犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术

犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术

国家标准 GB/T32948一2016 犬科动物感染细粒棘球缘虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 Detectionofcoproantigenofcamidaeinfeeted Echinoeoeeusgranulosus(E.g)bysandwichenzyme-linkelimmmosorbentassay 2016-08-29发布 2017-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/I32948一2016 犬科动物感染细粒棘球综虫粪 抗原的抗体夹心酶联免疫吸附 试验检测技术 范围 本标准规定了细粒棘球缘虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验(SandwichELIsA)检测技术 要求 本标准适用于细粒棘球缘虫感染终末宿主(犬科动物)的诊断、检疫,效果考核及其相关流行病学 调查 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室生物安全通用要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 细粒棘球缘虫粪抗原fecialantigenofEchinococcusgranulosus 细粒棘球缘虫寄生于犬科动物肠道,随粪便一同排出的虫体分泌物、代谢物和脱落孕节 3.2 抗体夹心 antibodysandwich 多克隆抗体与抗原免疫结合,抗原再与单克隆抗体发生特异性结合,形成抗体抗原-抗体“三明治” 式的复合物 3.3 细粒棘球缘虫成虫体表抗原 thesurfaceantigenofEehinoeoccwsgranulosus 细粒棘球缘虫成虫经1%Tionx100作用后获得的体表抗原(EsfAE) 3.4 兔抗EgsrAg的免疫球蛋白Gtherabbit'simmunoglobulinGagainsEgsfAg 纯化的抗EgsfAg多克隆兔抗体lgG(蛋白含量为l1.12mg/mL，抗体滴度为1:l60000以上). 3.5 抗Egtx的鼠单克隆抗体 mosemonoconalantib0dagainstEgsfAg 抗EgsAg的鼠单克隆抗体(蛋白含量为l4.4mg/mL，抗体滴度为1;80000以上) 缩略语 下列缩略语适用于本文件
GB/T32948一2016 oD值某一物质在某一个特定波长下的吸光度(opiealdensity PBS磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersolution) PBST含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液(phosphate-bufferedsaline' TMB四甲基乙二胺联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) EgsAg细粒棘球缘虫成虫体表抗原(thesurfaceantigenofEchinococcusgranulosus) EgsfAgRIgG兔抗EgsfAg的免疫球蛋白G(therabbit'simmunoglobulinGagainstEgsfAg EgXJ09MeAb抗EgsfAg的鼠单克隆抗体(mousemonoclonalantibodyagainstEgsfAg BSA牛血清白蛋白(albuminfrombovineserum) PB底物缓冲液(substratebuffer) Tritonx-100聚乙二醇辛基苯基,非离子表面活性剂[polyethyleneglycolmono(p-1,1.3,3 tetramethylbutyl)phenylether DMSO二甲基亚硕(dimethylsulfoxide) 5 原理 将EgsfAgRIg(G固着在载体(PvC)表面,并保持其免疫活性,待检抗原(犬粪便样品中Eg粪抗原 与前述抗体结合,被吸附的Eg粪抗原再与EgNJ09MeAb特异性结合,利用兔抗鼠IgG)二抗HRP与 前述被捕捉的单克隆抗体特异性结合,携带的酶催化底物显色 底物转化为有色产物的量与酶量及待 检样品中抗原量成正比,故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析待检样品阴阳性 阴性样品说明 该被检终末宿主没有感染细粒棘球缘虫;阳性样品说明被检宿主感染了细粒棘球缘虫 试剂材料与设备仪器 6.1试剂与材料 本标准试剂除特殊规定外,均指分析纯试剂 PBS(见附录A);常温保存 PBST(见附录A;常温保存 包被液(pH=9.6);Na.,cO0.16g,NaHcO0.29g,H.,O100mL,4C保存 封闭液;脱脂奶粉5g,PBS100ml,4C保存 EgsfAgRIgG;一20C保存 EgXJ09MeAb;一70C保存 兔抗鼠IgG)二抗HRP:一20C保存 TMB底物缓冲液(见附录A);4C保存 TMB底物显色剂(见附录A):4C保存 rM底物显色液(见附录.1C保存 终止液浓H,SsO10mL,H,o80mL,常温保存 1%BSsA;BSAlg,PBS100mL,4C保存 96孔酶标反应板:一20 6.2设备仪器及耗材 低温台式高速离心机;要求最大离心力在12000【以上 含有450nm波长的酶标仪 37C恒温 培养箱 振荡混匀器 电子天平精确度;0.01g) 24C冰箱、一20C冰柜和一70C超低温 冰箱
GB/T32948一2016 可调移液器一套,12道微量移液器(50L300AL),与移液器配套的吸头 50ml塑料离心管、 记号笔、塑料自封带、竹签、一次性手套、口罩、帽子、胶鞋,连体防护服等 样品采集与处理 7.1样品采集,运输和储存 用无菌竹签收集尽可能新鲜的犬粪便2g3g,装人50mL离心管内,编号,登记 用塑料自封袋 将其封闭后,置于加冰的保温箱中,冷冻运至实验室;保存一20以下,待检 7.2样品处理 将犬粪样置一70C,低温冷冻至少1周,以灭活病原 室温解冻,粪样加等量PBST(按质量比),充 分溶解混匀,静置30min，4000,离心15min，上清液即可用于检测 该上清液可在2C8C条件 下保存1周;若需长期保存,应分装放在一20C以下冰柜内,避免反复冻融 7.3避免污染 采样和处理过程中样本不得交叉污染,采样及样品处理过程中应注意安全防护,应戴一次性手套、 口罩、帽子,穿胶鞋(或鞋套)和连体防护服等 操作方法 8.1抗体包被 将适宜浓度的EgsfAgRIgG(54g/mL)包被96孔酶标反应板，100L/孔,反应板盖严,并在4 " 下孵育过夜 8.2封闭反应板 用PBST洗涤3次,每次加人洗液后放置1min;倒出后拍打干净 加人封闭液,200aL/孔,反应板 37C湿盒孵育1h 8.3加样 用PlBST洗涤3次,每次加人洗液后放置1min;倒出后拍打干净 A1、A2孔加人样品稀释液， 00l/孔;B.2至l.P孔加人标准阱性抗原NI1N(见附录A),00AL/孔;F.RP”孔加人标准 阳性抗原P(见附录A),100L/孔;其余孔先加人PBST80aL/孔.然后加人检测样本上清,20aL/孔 混匀,每个检测样品加2孔(建议加样参照附录c示意图),37丫湿盒密闭孵育30min 按加样顺序应 详细记录检测样本信息(包括编号、日期等》 8.4结合单克隆抗体 用PBsT洗诈3次，每次加人洗液后放置1min，倒出后拍打干净 除空自孔外，加人 EgXNJ09MeAb(建议工作滴度为1;4000l;6000),l00AlL孔,37C湿盒密闭孵育30 mln 8.5结合酶标二抗 用PBST洗涤3次,每次加人洗液后放置1min;倒出后拍打干净 除空白孔外,加兔抗鼠(IgG)二 抗HRP,100L孔37C湿盒密闭孵育30 min
GB/T32948一2016 8.6底物显色 用PBsT洗涤3次,每次加人洗液后放置1min;倒出后拍打干净 加人TMB底物显色液100L/ 孔.37亿避光孵育15nin 8.7终止反应和读值 加人终止液50AL/孔,10min内读取450nm的OD值,并计算空白孔、阳性孔、阴性孔和检测样品 孔的平均OD值 结果判定 9.1 有效原则 当ELISA反应结束并加人终止液后10min内用酶标仪测量各孔在450nm波长时的光吸收值 N2,N3、N4) 要求空白 并计算空白孔、标准阳性孔和每个标准阴性孔的oD平均值(N1、 OD值) 孔的oD平均值<标准阴性孔的oD平均值一标准阳性孔的oD平均值;标准阳性oD平均值(P)与所 有标准阴性OD平均值(N)之比大于或等于2.1即PN>2.1),否则检查ELISA板是否合格,加样位 置是否有错误等 9.2阴性、阳性判定 计算待测样品oD平均值和标准阴性OD值平均之比 当待测样品OD平均值(P)与所有标准阴 性oD平均值(N)之比大于或等于2.1即P/N>2.1时,定该待测样品为阳性,表示其含细粒棘球 虫成虫抗原
GB/T32948一2016 附 录A 规范性附录 相关试剂的配制 A.1PBs(pH=7.2) NaCl4g，KCl0.1g，Na,HPO0.72g,KH,PO0.12只，H,0500mL A.2PBsr(pl=7.2 NaCl4g KCl0.1g，NaHPO.0.72区,KH.PO.0.12g，H.0500mL 吐温-200.25mL A.3TMB底物缓冲液pH=6》 A液;NaH,POH.027.65g,H.OlL B液;NaeHPO2H.035.6g,H,O1L A液87.7mL十B液12.3mL A.4IMB底物显色剂 DMSso10mLTMB粉60mg A.5IB底物显色液(临用前配制 TMB底物缓冲液10mL TMB显色剂100a H.O15l A.6标准阴性抗原N1~N4 在实验室对实验犬用毗畦酮(5mg/kg)和丙硫咪陛(20mg/kg)联合驱虫,1周后镜检无虫卵,其粪 便按照粪抗原制备方法，即可作为标准阴性抗原N蛋白含量平均约为0.032mg/mL 0.047mg/mL). 标准阳性抗原 在实验室人工感染细粒棘球综虫实验犬获得的粪便样品,经虫卵灭活处理(一70C,低温冷冻至少 1周)后,按照粪抗原的制备方法,上清液即可作为标准阳性抗原P(蛋白含量平均约为0.033mg/ml)
GB/T32948一2016 附 录 B 规范性附录 检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施 B.1实验室设备要求 B.1.1实验室共分为两个独立的工作区域;样品处理区,E:LIsA检测区,各区应有明确标识 B.1.2各区应有专用的仪器、设备,标识明确 B.1.3各区应使用单独颜色或有明显区别标识的工作服,只准在本区穿着 B.1.4各区应有各自的清洁用具以防止交叉污染 B.2工作区域仪器设备配置 B.2.1样品处理区仪器设备配置 2C8C冰箱;一20C冰箱;一70C超低温冰箱;台式离心机(>12000r/min);混匀器;电子天 平(精度:0.01g);微量加样器(20l 200AL,200L1000ML);可移动紫外灯 B.2.2EL.ISA检测区仪器设备配置 恒温培养箱,混匀器,2C8C冰箱,微量加样器(0.5lL10aL,5aL20L,20L200 'L 200Ml1000AL,12道20Ml300AlL),全波长酶标仪,或有450nm波长酶标仪,可移动紫外灯,电 脑,打印机 B.3各工作区域功能及注意事项 B.3.1样品处理区 B3.1.1样品处理、保存,酶标板上样均在样品处理区进行 用过的加样器吸头应放人专门的消毒(例如含次氧酸钠溶液)容器内 实验室桌椅表面每次 B.3.1.2 工作后都要清洁,实验材料(原始粪样、处理过程中样品与试剂的混合液等)如出现外溅,应消毒处理,并 作出记录 B.3.1.3在本区开展实验时,操作者应穿一次性防护服、鞋套,戴一次性手套和帽子 工作结束后应立 即对工作区进行消毒,所有废弃物品都应做高压处理,方可丢弃 本工作区的实验台表面应耐受诸如次 氯酸钠等的化学物质的消毒清洁作用 B.3.2ELISA检测区 在进行试验的过程当中,稀释溶液所使用的容器应保证洁净无污染 B.3.2.1 B.3.2.2每一步的洗涤要彻底,避免影响最后的显色读值
GB/T32948一2016 附 录 c 规范性附录 酶标板检测样品加样示意图 酶标板检测样品加样示意图见图c.1 10 11 12 A 空白 空白 B N N N2 N2 N3 N3 D E N4 N4 G H 注:空白孔没包被,留作本底; 凡无特殊指出的孔,均可作为待检样品孔,待检样品加双孔 图C.1酶标板检测样品加样示意图

犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术GB/T32948-2016

细粒棘球绦虫是一种常见的寄生虫，可以感染犬科动物、家畜等。该寄生虫会对宿主的健康造成威胁，同时也会对人类健康构成潜在风险。因此，对于犬科动物感染细粒棘球绦虫的检测十分重要。

抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的检测方法。该方法利用特异性抗体和抗原的反应，通过检测酶标记物来实现对样品中特定成分的检测。在GB/T32948-2016标准下，可以采用ELISA方法检测犬科动物粪便中细粒棘球绦虫的抗原。

该方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点。在检测过程中，需要进行多个步骤的样品处理，如提取、纯化等。然后将样品加入已经涂有特异性抗体的微孔板中，待抗原结合后再加入酶标记的二抗进行检测。最后通过特定底物的反应，观察样品是否呈现颜色反应，以此判断样品是否含有细粒棘球绦虫的抗原。

综上所述，抗体夹心酶联免疫吸附试验是一种可靠、有效的检测犬科动物感染细粒棘球绦虫的方法。通过GB/T32948-2016标准的规范化操作，可以保证检测结果的准确性和可靠性。在未来的研究中，我们也期待能有更加先进、更加便捷的方法对这一领域进行探索和拓展。

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2022/10/3 13:12:06 现行