保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法

保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法

国家标准 GB/T23788一2009 保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法 Determinationofsoyheanisoflavoneinhealth-earefood一 High-performanceliquidchromatography 2009-05-18发布 2009-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23788一2009 保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法 范围 本标准规定了保健食品中大豆异黄酮的测定方法 本标准适用于以大豆异黄酮为主要功能性成分的保健食品(片剂、胶囊、口服液、饮料),也可用于保 健食品原料中大豆异黄酮含量的测定 本标准的检出限;固体、半固体样品大豆苷、大豆黄苷、染料木苷,大豆素、大豆黄素和染料木素组分 的检出限均为5mg/kg;液体样品的大豆苷,大豆黄苷,染料木苷、大豆素,大豆黄素和染料木素组分的 检出限均为0.2mg/L 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66822008,ISO3696:1987,MOD) 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 iisoflavone 大豆异黄雨soybean 大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素,大豆黄素和染料木素的总称,黄类物质 分子式如下;大豆 苷:CaHO,,大豆黄苷:CHO,染料木苷:CaHO,大豆素:CHo,大豆黄素.CHO.,染料 木素:CHO 方法提要 样品制备、提取、过滤后,经高效液相色谱仪分析(C柱分离,依据保留时间定性,用外标法定量 试剂和材料 本标准使用符合GB/T6682规定的一级水 除另有规定仅使用分析纯试剂 5.1乙睛;色谱纯 5.2甲醇优级纯 5.380%甲醇;用甲醇80mL,加水20mL,混匀 5.4磷酸 5.5磷酸水溶液;用磷酸调节pH至3.0,经0.454m滤膜过滤 5.6二甲基亚碱;色谱纯 0%二甲基亚碱溶液;取二甲基亚碱50mL,加水50mL,混匀 5.8大豆异黄酮标准贮备溶液.称取大豆苷(daidim)大豆黄苷(elyeitin)和染料木苷(genistin)大豆
GB/T23788一2009 素(daidzein)大豆黄素(glyeitein)和染料木素(genistein)(纯度均为98.0%以上)各4mg,分别置于 10ml容量瓶中,加人二甲基亚碱(5.6)至接近刻度,超声处理30min,再用二甲基亚碱(5.6)定容 标准贮备溶液浓度均为400mg/L(大豆苷,大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素) 大豆异黄酮混合标准使用溶液: 8.0mg/儿混合标准溶液配制-吸取大豆苷、大豆黄苷,染料木苷,大豆素,大豆黄素,染料木素六种 标准贮备溶液(5.8)各0.2ml于10ml容量瓶中,加人等体积水,用50%二甲基亚碱溶液(5.7)定容 16.0mg/儿混合标准溶液配制;吸取大豆苷,大豆黄苷,染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液(5.8)各 0，4ml 于10mL .容量瓶中,加人等体积水,用50%二甲基亚碱溶液(5.7)定容 24.0mg/L混合标准溶液配制:吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素,染料木素六种 标准贮备溶液(5,8)各0.6ml于10ml容量瓶中,加人等体积水,用50%二甲基亚讽溶液(5.7)定容 32.0mg/L混合标准溶液配制;吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木背、大豆素,大豆黄素,染料木素六种 标准贮备溶液(5,8)各0.8ml于10ml容量瓶中,加人等体积水,用50%二甲基亚讽溶液(5.7)定容 40.0mg/儿混合标准溶液配制-吸取大豆苷、大豆黄苷,染料木苷,大豆素、大豆黄素,染料木素六种 标准贮备溶液(5.8)各1.0mL于10mL容量瓶中,加人等体积水,用50%二甲基亚碱溶液(5.7)定容 仪器和设备 6.1高效液相色谱仪;带紫外检测器(或二极管阵列检测器) 超声波振荡器 6. 2 6.3分析天平:感量0.01mg 6.4酸度计;精度0.02pH 6.5离心机:转速不低于8000r/min 6.6滤膜:孔径为0.45m 容量瓶.10ml 分析步骤 7.1样品处理 7.1.1固体样品、半固体样品:固体样品粉碎、磨细过80目筛、混匀,半固体样品混匀,称取样品 0.05g0.5g(精确至0.1mg),用80%甲醉溶液(5.3)溶解并转移至50mL容量瓶中,加人80%甲醉 溶液至接近刻度 7.1.2液体样品;吸取混匀的液体样品0.5ml5,0ml于50ml.容量瓶中,加人80%甲醇溶液至接 近刻度 将上述样品溶液(7.1.1或7.1.2)用超声波振荡器振荡20min,用80%甲醉定容,摇匀 取样 7.1.3 品溶液置于离心管中,离心机离心15nmin(转速大于8000.r/min) 取上清液用滤膜(6.6)过滤,收集滤 液备用 7.2色谱条件 7.2.1色谱柱 C,4.6mm×250mm,粒度5m不锈钢色谱柱;也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱 7.2.2流动相 流动相A:乙睛(5.l). 流动相B;磷酸水溶液(pH=3.0)(5.5) 7.2.3梯度洗脱条件 见表1
GB/T23788一2009 表1 10 55 时间/min 23 30 50 56 60 流动相A/% 12 18 24 30 30 80 12 12 88 70 20 82 76 70 88 88 流动相B/% 7.2.4流速:1.0mL/min. 7.2.5波长;260nm 7.2.6进样量;l0l 7.2.7柱温;30c 7.3测定 7.3.1定性 分别将大豆苷,大豆黄苷,染料木苷,大豆素,大豆黄素,染料木素的标准贮备溶液(5.8)稀释10僧 后,按色谱条件(7.2)进行测定,依据单一标准样品的保留时间,对样品溶液中的组分进行定性,定性色 谱图参见附录A 7.3.2定量 将大豆异黄酮混合标准使用溶液(5.9)在色谱条件(7.2)下进行测定,绘制以峰面积为纵坐标混合 标准使用溶液浓度为横坐标的标准曲线 将7.1.3制备的样品溶液注人高效液相色谱仪中,保证样品 溶液中大豆苷,大豆黄苷,染料木苷,大豆素,大豆黄素和染料木素的响应值均在工作曲线的线性范围 内,由标准曲线查得样品溶液中大豆苷,大豆黄苷,染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的浓度 结果计算 8.1样品中大豆异黄酮各组分[大豆苷(X)、大豆黄苷(X.),染料木苷(X,大豆素(X,大豆黄素 X.)和染料木素(X]的含量分别按式(1)计算 1000 X -x" 1000 式中: -样品中大豆异黄酮单一组分的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L); 根据标准曲线得出的大豆苷(或大豆黄昔、染料木昔、大豆素,大豆黄素、染料木素)的浓度， 单位为毫克每升(mg/L). -样品稀释液总体积的数值,单位为毫升(mL); 固体,半固体样品质量的数值,单位为克(g); 液体样品体积的数值,单位为毫升(mL 8.2样品中大豆异黄酮总含量,按式(2)计算: X=X十X，十X十X十X 十X 式中: -样品中大豆异黄朋总含量,单位为老克每干克(mw/ke)或毫克每升(mg/L)7 样品中大豆苷的含量,单位为毫克每千克(mg/kp)或毫克每升(mg/L). 样品中大豆黄苷的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L): 样品中染料木苷的含量,单位为毫克每千克(mg/kp)或毫克每升(mg/L) 样品中大豆素的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L); 样品中大豆黄素的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)1 -样品中染料木素的含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L 计算结果应表示到小数点后一位 精密度 在重复性条件下,两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的10%
GB/T23788?2009 ? A ?? ???? ? mAU 350 300 250 E" 200 150 10o 50 -50- 2 30 40 ?/min (daidzin); ??(glyetim); ??genistin); (daidzeim); ??(elyeitein) ??(genistein). ?A.1???HPLc??