核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法

核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法

国家标准 GB/T34223一2017 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度 检测方法 Deermimatonfthepurityofrilonueleiseamddesxyribouelease 2017-09-07发布 2018-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34223一2017 核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度 检测方法 范围 本标准规定了核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测原理、仪器设备及器具、主要试剂,分析步骤 和结果分析 本标准适用于生化试剂核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶产品的生产和检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T3926出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 核糖核酸雨ribomuclease;RNase 水解核糖核酸(RNA)中磷酸二酯键,生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶 3.2 脱氧核糖核酸酶dexyribonuelease;DNase 水解脱氧核糖核酸(DNA)中磷酸二酯键,生成寡核昔酸或单核苷酸的核酸酶 原理 -定浓度的十二烧基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sDS-PAGE)可分离分子质量不同的蛋白质，经 考马斯亮蓝(CBB)染色,脱色成像后,通过计算进行核酸酶的纯度检测 仪器设备及器具 5.1电泳系统 5.2凝胶扫描装置 5.3水平脱色摇床,转速45r/min 5.4电子天平;精度为0.0001g,0.01只和0.1g 主要试剂 本方法所用试剂均为分析纯,实验用水均为GB/T6882规定的二级水
GB/T34223一2017 6.130%亚甲基双丙烯酰胺溶液(Acr-Bis) 取丙烯酰胺29.0g,N,N'-甲叉双丙烯酰胺1.0g,加人60mL水,充分搅拌溶解,定容到100mL 用0.454m微孔滤膜过滤除菌和杂质后储于棕色瓶,4C避光保存 如有沉淀应过滤,两个月后溶液应 重新配制备用 6.21.0mol/L三胫甲基氨基甲炕盐酸盐溶液(Iris-Hcl),pH6.8 取12.12《三影甲基氨基甲婉(Ti)游于80mL的水中,充分搅拌浴解,用Hcl调pH值为6.s.定 容至100mL,室温保存备用 6.31.5mol/L三羚甲基氨基甲完盐酸盐溶液(Iris-HCI),pH8.8 取18.17g三胫甲基氨基甲烧溶于80ml的水中,充分搅拌溶解,用HCl调pH值为8.8,定容至 100 mL,室温保存备用 6.410%十二烧基横酸纳(SDs)溶液 取10.0g十二炕基磺酸钠充分溶于约80mL的水中,定容至100ml,室温保存备用 6.510%过硫酸铵(APS)溶液 取0.1g过硫酸铵于1.5ml离心管,加1ml.水溶解,现配现用 6.610倍Iris-甘氨酸电极缓冲液 取30gTris,144g甘氨酸、10gSDS溶于800ml.水中,定容至1l,室温保存,使用时稀释10倍 6.75倍十二烧基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDs-PAGE)加样缓冲液 取1.25mL1.0mol/1Tris-HCI(pH6.8).SDSs0.50g、2.5ml甘油、0.025g澳酚蓝,用水溶解定容 至5mL,按照每管500L分装后,4保存备用 临用前每管加0.078g二硫苏糖醇(DTT),充分溶 解,现配现用 6.8染色液 染色液A;考马斯亮蓝G-2500.1g、95%乙醇50ml,85%磷酸100mL,用水定容至1000mL,保 存备用 染色液B;考马斯亮蓝R-2500.5g、冰乙酸25mL乙醇250mL,用水定容至500mL,室温保存 6.9脱色液 取100ml冰乙酸、400ml甲醇,用水定容至1L,室温保存 6.10标准蛋白质 分子质量为6.5kDa66.4kDa或分子质量为6.5kDa200kDa. .0me/ml牛血清白虽白标准落表 6.11 取0.01g纯度>98%的牛血清白蛋白精确至0.0o0l尽,溶于10mL浓度为0.15mol/L的NaC 溶液中
GB/34223一2017 分析步骤 7.1蛋白质含量测定 按照SN/T3926进行测定 7.2纯度测定 7.2.1 电泳样品制备 称取0.025g待测样品精确至0.0001g-溶解于10mL水中,浓度为2.5mg/mL 其中核糖核酸 酶和脱氧核糖核酸酶样品分别稀释为浓度0.625mg/mL、1.25mg/mL,现配现用,并将稀释后的待测 样品20L与5倍电泳加样缓冲液5AL在一个离心管中混合,100C水浴加热10min后,冷却备用 7.2.2电泳装板 将电泳所使用的玻璃板洗净、晾干,短板向外,长板向内嵌人塑料架中,并固定 7.2.3电泳分离胶和浓缩胶的配制 组装制胶装置,按表1分别配制4%浓缩胶和12%分离胶溶液 表1浓缩胶、分离胶配方 溶液成分 4%浓缩胶！ 2%分离胶/ ml /ml 30%Acr-Bs 0.65 3.97 1.5mol/1Tris-HCl(pH8.8) 2.5 1.0mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.63 10%APS 0.05 0,1 10%SDS 0.05 0. 3.7 3.4 水 0,005 0.005 四甲基乙二胶(TEMED 7.2.4 电泳上样 核糖核酸酶选择分子质量为6.5kDa一66.4kDa的标准蛋白、脱氧核糖核酸酶选择分子质量为 6.5kDa一200kDa的标准蛋白,上样量均为104L,每个样品设3个重复 7.2.5电泳 在配置好的电泳装置系统中加人电极缓冲液,浸没电极,采用微量加样器分别吸取待测样品,初始 电泳按照每块胶加70V电压,待样品中的澳酚蓝指示剂超过浓缩胶与分离胶分界线时,加大电压至 10V继续电泳,当溴酚蓝指示剂前沿到达电泳槽底部时停止电泳 7.2.6电泳染色与脱色 电泳结束后将凝胶移至染色盒中,加人染色液B,置于水平摇床染色至条带清晰,随后倒出染色液 B,加人脱色液,置于水平摇床上脱色至凝胶底色脱尽且蛋白条带清晰可辨,期间可更换脱色液
GB/T34223一2017 结果分析 8.1 条带分析 将待测样品电泳条带与不同分子质量标准蛋白质电泳条带对比,并根据核糖核酸酶和脱氧核糖核 酸酶标称分子质量进行判定 8.2纯度计算 脱色后,将凝胶转移至蛋白印记成像系统中成像,拍照记录样品3条平行试验条带 再将拍好的图 像于电泳凝胶定量分析软件中计算样品中核糖核酸酶或者脱氧核糖核酸酶所占的比例,按照式(1 计算 P=R×C×100% 式中 P 样品相对纯度; 样品中核糖核酸酶或者脱氧核糖核酸酶所占的比例,% R -样品蛋白质含量,% 样品3个重复结果的平均值与背测样品蛋白含量的乘积值即为待测样品相对纯度,结果用百分比 表示(%),计算结果保留小数点后两位 8.3重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%

核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法GB/T34223-2017

核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶是生物技术领域中常用的两类酶类。为了更好地评估这两类酶的纯度，国家标准化管理委员会发布了GB/T34223-2017标准，该标准提供了一种全面评估核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度的方法。

GB/T34223-2017标准中包含了一系列检测项，包括基础酶活测定、影响因素测定、稳定性测定以及其他辅助检测项。其中，纯度测定是核心检测项之一，通过比较不同样品的核酸酶蛋白含量，可以快速准确地评估样品的核酸酶纯度。

为了提高检测精度，GB/T34223-2017标准还采用了多种技术手段。例如，通过利用分子筛等材料进行离子交换层析，可以有效地去除杂质，提高样品的纯度；通过引入内参基因等辅助物质，可以消除不同样品之间的差异性，并进一步提高检测结果的准确性。

总体而言，GB/T34223-2017标准提供了一种全面、准确、可靠的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶纯度检测方法，为生物技术领域的相关研究提供了基础支持。

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