农药登记毒理学试验方法第3部分：急性经口毒性试验序贯法

农药登记毒理学试验方法第3部分：急性经口毒性试验序贯法

国家标准 GB/T15670.3一2017 农药登记毒理学试验方法 部分:急性经口毒性试验序贯法 Ioxieologiealtestmethodsforpestieidesregistration一 Part3:Acuteoraltoxieitytest一Upand-down-preedure 2017-07-12发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T15670.3一2017 农药登记毒理学试验方法 第3部分:急性经口毒性试验序贯法 范围 GB/T15670的本部分规定了急性经口毒性试验序贯法的基本原则、方法和要求 本部分适用于为农药登记而进行的急性经口毒性试验 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB18925实验动物环境及设胞 农药登记资料规定(农业部令[2007]第10号 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3. 急性经口毒性aeuteoraltosieity 一次或在21h内多次经口给予实验动物受试物后,动物在短期内出现的键康损害效应 3.2 剂量dose 所给受试物的量,以实验动物单位体重所接受受试物的质量表示(mg/kg体重) 3.3 半数致死剂量mdianlethaldose LDO -次或在24h内多次给予实验动物受试物后,引起实验动物总体中半数死亡的毒物统计学剂量 以实验动物单位体重接受受试物的质量表示(mg/lkg体重) 3.4 剂量-反应关系dose-responserelationship 剂量与特定效应的发生率间的关系 试验目的 急性经口毒性试验是评估受试物毒性的第一步 通过短时间经口染毒初步了解受试物的毒性特征 和剂量-反应关系,为急性毒性分级、标签管理和其他毒理学试验剂量选择提供依据 试验概述 序贯法(upanddo own-procedure,UDP)是一个阶梯式的染毒程序 使用单一性别的动物,一次染
GB/T15670.3一2017 毒 -只 第一只动物的染毒剂量最好低于LD的估计值 后续动物染毒剂量的增减,取决于前一只动 物的染毒结果(存活或死亡);在不能获得受试物lD.的初步估计值及剂量-反应曲线斜率资料时,计算 机摸拟结果提示起始剂量可选择175mg/kg体重,采用0.5的反对数(对应于一个默认的剂量级数因子 3.2)计算剂量间距 以最大似然法计算LD的点估计值和95%可信区间 注剂量级数因子由剂量-反应曲线斜率的倒数的反对数决定(3.2是斜率为2时的级数因子) 正式试验使用的动物数大约6只9只 限量试验不超过5只 本方法仅适用于动物染毒后 1d2d内死亡的受试物,对预期染毒后死亡延迟至5d以上(含5d)的受试物不适用 6 试验方法 6.1受试物 受试物可配制成水溶液、油溶液或悬浮液 尽可能选用水或食用油如玉米油)作溶剂,其他如梭甲 基纤维素销,明胶和淀粉可将受试物配制成混悬液或糊剂 除水以外的溶剂,用前应了解其毒理学特 性,必要时设立溶剂对照组 染毒时,不同浓度受试物现用现配 一次染毒容量不超过1mL/100g体 重,水溶液可达到2mL/100g体重,通过调整受试物溶液的浓度使各剂量组经口染毒的容量- -致 如 -次染毒容量太大,可在24h内分2次一3次给予 6.2实验动物 6.2.1种属和性别 啮齿类动物中可选用SD大鼠或wistar大鼠 单一性别,通常采用雌性动物应为未妊娠和未经 产的),比较敏感 如有相关结构的化学物的毒理学、代谢和毒物动力学研究证明雄性大鼠更敏感,可选 择后者 6.2.2年龄和体重 健康成年大鼠鼠龄在8周~10周内 动物体重变异不超过动物平均体重的士20% 按随机原则 逐只进人试验 6.3饲养环境和条件 动物饲养环境和条件应符合GB14925的有关规定 喂饲常规动物饲料,饮水量不限 试验前,人 选动物在饲养环境中至少检疫、适应3d 6.4试验步骤 6.4.1限量试验 6.4.1.1受试物的一次染毒剂量为5000mg/kg体重 先给一只动物染毒,在染毒48h内动物存活 再给2只动物相同的剂量,观察14d,如动物依然存活可终止试验或在给相同剂量的2只动物中,1只 存活1只死亡,再追加2只动物,染毒的5只动物有大于或等于3只动物存活,可结束试验,表明该受试 物的LDM>5000g/kg体重 6.4.1.2上述5只染毒动物中有3只动物分别在48h内死亡或死亡时间延迟在14d观察期内,终止染 毒,进人正式试验 6.4.2正式试验 6.4.2.1试验前,大鼠禁食过夜,饮水不限
GB;/T15670.3一2017 6.4.2.2起始剂量和剂量级数因子的选择 在无法得到受试物致死剂量的估计值时,默认的起始剂量 为1751 mg/kg体重 对应于剂量-反应斜率为2的级数因子3.2所设定的剂量序列为:1.75mg/kg体 重,5.5mg/kg体重17.5mg/ke体重,55nmg/kg体重,175mg/Akg体重,555mg/ke体重和2000mg/ke 体重或1.75mg/kg体重,5.5mg/kg体重,l7.5mg/kg体重,55mg/kg体重,l75mg/kg体重,555mg/k8 体重，1750nmg:/kg体重和5000mg/kg体重 如已知受试物的剂量-反应曲线斜率比较陡峭或较平坦 剂量级数因子可以缩小或加大 附录A列出了起始剂量为175mg/kg体重,斜率在1一8的剂量级数 可供选择 6.4.2.3试验开始,称量禁食后动物的体重,使用灌胃针头经口染毒，一次一只动物,每只动物的染毒间 隔时间为48h 第二只动物染毒剂量取决于第一只动物的染毒结果,如动物死亡或呈濒死状态,剂量 按级数因子下调一级;如动物存活,剂量上调一级 当后续剂量出现与起始剂量相反的染毒结果时,再 追加4只动物序贯染毒后结束试验,或当达到任一终止试验的规定(见6.4.2.6)时,可结束试验 染毒 后大鼠应继续禁食3h4h 对每只动物的观察期为14d 6.4.2.4如染毒48h内动物存活,而在后续观察期内出现延迟死亡,表明剂量选择不合适,可考虑再给 2只动物低于引起死亡的剂量,重新开始试验,延长观察期 6.4.2.5试验结果以最大似然法(见附录B)计算该受试物的LD和95%可信区间 6.4.2.6符合下述任一条件即可结束试验: 在上限剂量范围的序贯染毒中有3只动物存活时; aa 在任取的6只序贯染毒动物中出现5次相反结果时 b) 在第一次出现相反结果后至少有4只动物序贯染毒,从第一次相反结果后,开始计算每一个剂 co 量的似然值,其给定的似然比超过临界值 LD和斜率的变异大,在出现相反结果后有4只一6只动物序贯染毒即符合终止试验的规定 在 有些情况下,受试物的剂量-反应曲线斜率平坦,可能需要追加动物达到15只 6.5试验观察和检查 6.5.1临床观察 在染毒后24h(特别在染毒后30min内和第一个4h)以及14d的观察期内,每天定时观察并详细 记录每只动物的中毒反应 临床观察至少包括 中枢神经系统和神经肌肉系统;体位异常,叫声异常、不安呆滞,震颤、抽搐、,麻痹,运动失调、 对外反应过敏或迟钝,异常行为如过度反复抓挠口周、梳理、转圈,甚至自残、倒退行走等 植物神经系统;瞳孔扩大或缩小,流涎和流泪; b 呼吸系统:鼻孔流液、鼻鲤、鼻翼扇动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰 c d 泌尿生殖系统;会阴部污秽,有分泌物阴道或乳房肿胀; 皮肤和被毛;皮肤充血、紫绀、被毛蓬松或潮湿、污秽 e 眼:眼球突出、结膜充血、溢血性分泌物、角膜浑浊 g 消化系统;腹泻、厌食 记录出现震颤、抽搐、流涎,腹泻、嗜睡和昏迷的时间、严重程度,死亡时间或恢复时间 濒临死亡和 剧烈痛苦的动物以及试验结束尚存活的动物,最终应给予人道处死 6.5.2体重称量 应分别在染毒前、染毒后(至少每周一次)和处死前称量并记录动物体重 6.5.3病理学检查 在试验期内中毒死亡的和人道处死的动物应做大体解剖,记录每只动物的大体病理改变 染毒后
GB/T15670.3一2017 存活时间大于或等于24的动物其器官显示有大体病理改变,则需进行组织病理学检查,以便获取有 关毒作用的信息 试验结果和评价 7.1结果统计 7.1.1最大似然比应用软件包(AOT425StatPgm)可直接计算正式试验LD的点估计值和95%可信 区间 7.1.2将试验数据以表格形式列出,包括染毒剂量序列、使用动物数、每只动物的中毒表现、中毒表现 出现时间、死亡动物数和时间,恢复时间以及大体解剖检查结果 7.1.3软件包将根据上述表格列出的内容自动完成统计分析过程 7.2结果评价 LD值是受试物毒性分级和标签标识的依据 急性经口毒性级别按照《农药登记资料规定》中 3.3.2.8的相应标准判定 评价试验结果时,应考虑LD.与观察到的毒性效应(包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致 死效应及其他毒性作用)的发生率和严重程度之间的关系 引用LD值时一定要注明所用实验动物的 种属、性别染毒途径和观察期限等 8 试验报告 试验报告至少应包括以下内容 试验名称、试验单位名称和联系方式,报告编号; a b 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况 c 试验开始和结束日期试验项目负责人,试验单位技术负责人,签发日期; d 试验摘要; 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAs号)(如已知),代码(如有),纯度(或含量入、 剂型、生产日期(批号),理化性质、配制所用溶剂和方法 实验动物的种属品系,级别、数量、体重性别,来源(供应商名称,实验动物质量合格证号,实 验动物生产许可证号)检,适应情况,实验动物饲养环境包括温度,相对湿度、倒料、单笼侧 养或群养,实验动物设施许可证号; 剂量和组别;包括选择剂量的原则或依据、动物分组方式、性别和动物数 g 试验条件和方法;包括主要仪器设备、染毒途径、染毒方案、试验周期、观察指标和计算LD.的 h 方法等; 试验结果;以文字描述和表格逐项进行汇总,包括临床中毒表现,中毒表现出现、持续和恢复时 间,染毒后出现死亡的时间,体重变化,与剂量的相关性以及大体解剖和组织病理学改变等,指 出结果的统计处理方法; 试验结论;给出明确结论,如LD,95%可信区间和毒性分级,必要时对有关问题进行讨论 原始记录保存情况的说明 k
GB;/T15670.3一2017 录 附 规范性附录 起始剂量为175mg/kg体重、斜率在1~8的剂量级数(mg/kg体重)表 表A.1起始剂量为175mg/kg体重、斜率在1~8的剂量级数(mg/kg体重)表 斜率1 斜率2 斜率3 斜率4 斜率5 斜率6 斜率7 斜率8 0.175 0.175 0.175" 0.175" 0.175" 0.175 I75 I75 00.24 00.23 0,.275 0.26 0,31 0,34 0,31 0.375 0.375 0.41 0.44 0.47 0.55 0.55 0.55 0.55 0.69 0.65 0.73 0,81 0,82 0.99 0.91 0.97 1.2 1.09 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75 2.75 2.6 3.4 3.1 3.1 3.75 3,75 4.4 41 4.7 5.5 5.5 5.5 5.5 6.5 6.9 7.3 8.I 8.2 9.9 9.1 9.7 10.9 12 装 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 17.5 27.5 26 34 31 31 37.5 37.5 44 17 55 55 55 55 65 7 69 81 82 97 99 91 109 12o 盘 175 175 175 175 175 175 275 260 31o 340 31o 375 375 410 440 470 550 55o 550 550 65o 730 690 810 820 990 910 970 1090 1200 1290 260 1750 1750 1750 1750 1750 1750 喜需 o0 2750 2600 3100 3100 375o 3400 100 00O 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 如需要设计更低的剂量,可按剂量梯度递推
GB/T15670.3一2017 附 录 B 规范性附录) 正式试验LD.的计算 B.1最大似然法 B.1.1急性经口毒性试验应用软件包(AOT425StatPgnm)是按照最大似然法编制的软件,可直接计算 出LD.a 在假定sigma()条件下进行最大似然比计算 所有的死亡动物.包括染毒后立即、延迟和人 道处死的动物,均作为最大似然法分析的基本数据 B.1.2Dixons似然函数公式为 L =LLL (B.1 式中 在给定总体均数)和(标准差)的条件下,使用n只动物试验结果的似然函数 1一F(Z)(第i只存活动物的函数),或 =F(Z)(第只死亡动物的函数) 累计标准正态分布; logd;一}7o; 第i只动物的染毒剂量; 剂量对数单位的标准差(不是对数标准差. 注:用最大似然函数L的值计算LD真值的估计值,口的估计值可设定为0.5,除非可以得到最佳的和指定 的值 B.1.3以下情况不适宜统计学运算,可能给出错误的结果 a 用 一个临界剂量重复试验并按终止试验的规定结束试验或在较高剂量终止试验,因此报告受 试物的LD.超过上限值,并作出危害分类; b 引起动物死亡的剂量高于动物存活的剂量,LD.则介乎二者之间,此试验不会给出精确的 LD值(如果提供口值,也能计算最大似然比LD估计值); 如果染毒动物的死亡和存活仅出现在同一剂量中,高于此剂量,动物全部死亡,低于此剂量,动 物全部存活,LD相当于此剂量 B.1.4除以上情况外,均可使用急性经口毒性试验应用软件包AOT425StatPgm)进行最大似然函数 计算 亦可使用SAs即PROCNLIN)或BMDP即programAR)或其他计算机程序包完成最大似然 函数计算 在BAsIC程序中需将口作为参数编人程序,输出的结果是对数(ID.m)的估计值及其标 准误 B.2可信区间CID)计算 用AoT425StatPgm软件包运算得到正式试验的LD估计值后,才有可能进行可信区间的计 B.2.1 算,并为正式试验的可靠性,有效性提供有意义的信息 LD可信区间范围大,表明所估计的LD可靠 性和有效性存在较多的不确定性;可信区间范围较窄时,LD.的不确定性微不足道,可靠性和有效性较 高 当重复正式试验时,得到的LD的估计值更接近于原来测定的估计值,并且两者都更接近于LDm 真值 估算真值LD,的区间估计值的两种方式 B.2.2
GB;/T15670.3一2017 至少进行了3个不同剂量的染毒试验,其中间的剂量至少有一只动物存活和一只动物死亡 a 使用最大似然法计算可得到真值LD.和95%可信区间 由于使用实验动物数量的减少,可信 区间值不太准确 随机终止试验的规定对此有一定的改善,但仍与真实的可信区间存在一些 差异 b 如果在某一剂量或比该剂量低一个级数剂量染毒的动物全部存活,而下一个较高剂量染毒的 动物全部死亡,可信区间在二者之间 应视为近似区间,这种情况仅在剂量-反应斜率陡峭时 出现 绝大多数情况下,真值LD在计算区间内或者很接近 此区间相对较窄,其精确度能 满足实际应用的需要 B.2.3如试验中所用动物全部死亡或全部存活,可信区间可能报告为无限大或低端包括0在内的无限 小,或两个结果皆有 B.2.4如计算过程需要特殊程序完成,可借助于美国环保署(USEPA)和经济合作与发展组织(OECD 的相关软件专用程序进行运算