国家标准 GB/T32212一2015 液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法 Standardpracticefortestingfixed-wavelengthphotometricdeteetors uselinliquidchromatography 2015-12-10发布 2016-07-01实施中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T32212一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由机械工业联合会提出本标准由全国工业过程测量和控制标准化技术委员会(SAC/TC124)归口本标准起草单位;仪器仪表行业协会、计量科学研究院、北京创新通恒科技有限公司、大连依利特分析仪器有限公司、华东理工大学、北京分析仪器研究所本标准主要起草人;马雅娟,陶红,沈志刚,张学云,张维冰,娄兴军
GB/T32212一2015 液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法范围本标准用来指导光度检测器的性能测试,该检测器是液相色谱系统中在21o, nm一800nm波长范一个或多个同定彼长工作的检测部件通常测试波长使用25Anm,也可选择其他波长围内的本标准旨在描述检测器的性能,包括独立于色谱系统的静态性能及有流动相条件下的动态性能关于液相色谱程序的总体说明,见参考文献[1]~[9] 关于液相色谱检测器的原理,结构,使用和评估资料,见参考文献[10、[l1],以及[1]~[7]中涉及检测器的内容本标准并不涉及实际使用过程中有关的安全问题用户在使用前,确定本标准应用的局限性,并有责任制定适宜的安全及健康规范规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 AsTME275紫外,可见和近红外分光光度计的性能描述和测试方法(Praeticefordesceribingand measuringperformanceofultraviolet,Visible,andnear-infraredspectrophotometers) AsTME682液相色谱术语(Praeticeforliauidchromatographytermsandrelationships) 术语和定义 AsTME275、ASTME682界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 absorbancecalibration 吸光度值校准校正吸光度范围在士5%以内的验证程序 3.2 漂移 drift 测量1h以上.用每小时吸光度单位(AU/h)表示的噪声包络线的平均斜率 3.3 动态 dynamic 在流速为l.0mL/min下的状态线性范围 inearrange 光度检测器的线性范围是流动相中测试物质在检测器上的响应值与浓度的比值恒定在士5%内所对应的浓度范围,图1给出了详细说明线性范围应是以最高线性浓度与最小检测浓度或最小线性浓度的比值中较大者
GB/T32212一2015 1.06R R 0.95R 忍=响应常成 G=最小检测浓度 G=最小线性浓度 C=最高线性浓度线性范围对数浓度图1光度检测器线性图示例 3.5 长期噪声 long-termnoise 在6周期/h一60周期/h(0.1周期/nmin1.0周期/min)频率之间,检测器随机信号的最大振幅注这种噪声可能被误认为是后洗脱峰,该噪声仅表示观测到的噪声,但并不总能观测到 3.6 deteablity 最小检测限 minimum 特定溶剂中特定溶质在光度检测器中产生的响应值为检测器静态两倍短期噪声的浓度响应时间输出速度 responsetime(speedofoutput) 在检测器线性范围内,当流动相组成以阶梯式从新的平衡值10%变化到90%时检测器输出所需的时间注，因为检测器体积很小,传输速率不受扩散影响,一般响应时间足够快,可忽略不计通常将记录仪(或数据处理装置)的响应时间与相关检测器电位差计和记录仪(或数据处理装置)放大器相比较,影响观测响应时间的因素包括实际检测器响应时间,电子滤波和谱带扩展 3.8 短期噪声 sh0rt-ter1oise 在1周期/min频率以上,检测器随机变化信号的最大振幅的峰-峰值,用AU表示注:短期噪声值决定了用光度检测器测定的最小信号值和痕量样品可达到的精确定量限,并确定线性最低限本噪声仅对应于可观测到的噪声 3.9 静态 static 在无流量下的状态
GB/T32212一2015 重要性和用途 4.1在不同或特定条件下,有可能观测和测量到检测器的各种性能,但是本标准旨在相同工作条件下获得一套完整的检测器技术指标,也指出了为完整地描述检测器的能力,在检测器使用范围内的几种条件下测试它的性能本标准中使用的术语和试验方法普遍适用.不考虑最终工作参数 4.2使用的记录仪(或数据处理装置)或其他读数设备的线性和响应时间不应失真,否则会干扰检测器性能这需要调节增益、阻尼,校准到与制造厂的标准一致如果在检测器和终端读数设备之间使用辅助电子滤波器或放大器,也应首先确定它们的性能指标噪声和漂移 5.1测试条件样品池中用适当级别的脱气纯甲醇充满如果有参比池,则选用空气或氮气充满高压设备可能使空气中产生臭氧,所以最好选用氮气保持整个系统温度稳定,防止基线漂移检测器应固定在测试现场,并且在测试开始前至少启动24h 预热不足会产生超出检测器真实值的漂移检测器波长设定在254nm 5.2测量方法 5.2.1在泵与检测器之间连接一个合适的装置,在流动相为甲醇,流量为1.0mL/min时,此装置可提供至少75kPa的背压检测器出口连接一小段(大约100mm)内径0.25nmm不锈钢管,以防止气泡形成将记录仪(或数据处理装置)连接到相应的检测器输出信号端注，推荐的设备包括 a)长度2mm~4mm的内径0.1mm不锈钢管 mm内径0.25mm~0,.5mm 用扁口钳或切管器制成的长度250n n的不锈钢盘管 D) c) 固定在系和进样器间的背压阀 5.2.2用脱气甲醇反复冲洗溶剂瓶和色谱系统,包括检测器,去除系统中所有其他溶剂、可溶物质及夹杂的气体把甲醇注人溶剂瓶,并用泵带动甲洗整个系统至少30nmin,充分清洗系统中确保池体清清,没有尘埃并完全干燥 5.2.3如需要参比池中用空 5.2.4进行静态测试时,停泵,让色谱系统在室温,无流量条件下稳定至少1h 设定衰减器在最大灵敏度(最小衰减量),也就是满度值的最小吸收值(AUFS),调节具有可变响应时间的光度检测器的响应时间尽可能接近2s,记录使用的响应时间;调节检测器输出接近读数装置刻度中部,在这种状态下,记变化不超过2v 录检测器信号至少1h,在测量过程中,环境温度注时间常数可通过响应时间除以放大因子2.2来换算电子过滤器对观测噪音的影响可以通过设定一系列响应时间进行重复噪声测量来确定 5.2.5画几组长度在0.5nmin1min之间的平行包络线,可以观测任意15nmin周期内所有检测的随机变化的框图(见图2) 这种画平行包络线的方法可以使每组平行线之间的距离最小计算出所有部分的平均值,以AU表示的距离值除以光程em)得到静态短期噪声 5.2.6在15nmin静态短期噪声测量段的中间做标记,在中间部分的四周画一系列平行包络线组,每组对应10min长,选择线间纵向距离最大的一组平行包络线(见图2) 将纵向距离AU值除以光程(em 得到静态长期噪声 5.2.7画一组1h纵向距离最小的平行包络线(见图2),每根线的斜率为静态漂移,用AU/h表示 5.2.8在与5.2.1一5.2.3管路、溶剂、温度等相同条件下,设定泵流量1.0tmL/min让系统稳定15nmin
GB/T32212一2015 在此流量条件下,记录信号至少1h,在测量过程中,环境温度变化不超过2C 5.2.9画几组平行线按5,2.5描述的方法测量纵向距离,并计算动态短期噪声 5.2.10按5.2.6描述的方法测量动态长期噪声 5.2.11按5.2.7描述的方法,画平行线组这些线的斜率就是动态漂移 5.2.12系统的实际噪声可能比检测值大或小,这取决于检测器数据采集或信号检测方法,因为检测到的噪声是与读数装置的频率,响应速度和带宽相关的函数中间值 15min 短噪= ,/八(光程x" X=0.5min1min 10min 10min 长噪=z/光程(Z>z 漂移D 时间轴 60minm 图2光度检测噪声和漂移测量示例(记录仪输出图最小检测量、线性范围和校准 6.1概述如果要确定某一种物质在光度检测器上的线性范围,则应确定这种测试物质的响应 6.2的方法已考虑为最差的情况
GB/T32212一2015 6.2测试方法 6.2.1在甲醇中溶解一种适合的化合物,其具有紫外吸收且吸收值随波长变化而产生显著变化选择一个预期超出线性范围的浓度,通常给定吸收在2AU以上将此溶液准确稀释成能覆盖整个线性范围的系列溶液,也就是说,稀释到最小检测浓度用甲醇冲洗检测池,在检测池中为甲醇时将检测器读数调整为零用最低浓度的样品溶液冲洗检测池至得到稳定读数,通常1mL的冲洗量就足够记录检测器输出读数然后,用下一个浓度较高的样品溶液清洗注射器,依次将每份稀释得到的样品溶液注人检测池中在静态条件下测量,线性范围内获得至少5个测量值 6.2.2计算每个样品溶液的检测器响应值(AU)与浓度(4g/aL)的比值,将这些比值与浓度的对数绘图见图1) 线性区域定义为恒定响应比得到的水平线较高浓度时,一般与线性有负偏差,而在低浓度时,出现正,负偏差均有可能在恒定响应比线 5%位置画水平线,测量恒定响应比线与一条5%范围线在高浓度端相交,交点所对应的浓度就是线性上限浓度线性下限浓度是最小检测浓度(见6.2.3) 或恒定响应比线与一条5%范围线在低浓度端相交交点所对应的浓度,两者中较大者 6.2.3通过计算静态短期噪声2倍的浓度,确定试验物质的最小检测限,需标明溶剂和溶质 6.2.4计算线性上限和下限之间的比值得出线性范围,用一个数值表示因为此值是在最差情况下测量的,对在选择波长范围内具有宽谱带吸收的物质,其线性范围可能要比测试得到的更大 6.2.5绘制或计算检测器响应(AU)与已知摩尔吸光度测试物质浓度(4g/AL)之间的关系,找出通过坐标原点的最佳线段,按式(1)计算测试溶液的摩尔吸光度e: soXM 式中: -线性部分斜率,单位为吸光度单位微升每微克(AUAlL/4g); slop MV -摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol); 制造厂规定的光程,单位为厘米(em h 将得到的值与实验测得的值或参考文献(见注)中的值进行比较,如果值相差大于5%,需要调整光度检测器具体操作查阅制造厂说明书注，甲醉中的脉喘院在254nm处摩尔吸光度是8.77×10',在280nm处是1.42x10;0.005nmol1硫酸中的重铬酸钾在254nm的摩尔吸光度是4.22×10,在280nm是3.60×10 响应时间 7.1 概述当使用小粒径短柱和快速记录仪(或数据处理装置)时,检测器的响应时间就变得十分重要如果响应时间长,有可能降低检测噪声,增加线性范围尽管这对宽峰几乎没有影响,但是窄峰信号会明显下降如果响应时间可调,在其最大值和最小值处进行测试 7.2测试方法 7.2.1流动相组成可呈梯度变化,输出信号能在快速响应装置上记录如果记录仪(或数据处理装置响应时间不是远远小于检测器响应时间,那么只能得到检测器和记录仪(或数据处理装置)响应时间的叠加值,记录色谱图时也是叠加的响应时间 7.2.2设定流量为2.0mL/min 7.2.3通过在泵和检测器之间安装有1ml定量环的进样阀(或者体积至少是4倍检测器输人端到输出端管路总体积的定量环),可获得阶梯式变化观察记录仪(或数据处理装置)谱图,确定其已达到稳
GB/T32212一2015 定不稳定的状态可能发生在响应时间为快速情况下,此时需要增加样品体积将定量环中充满一定浓度的检测物质的甲醇溶液(参见6.2.1),在适当的衰减值下能得到检测器满量程的50%一95%信号，此时可认为该浓度在线性范围以内 7.2.4以3.0mL/min流量重复上述测量如果得到的测量值小于2.0mL/min时得到的值,那么在更大流量下重复测量,直到获得稳定的数值 7.2.5谱图上新平衡值信号从10%上升到90%时,所需要的时间为响应时间见图3) 图谱的采集速度应足够快才能获得准确的测量结果 wWa4 新建平衡 (4一4)=(4一)=(4一4/10 原始平衡 -响应时间时间(s 图3光度检测器响应时间测量示例折光率(RI)灵敏度 8.1概述理想状态下,要使运行梯度时基线变化最小,紫外可见检测器应对由流动相变化而引起的折光率变化不敏感在这种试验条件下,折光率的灵敏度是通过测量检测池中充满甲醇(n=1.329),然后充满环已烧(n=1.427)时基线的变化得到的 8.2试验材料,设备和工具 8.2.1化学试剂 a)环己婉;色谐级甲醇:色谱级 b e)乙醇;色谱级 8.2.2校准的记录仪(或数据处理装置) 8.2.3注射器;5ml20mL，配有合适的连接器连接检测器输人口来密封防漏
GB/T32212一2015 8.3测量方法 8.3.1开启检测器,并使之稳定1h以上,或按制造厂规定时间预热 8.3.2设定波长280nm,检测器/记录仪(或数据处理装置)输出0.01AUFS 8.3.3设定绘图速率1cm/min,或数据处理装置 8.3.4用注射器向检测池注人至少1mL甲醇,使得检测池内充满甲醇将注射器继续连接在检测池人口,用一合适的盖或塞堵住检测器出口管来密封检测池 8.3.5记录至少5min的基线 8.3.6取下管盖或塞子,重复此过程,直至基线变化不超过0.001AU 8.3.7取下管盖或塞子,用注射器注人乙醇清洗检测池 8.3.8清洁、干燥,用注射器注人环己炕,重复8.3.！8.3.6. 8.3.9以AU为单位,测量并记录2条基线的差值补充说明 9.1其他重要参数 9.1.1要对光度检测器进行更全面的评估,除上面描述的因素外,下列因素也很重要一些典型的数值及其单位列在表1中 9.1.2衰减范围:在标准输出电压下检测器输出的最大和最小设置,用满刻度吸收单位表示(AUFS) 此电压规定为记录仪(或数据处理装置)满刻度毫伏数mVFS) 当零点信号调整为记录仪(或数据处理装置)的零点后,该AU准确地代表了记录仪(或数据处理装置)的满刻度值 9.1.3波长:通过检测池的最强谱线的中心波长 9.1.4带通;最大值一半时谱线的宽度,对于宽谱光源,由滤光片的带宽决定 g.1.5光程;光通过检测池中液体的轴向有效长度 9.1.6池体积.检测池中产生混合及光吸收的有效体积 9.1.7检测器体积;检测器人口与出口之间的总体积,人口端应可直接连接色谱柱,出口端可与另一检测器人口端相连 9.2参比 9.2.1检测器采用单光束时,无参比 9.2.2检测器采用双光束时,其中有一个参比池应事先说明,否则参比为空气 9.2.3对于双光束仪器,如果样品光路与参比光路平衡时的光强比不是1:1,应事先说明 9.3监视器显示到达样品光能量的仪表或其他装置,应说明该仪表测量的量纲校准检查 9.4 在不使用外部装置情况下,调节检测器输出至特定吸收值的装置 9.5灯类型检测器使用的光源种类
GB/T32212一2015 9.6灯预期寿命 5只或更多灯连续工作的平均寿命,通常是光强度衰减到一半,而不是完全失效时的寿命 9.7压力限保证检测池正常工作而不产生损害或泄漏时的最大工作压力 9.8热交换器把流动相温度调整到与检测器池体温度相近的装置 9.9检测池润湿材料检测池所有与流动相接触部位的材料 g.10输入管所有连接到检测池人口管路的材质、长度和内径 9.11最大归零补偿检测器在微调或粗调和微调同时进行的条件下,检测器零点变化的最大量 g.12光电检测器光电检测器类型 g.13杂散光滤光片如果有,说明其类型以及带通 10 典型值第9章中给出了在推荐条件下测量的期望达到的检测器性能指标,其值和范围、单位如表1所示表1液相色谱(LC)光度检测器典型值性能单位典型值测量值静态短期噪声 AU 0.5~1.5)×10 动态短期噪声 AU 0.51×10 0 静态长期噪声 AU 4)×10" 动态长期噪声 AU l一5)×10 静态漂移 AU/h 5一10)X10" AU/h 动态漂移 2一6Xl0- 最小检测限依据溶液而定 #g/Al 线性范围 (5~10)×1o 响应时间 1l一5
GB/T32212一2015 表1(续性能典型值单位规定值、尺寸和材料衰减范围(由最小值到最大值 AUFS/mVFS 0.01一2.6 波长 nmm 253.7,280 带通 nm 0.55 光程 mm 10 池体积 -25 A 8 检测器体积 Al 1630 参比静态空气监视器仪表(mV或AU) 校准检查灯类型低压求灯 8500 灯预期寿命压力限 kPa 500 热交换器 50mm输人管连接池检测池接触材质 316不锈钢、TFE氟塑料、石英人口管路;材料、长度、内径 316不锈钢、100mm,0.lmm一0.3mm 最大归零补偿;微调,粗调 AU 15×FSD、l35×FSD在0.01AUFS条件下光电检测器类型光电倍增管、光电二极管杂散光滤光片无或有干涉滤光片 FSD=满刻度偏移
GB/T32212一2015 参考文献 1]Eanglehardl，H.，Ea.，PreticefHiehPerformanceL.iquidChromatography.SprngerVe lag,NewYork，NY，1986. [2]Johnson，E.L.，andStevenson，R.BasicLiquidChromatography,VarianAssoc.PaloA- o,CA，1978. [3]Parris,N.A.,InstrumentalLiquidChromatography,JournalofChromatographyLibrary. Vol5，ElsevierSeientificPublishing Amsterdam,1976. Co [4]Seott，R.P.w. ContemporaryLiuidChromatogaphy，TedhniquesofChemistry，Vl wiley&.sons, XI,John NewYork，NY，1976. nc. F.，Ed.， ractica [5Simpson. HiehPertormanceLiauidChromatography，Heydenand SonLimited，London，1976 Smith，R.M.，GasandLi [6们 Liquid ChromatographyinAnalytiealChemistryJohnwiley& Sons，Inc.，NewYork， 1988. [7刀 S R.，andKirkland,J.J. ntroductiontoModernLiquidChromatography，2nd Snyder， & Edition，JohnWiley Sons，Inc.，NewYork，NY，1979. AIabo HandbookofChr [87 Heftmann，E.，Ed.Chromatography and homaogaphie oratory VanNostrandReinholdCo.，NewYork，NY，1975. ElectrophoreticMethods，3rdEd Zweig，G.，andsherma Eds.，HandbookofChromatography，VolI，CRCPress Cleveland，OH，1972. Scott，R.P.W.，ILiguidChromatographyDetectors，JournalofChromatc [10] tographyLibrary, Vol33，ElsevierScientificPubishing Co.，Amsterdam，1986. [11l Vickrey，T，M.，Ed.，LiquidChromatographyDetectors， ChromatographicScience Series，Vol23，MarcelDekker，NewYork，NY，1983. [12]PIeifer,c.D.，LarsonJ.R.，andRyder,J.F.,“LimearityTestingofUravioletDetee ，1622-l624. inLiquidChromatography,”AnalytiealChemistry，ANCHA，Vol55，1983， tors Pp l0

液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法GB/T32212-2015

液相色谱（HPLC）作为一种常用的分离技术，广泛应用于药物研究、环境监测、食品检测等领域。在HPLC分析过程中，光度检测器是最常用的检测手段之一。其中，固定波长光度检测器由于其测量准确性高、灵敏度好等特点，在HPLC分析中得到了广泛的应用。

为了保证固定波长光度检测器的检测质量，GB/T32212-2015标准提出了固定波长光度检测器的测试方法。下面将对该方法进行详细介绍。

一、前期准备工作

1. 准备测试样品溶液：在一定浓度下制备不同质量浓度的目标化合物的标准溶液。

2. 准备试剂：根据实验要求准备所需的试剂，如缓冲液、溶剂等。

二、测试仪器与设备

1. 固定波长光度检测器：必须确保检测器的检测灵敏度、线性范围等参数均符合规定的技术标准。

2. 紫外可见分光光度计：用于确定样品在光谱上的最大吸收波长，并作为固定波长光度检测器的测试波长。

三、测试步骤

1. 手动设置波长：将紫外可见分光光度计设置成全波长扫描模式，将测试样品溶液加入光度池中，扫描其紫外可见吸收光谱曲线，记录目标化合物在样品中的最大吸收波长λmax。

2. 设置固定波长光度检测器：将固定波长光度检测器的波长调节至λmax，使其与紫外可见分光光度计获得的λmax一致。

3. 调节检测灵敏度：选取合适的浓度，加入缓冲液、溶剂等试剂，调节固定波长光度检测器的检测灵敏度直至满足实验要求。

四、注意事项

1. 检测器的灵敏度、线性范围等参数应符合技术标准的规定。

2. 在测试前，必须进行相关设备的预热、系统的排气等工作，确保测试环境稳定。

3. 测试样品需用高纯溶剂稀释处理，以避免杂质对测试结果的影响。

4. 在测试过程中，应注意避免阳光直射或其他干扰因素的影响。

5. 在进行检测前后，必须对设备进行校准和清洗处理，以保证测试结果的准确性。

总之，液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法GB/T32212-2015为HPLC分析提供了可靠的检测手段。在实际应用中，需要严格遵守该标准的要求，并注意实验细节，以获得准确、可靠的测试结果。