启动子与其他激素只有较小的交叉反应性 B.2.3在结果的判断中,阳性反应是指剂量-反应曲线至少包含了3个不重叠的误差棒(平均值土标准 差),或者是波幅(标准化的RLU)改变至少是对照化学品(17雌二醉)最大值的20% B.3试验方法与程序 B.3.1准备 B.3.1.1细胞 细胞株是稳定转染的BGlLuc4E2细胞系,为保证细胞系的稳定性和完整性，细胞复苏后至少在细 胞维持液中培养一代,细胞传代不能超过30次,BGlLuc4E2细胞系生长30代大约需要3个月 B.3.1.2培养液和培养条件 培养基;RPMI1640培养基十0.9%青霉素一链霉素十80%胎牛血清;培养条件;37士1,湿 度90%士5%,5.0%士1%CO条件下培养 B.3.1.3细胞培养 细胞汇合度达到80%时传代,在无雌激素环境中孵育48h后植人96孔板,以检测化学品的雌激素 12
GB/35519一2017 诱导作用 无酚红的DMEM(Dulbecco'sModifieationofEagle'sMedium)培养基(不含有雌激素),添 加4.5%活性炭/葡聚糖处理过的胎牛血清、1.9%L-谷氨酰胺和0.9%青霉素-链霉素,所有的塑料器具 需无雌激素活性物质污染 B.3.1.4受试物准备 受试物用100%DMSO或其他合适溶剂)溶解,然后在无雌激素培养基中逐级稀释到合适的浓度 试验前,受试物溶解和稀释前室温平衡,受试物溶液现配现用且无沉淀和浑浊 参考标准化学品和对照 可一次多配一些,但对照的稀释和受试物溶液应在试验前现配现用且在24h内用完 B.3.2试验条件 B.3.2.1溶剂 水、乙醇(纯度95%100%)和DMSO是比较合适的溶剂 若使用DMSO,其用量不应超过0.1% 体积分数) 参考标准化学品和对照应100%溶解于溶剂,然后在无雌激索培养基中稀释到合适的 浓度 B.3.2.2染毒浓度 剂量范围试验包括7个按1:10梯度稀释的浓度,每个浓度检测两次 受试物先取最大浓度 lnmg/nmlL(约1mmol/L)进行检测,剂量范围试验可决定以下指标;综合试验中受试物起始检测浓度以 及受试物的稀释比例(1:2或1:5) 在试验方案、剂量范围试验和综合试验中对细胞活性/毒性评估 细胞毒性测试是一种分级定性目测观察试验,可以用来评估BGlLuc雌激素受体转录激活试验中的受 试物对细胞生存率的影响,也可以用定量测试方法 受试物浓度不能使细胞存活率降低高于20% B.3.2.3对照 B.3.2.3.1 溶洲对照;试验应设溶剂对照,GlLe雕敬索受体转录散活验证试验的游剂是1%体积 分数)DMsO,如果用其他溶剂,所有的参考标准化学品、对照和受试物应使用相同的溶剂 B.3.2.3.2参考方法如下 剂量范围试验:参考标准化学品是2,剂量范围试验的参考标准化学品包括连续稀释的4个浓 度的E2(1.84×10-”mol/儿L、4.59×10-'mol/L、l.15×10-'mol/儿和2.87×10-”mol/L),每个 剂量测量2次 综合试验;参考标准化学品是E2,浓度包括1:2倍稀释的11个浓度(3.67×10-”nmol/L~ 3.59×I0mol/I).每个剂量测量2次 B.3.23.3弱阳性对照;弱阳性对照是9.06X10"molL用无雕微索培养基培养的p,p-甲氧叙 B.3.2.3.4 诱导率,通过以DMsoRLU平均值为参照的最商2的RLU平均值来评估,结果应大于 4倍平均DMS0的RLU值 B.3.2.3.5验收标准如下 剂量范围试验:诱导反应值应通过以DMsORIU平均值为参考的最高E2的RIU平均值， 般能达到5倍平均DMsO的RLU值,但是大于或等于4倍就可以接受;DMsO对照结果:溶 剂对照RU值应在历史溶剂对照平均RIU值的2.5倍标准差范围内;如果标准不能都符合 则应重做 -综合试验;应同时满足剂量范围试验验收标准和以下标准,E2的剂量-反应曲线应是S形,至 少有3个值在线性剂量-反应曲线以内;甲氧氯对照RLU值应大于DMsO平均值加3倍标准 差;如果标准不能都符合则需重做 13
GB/T35519一2017 B.3.3试验操作方法 B.3.3.1受试物处理 B.3.3.1.1细胞计数并铺于96孔板(2×105细胞)中,孵育24h,细胞贴壁后,移除培养基加人添加受 试物和对照化学品的无雌激素培养基,孵育19h24h B.3.3.1.2高挥发性的化学品应特别注意,因为它可能会污染对照组出现假阳性反应，因此,试验中推 荐使用密封板以有效地隔离每一个板孔 B.3.3.1.3同一个化学品综合试验的重复应在不同天进行,至少重复两次 如两次试验结果相悖(如 次试验结果阳性,另次阴性)或其中一次试验不理想,则应补做第三次试验 B.3.3.1.4剂量范围试验;用96孔板可检测6种受试物,每种7个浓度,按1:10梯度稀释,每个浓度2 个孔(见表B.1) 用4个浓度的E2作为参考标准化学品每个浓度2个孔.另加4个孔的DMsO溶剂 对照 推荐每孔体积200AL,每孔细胞存活率不能小于80% 表B.1剂量范围试验96孔板布局 nm 12 10 孔列 A TS1-1 TS1-1 TS2-1 TS2-1 TS3-1 TS3-1 TS4-1 TS4-1 TS5-1 TS5-1 TS6-1 TS6-1 TS1-2 TS1-2 TS2-2 TS2-2 TS3-2 TS3-2 TS4-2 TS4-2 TS5-2 TS5-2 TS6-2 TS6-2 TS1-3 TS1-3 TS2-3 TS2-3 TS3-3 TS3-3 TS4-3 TS4-3 TS5-3 TS5-3 TS6-3 TS6-3 TS1-4 TS1-4 TS2-4 TS2-4 TS3-4 TS3-4 TS4-4 TS4-4 TS5-4 TS5-4 TS6-4 TS6-4 TS1-5 TS1-5 TS2-5 TS2-5 TS3-5 TS3-5 TS4-5 TS4-5 TS5-5 TS5-5 TS6-5 TS6-5 Ts1-6 Ts1-6 TS2-6 TS2-6 TS3-6 TS3-6 Ts4-6 Ts4-6 TS5-6 Ts5-6Ts6-6 TS6-6 F TS1-7 TS1-7 TS2-7 TS2-7 TS3-7 TS3-7 TS4-7 TS4-7 TS5-7 TS5-7 TS6-7 TS6-7 H E2-1 E2-2 E2-3 E2-4 VC VC VC VC E2-1 E2-2 E2-3 E2-4 注:E2-1一E2-4为2的浓度(从高到低);TS1-1一TS1-7为受试物1的浓度(从高到低);TS2-1T2-7为受试物 2的浓度(从高到低);TS3-1TS3-7为受试物3的浓度(从高到低);TS4-1TS4-7为受试物4的浓度(从高到 低);TS5-1一Ts5-7为受试物5的浓度(从高到低);Ts6-1~Ts6-7为受试物6的浓度(从高到低);vc为溶剂 对照 B.3.3.1.5综合试验的起始浓度的选择应需遵循以下标准 -如果受试物剂量-反应曲线在DMsO对照值平均值加3倍标准差以下,综合试验可以从最大 溶解浓度开始1:2逐级稀释到11个不同浓度; -如果受试物剂量-反应曲线中有大干DMsO对照值平均值加3倍标准差的点,综合试验的起 始浓度应比剂量范围中最高校正RLU值高1个对数值 11个浓度可根据以下标准选择按 1:2或1;5稀释;如果按1:2稀释浓度范围可以覆盖剂量范围试验中剂量-反应曲线中的所 有浓度则选择1;2稀释,否则用15稀释; -如果化学品在剂量范围试验中呈现双相性的剂量-反应曲线,综合试验中两个时相都应考虑 B.3.3.1.6综合试验包含11个稀释浓度,每个浓度3个孔,用11个浓度的E2(表B.2),每个浓度2 个孔为参考标准化学品,另外加4个孔的DMsO对照和4个孔的p，p'-甲氧氯(9.06×10-mol/L) 对照 14
GB/35519一2017 表B.2综合试验96孔板布局 孔列 10 12 v TS TS1-7 TS1-8 TS1-9 TSl-l0 TS1-ll TS1-l -2 TSl-3 TSl-4 TSl-5 TS1-6 TS1-1 TS1-2 TS1-3 TS1-4 TS1-5 TS1-6 TS1-7 TS1-8 TS1-9 TS1-1oTS1-1l V Ts1-8 TS1-1 TSl-2 TS1-3 TSl-4 TS1-5 TS1-6 TS1-7 TSl-9 TS1-1oTS1-11l VC TS2- TS2-2TS2-3TS2-4TS2-5TS2-6T2-7TS2-8 TS2-9TS2-1oTS2-11 V TS2-1 TS2-2 TS2-3 TS2-4 TS2-5 TS2-6 TS2-7 TS2-8 TS2-9 TS2-10TS2-l1 Meth TS2-1 TS2-2 TS2-3 TS2-4 TS2-5 TS2-6 TS2-7 TS2-8 TS2-9 TS2-10TS2-l1 Meth E2-1 E2-2 E2-3 E2-4 E2-5 E2-6 E2-7 E2-8 E2-9 E2-10 E2-l1 Meth H E2-3 E2-6 E2-8 E22-9 E2-1o E2-1 E25 2-？7 必 E2-2 E2-4 -11 Meth 注;2-1一E2-11为2的浓度(从高到低);Ts1-1~Ts1l-1l1为受试物1的浓度(从高到低);Ts2-1Ts2-11为受试 物卫的浓度(从高到低),vC为溶剂对照;Meh为p ，p'-甲氧氧对照 B.3.3.2荧光素酶试验 光度计检测的发光范围是300nm一650nm,用软件控制加样体积和测试间隔,每孔的光发射强度 用RLU表示 B.4数据和报告 B.4.1数据处理 B.4.1.1EC值(受试物最大有效浓度的一半 可从剂量-反应曲线算出,如果受试物有1个或多个浓度阳性,化学品的EC可以用Hl函数或其 他合适方法计算 Hil丽数是4个参数的逻辑数学模型,反应化学品的剂量-反应关系(典型的s型曲 线),用式(A.1)计算 此模型可以计算出最大、最小反应值、Hl斜率和EC的最佳拟合值.在计算 EC时,应使用合适的统计软件(如GraphpadPrism”统计软件) B.4.1.2异常值的处理 好的统计分析应易于从Q检验或其他的检验方法的数据分析中发现和排除不可用的点;参考标准 化学品的重复检测(2次)中,任一浓度的校正RLU值如果超出历史数据的20%,则为异常 B.4.1.3剂量范围试验中光度值的采集和校正 光度值的原始数据应确定是否有异常数据要排除 应计算以下数据;计算DMsO溶剂对照的平均 值;用每孔测定数值减去DMSO溶剂对照均值进行数据标准化;计算参考标准化学品E2的平均值;计 算受试物平均EC值 B.4.1.4综合试验中光度值的采集和校正 光度值的原始数据应确定是否有异常数据要排除 应计算以下数据:计算DMsO溶剂对照的平均 值;用每孔测定数值减去DMSO溶剂对照均值进行数据标准化;计算参考标准化学品(E2)平均值;计 算受试物和E2的平均EC值:计算甲氧氧平均校正相当光单位值
GB/T3551g一2017 B.4.2结果的评价和解释 BGlLuc雌激素受体转录激活试验是筛选内分泌干扰化学品体内试验证据权证法的一部分,试验 的其中一个内容就是判断化学品对雌激素受体是激活还是抑制 表B.3中显示了BGlluc雌激素受体 转录激活验证试验的阳性和阴性判断标准 EC可以用含有4个参数的逻辑数学模型Hil函数计算 符合验证标准可提示系统运行正常,但不能保证每一步操作都能产生正确的结果 只有重复试验才是 产生正确结果的保证 表B.3阳性和阴性标准 剂量-反应曲线特点;初始基线后呈现坡度上升,最后平稳或达到顶峰 在某些情况下可能只有两部分(基 线-斜坡或基线-峰值) 斜率特点至少3个不重叠的误差棒(平均值士标准差),基线点除外,线性部分应包括峰值和平稳期第 个点 阳性 反应帮度:基线和蜂值差,至少是对照化学品2最大值的20%(如,E2最大反应值为10000RLU时,差 值至少达到2000). 如果可能,应计算C值 阴性 受试物某一浓度的平均校正RLU不大于平均DMSO溶剂对照的RLU值加3倍标准差 可疑 由于定性定量局限性考虑不充分,无法确定受试物是阳性还是阴性

化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验——雌激素激动活性法GB/T35519-2017

一、引言

化学品对人类健康和环境的影响是一个备受关注的话题。为了评估化学品对人体内分泌系统的影响，需要进行一系列生物学实验。其中，化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验是一种常用的方法。本文将介绍这种试验的基本原理和操作流程。

二、试验原理

化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验采用了雌激素激动活性法。该方法基于雌激素受体与雌激素结合后对基因转录的调节作用，从而实现对化学品的评估。

具体流程如下：

• 1.构建稳定转染人雌激素受体表达细胞株；
• 2.将待测化学品加入培养基中，处理相应时间；
• 3.向含有待测化学品的培养基中加入荧光素酶底物，并进行孵育；
• 4.使用荧光素酶检测试剂盒检测细胞内荧光素酶活性；
• 5.通过荧光素酶活性的变化，评估待测化学品对雌激素受体转录活性的影响。

三、试验操作

在进行化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验时，需要注意以下几点操作要点：

• 1.构建稳定转染人雌激素受体表达细胞株时，需要选择适当的细胞系和转染方法；
• 2.待测化学品处理时间应该根据不同化学品的特性和目的进行合理安排；
• 3.荧光素酶检测试剂盒的使用需要按照说明书进行，并注意光照条件和溶液质量；
• 4.对于结果的分析，需要根据实验设计和数据处理方法进行，以获得准确的评价。

四、结论

化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验是一种可行的生物学评估方法。该试验采用了雌激素激动活性法，符合GB/T35519-2017标准。在实际应用中，需要根据化学品特性和目的进行适当修改，以提高评估的准确性。

化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验雌激素激动活性法的相关资料

和化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验雌激素激动活性法类似的标准