GB/T31806-2015
马铃薯V病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPotatovirusV
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数12页
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马铃薯V病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T31806一2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 DetectioandidentificationofPotatovir4s 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31806一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位;检验检疫科学研究院、云南出人境检验检疫局 本标准主要起草人;李桂芬,李曼、马洁、鲁洁、张永江、孔君、魏梅生
GB/T31806一2015 马铃薯V病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了植物检疫中马铃薯V病毒的检疫鉴定方法
本标准适用于马铃薯块茎、组培苗等繁殖材料中马铃薯V病毒的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 仪器设备及试剂 3.1仪器设备 酶标仪,天平(感量1/10000g),pH计,微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪,电泳槽、 凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等
微量移液器(2pl0,l.,20Ll00AL.,200Ll00AL.入,酶联板,研钵,离心管,花盆,灭菌 土等 3.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C,实时荧光RT-PR检测试剂见 附录D,生物学测定试剂参见附录E
抽样与样品制备 4.1抽样 抽样按照SN/T2122的规定进行
4.2马铃薯块茎样品的制备 将马铃薯块茎播于灭菌土中,于25C生长并进行症状观察
待长出约10片叶后将表现症状的植 株编号,未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号
采集叶片用于酶联免疫测定、RT-PCR检测,实 时荧光RT-PCR检测及生物学测定
4.3组培苗样品制备 将每瓶组培苗中的每个植株都进行采样,每瓶组培苗所采样品作为一个加样样品用于酶联免疫测 定、,RT-PCR检测,实时荧光RT-PCR检测及生物学测定
GB/T31806一2015 检测方法 5.1酶联免疫吸附测定 见附录B
5.2RI-PCR检测 见附录C
5.3实时荧光RT-PCR检测方法 见附录D. 5.4 生物学测定 参见附录E
结果判定 样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性,判断待 检样品不携带马铃薯V病毒
样品经酶联免疫吸附测定为阳性,RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性,即可判断待检 样品携带马铃薯V病毒
必要时可进行生物学测定
样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检测确定携带马铃薯V病毒的样品应在合适的条件下保存,块茎可在4C保存6个月,组培苗 可在一20C或一80C冰箱中保存1年,做好标记和登记工作
7.2结果记录 完整的记录包括,样品的来源,时间,地点,方达和结果等,并应有经手人和实验人员的签字
酶联 测定应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测应有电泳结果图片,实时荧光RT-PCR检测应有反应 原始数据,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片
GB/T31806一2015 附录A 资料性附录 马铃薯V病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1基本信息 学名;PoalovirusV,缩写,PVv 分类地位;马铃薯Y病毒科(Pu/yuiridae),马铃薯Y病毒属(Pu/yuirus)
A.1.2方法原理 根据马铃薯V病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸的序 列进行CR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸序列设计特异性引物和荧 光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定
条件允许的情况下,根据马铃薯V病毒侵染寄主的症状 特点,进行生物学检测
A.2寄主范围 马铃薯V病毒自然侵染仅限马铃薯
A.3病害症状 侵染的植株叶片灰白,新生叶变小,轻度扭曲,可能发展为花叶和坏死斑
A.4分布地区 分布于秘鲁、法国、荷兰和英国
A.5传播方式 ,Mdan Br 蚜虫传播,传播马铃薯V病毒的蚜虫种类为Myzusersicae rachycaudashelichrysi、 ucrosi orbiae、Rhopalosiphoninuslatysiphon hum1euphor A.6粒体形态 线状粒体,直径11nm~13nm,主体长度为760" nm
GB/T31806?2015 ?B 淶?? ?? B.1? B.1.1 DAsELISA:??,???(??) B.1.2 (pNPP). B.1.3?pH9.6) 1.59g ?(NaCO. ?(NaHcO 2.93g (NaN,) 0,20g и?1L4?档 B.1.4PBsT?(pH7.4) 8.0 ?(NaCD g 0.2 (KHPO 8 (NaHPO 1.15 g ?(KCI 0.2g -20(Tween-20) 0.5ml (NaN, 0.2g ??1L B.1.5???(pH7.4) PBST (Na.sO. 1.3g 20.0g PVP(MW2400040000 0.20 (NaN,) g C档 B.1.6?????(pH7.4 PBST BSA(??? 2.0g 20.0 PVP(MW2400040000 g (NaN,) 0.2g 4C档
GB/T31806一2015 B.1.7底物缓冲液(pH9.8 二乙醇胶 97mL 氯化镁(MgC1, g 0.l 叠氮钠(NaN,) 0.2g 溶于800mL蒸水,用盐酸调pH值至9.8,然后用蒸水定容至1L
4丫储存
B.2试验步骤 包被抗体 B.2.1 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100Al
酶联板加盖或用保鲜膜 包好,放在37C孵育2h
清空孔中溶液,用PBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍 干
再重复2次上述洗板过程
B.2.2样品制备与加样 待测样品按1:10(质量:体积)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨,2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品
阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行
加人制备好的检测样品,阴 性对照,阳性对照,100al/孔,酶联板加盖或用保鲜膜包好,放在4C孵育过夜
酶联板用自来水彻底 冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min
B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中,100Al/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,37C,4h
酶联板用自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min. B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100AL/孔加人到酶联板中 室温避光孵育
B.2.5读数 、120min 在不同的时间内如30min,60min,90min、 或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值
B.3结果判定 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即;缓冲液孔和阴 性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD值/阴性 对照OD值>5;同一样品的重复性基本一致 在满足了上述的质量要求后,结果原则上可判断如下;样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判 为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在2左右,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性
若满足不了上述的质量要求,则不能进行结果判断
GB/T31806一2015 附录c 规范性附录 r-CR检测 C.1试剂 C.1.1核酸提取试剂 核酸提取试剂为TRIzol试剂
C.1.250×TAE 三泾甲基氨基甲炕(Tris) 242 g 52.1m 冰乙酸 乙二胺四乙酸二钠纳(EDTA2H.O 37.2g 加燕僧水至1L
用时加蒸憎水稀释至1×TAE C.1.36×加样缓冲液 0.25%嗅酚蓝; 40%质量分数)蔗糖水溶液 C.2试验步骤 C.2.1总RNA提取 取0.lg样品,加人1mlTRIzol试剂充分研磨,室温放置5min;12000片离心5min,取上清液到 另一离心管中;加人三氧甲烧500AL,充分振荡15s,室温放置3min;12000g,4C离心15min;取上 层水相加人另一离心管中,加人等体积异丙醇;12000g，4离心10min,弃去上清液;加人1ml 70%乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH.O40L溶解即可 C.2.2引物序列 根据马铃薯V病毒的CP基因序列(GeneBank序列号:X61279.1)设计引物对如下: PVV-CPF:5'-cGTATGAAG;TCAGACATCAAG;CAAA-3'位置1219nt1243nt PVV-CPR:5'-AAAGCTAGTACGAAGAAAAGCCAAAC-3'位置2107nt2132nt) 预期扩增大小为914bp
C.2.3反转录 反转录体系20L
DEPC-H.O10L,10mmol/LdNTP1L,20Amol/L下游引物2AL,RNA 模板1L70C反应5min,冰上放置5min,加人反转录酶5倍缓冲液4l,200U/l反转录酶1AL 40U/ALRNA酶抑制剂1AL,42C反应1h
c.2.4CR扩增 反应体系20L
上述反转录产物2L,10倍PCR缓冲液(含Mg+)2L,10rmnmol/LdNTP
GB/T31806一2015 0.5aL,上游引物0.5L,下游引物0.5AL,2U/nLTaqDNA聚合酶1AL和DEPC水13.5aL
检测 时以含PVV的植物材料的DNA或含有PVV目标片段的质粒作为阳性对照,以健康植物材料作为阴 性对照,以水代替DNA模板作为空白对照
反应程序为:95C5min;94C30s,55C30s,72C1nmin
35个循环;72C7min C.2.5琼脂糖凝胶检测 用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右
将凝胶倒人凝胶槽中,插上样品 梳子
冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1mm
将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔,同时设计PCR的阴性对照和阳性对照,并加人DNA相 对分子质量标准物
接通电源,以3V/cm~5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果
15， 电泳结束后,将凝胶放人0.54g/mL的澳化乙锭(EB)染色液中染色10min~ min
将整个凝胶 置于凝胶成像系统上观察,记录结果 c3结果判定 阳性对照在914bp处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对照 -致的扩增条带,可判定为阳性
阳性对照在914bp处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,且待测样品在914p处无 扩增条带,判定结果为阴性
GB/T31806一2015 附录D 规范性附录》 实时荧光RT-CR检测方法 D.1主要试剂 RNA提取试剂 D.1.1 TRIzol试剂、三氯甲炕、异丙醇、70%乙醇
D.1.2实时荧光T-PCR试剂 TagMan(O)ne-stepRT-PCRMixture
D.2引物探针 根据马铃薯V病毒的CP基因序列(GeneBank序列号;XG1279.1l)设计引物对如下 PVV-F:5'-CGGTATGGTTTGGTGAGAAATTTGC-3'位置1800nt1824nt) PVVR:5'-AcCATcCAATcCAAACAAGCGAGT-3'位置1941nt1964nt) PVV-Probe:5'-FAM-TcccGCACATCCGTCCGAGCAC-TAMRA-3'位置1872nt1893nt) D.3核酸提取 取0.1g样品,加人1mLTRlzol试剂充分研磨,室温放置5min;12000片离心5min,取上清液到 另一离心管中;加人三氯甲烧500L,充分振荡15s,室温放置3min;12000g,4C离心15min;取上 层水相加人另一离心管中,加人等体积异丙醇;12000g,4C离心10min,弃去上清液;加人1mL70% 乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH.O40aL溶解即可
D.4实时荧光RT-CR反应 反应体系.0.2mL离心管中加人2xOnmestepRT-PCR缓冲液10LE
TuqHs(5U/aL) pL,PimeSeripRT 0.4 EnzymeMix0.4l,PVV-F10Mmol/L)0,4Al,PVV-R(10Mmol/I) AL,PvV-Probe(10Amol/L)0.6AL,RoXRcdereneeDyeI0.4L,模板RNA2L,补DEPC 0,4 H.0至20L
设置阳性对照、阴性对照及空白对照
;95C10s;9515s,60C1mi 反应程序:42C10min; n,40循环 PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用商业化试剂盒
D.5结果判定 在阳性对照Ct值小于30,空白对照C值等于40的条件下(若不满足该两项条件,此次检测无效 应重做荧光PCR扩增): 待测样品的Ct值为40时,判定待测样品为PVV阴性
a
GB/T31806一2015 b)待测样品的Ct值小于或等于35时,判定待测样品为PVV阳性
e)待测样品的Ct值小于40而大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值为40时,判定 PVV阴性;如果重新测试的Ct值小于40,则判定PVV阳性
GB/T31806一2015 附 录 资料性附录 生物学测定 E.1试材 E.1.1鉴别寄主 心叶姻(Nrcwiana.glaiwa),克利夫兰烟(N.clelandi)本生烟(N.beuhamiana),德民烟 N.debneyi)、白肋烟(N.tabacumcv.whiteBurley) 接种叶龄;5~8片叶
E.1.2试剂 0.2nmol/L的磷酸盐缓冲液pH8.0). E.2方法 E.2.1研磨 病样加1:5(质量:体积)的0.2mol/I磷酸盐缓冲液(pH8.0),在研钵中研碎
研碎后放人硅藻 土或金刚砂,浓度为0.5%,与病汁液混匀
E.2.2接种 用手将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面
E.2.3冲洗 用自来水冲洗叶表面
E.2.4观察 每天观察记载寄主反应,连续观察1个月
E.3鉴别寄主症状 E.3.1心叶烟;系统症状为明脉和花叶
E.3.2克利夫兰烟;系统花叶症状
E.3.3本生烟:顶部茎萎蔫和系统花叶症状
E.3.4德氏烟;接种叶症状为褪绿斑,系统症状为明脉花叶,褪绿斑,褪绿环 E.3.5白肋烟;系统症状为明脉和花叶
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马铃薯V病毒检疫鉴定方法GB/T31806-2015
马铃薯V病毒是影响全球马铃薯产业的主要病原体之一，它能够导致马铃薯产量下降、品质劣化以及长期育种计划的失败。因此，发展一种准确、快速、经济、易操作的检测方法具有极其重要的意义。
针对这一需求，我国于2015年发布了《马铃薯V病毒检疫鉴定方法GB/T31806-2015》标准，该标准提供了一套完整的马铃薯V病毒检测方案，具有如下优点：
- 准确性高：该标准使用的鉴定方法经过多次验证，能够在不同环境下稳定地检测到马铃薯V病毒。
- 操作简单：该标准使用的步骤简单，无需专业技能，只需要普通培训即可掌握。
- 经济实用：该标准所需设备简单，成本低，适合于各种规模的农场和实验室使用。
该标准主要包括以下内容：
- 样品采集：按照规定的样品采集方法采集植株、叶片和块茎样品，并进行标识。
- 提取RNA：使用RNA提取试剂盒从采集的样品中提取RNA。
- RT-PCR扩增：使用RT-PCR扩增仪器对提取的RNA进行反转录及扩增。
- 结果判读：通过比对阳性对照的扩增结果，判断待测样品是否为马铃薯V病毒。
总之，《马铃薯V病毒检疫鉴定方法GB/T31806-2015》标准的发布，对于保障我国马铃薯产业健康发展、维护农民利益、增加农产品出口均具有重要意义。
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