GB/T37875-2019
核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范
Technicalspecificationforqualityevaluationofnucleicacidextractionandpurificationkits
- 中国标准分类号（CCS）G00
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-08-30
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小889.05KB
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核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范
国家标准 GB/T37875一2019 核酸提取纯化试剂盒 质量评价技术规范 Techniealspecifieationforqualityevaluationofnucleic acidextractionandpurificationkits 2019-08-30发布 2019-08-30实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T37875一2019 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 3.2缩略语 评价指标 4.1产量 纯度 4.2 4.3完整度 4.4重复性 再现性 4.5 批间差异 4.6 4.7细菌内毒素残留 评价方法 5 5.1总则 5.2产量 5.3纯度 5.！完整度 5.5重复性 5.再现性 5.7批间墓异 5.8细菌内毒素残留 质量评价报告 附录A资料性附录核酸提取产量、纯度、完整度和细菌内毒素残留的测定方法
GB/37875一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由国家标准物质研究中心提出并归口
本标准起草单位:计量科学研究院、北京康为世纪生物科技有限公司
本标准主要起草人:傅博强、王晶、段佳丽、王春香、陈敏蟠唐治玉、牛春艳、董莲华、高运华
GB/37875一2019 核酸提取纯化试剂盒 质量评价技术规范 范围 本标准规定了核酸提取纯化试剂盒质量评价的术语和定义,质量评价技术指标和评价方法
本标准适用于细菌、质粒、真核细胞等的DNA和RNA提取纯化试剂盒的生产和服务
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T20001.4一2015标准编写规则第4部分;试验方法标准 JJF1001一2011通用计量术语及定义 JJF1265一2010生物计量术语及定义 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 GB/T20001.4一2015、JJF1001一201l和JJF1265一2010界定的以及下列术语和定义适用于本文 件
为了便于使用.,以下重复列出了GBT2l.4 -2015、JJF1001201l和JJF12652010中的某 些术语和定义
3.1.1 核酸的一级结构nueleicaeidprimarystructure 多核苷酸链中核苷酸的排列顺序(或碱基排列顺序)
3.1.2 标准物质referencematerial 具有足够均匀和稳定的特定特性的物质,其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期 用途
JJF10012011,定义8.14] 3.1.3 精密度preeisiom 在规定条件下,所获得的独立测试/测量结果间的一致程度
注1:精密度仅依赖于随机误差的分布,与真值或规定值无关
注2:精密度的度量通常以表示“不精密”的术语来表示,其值用测试结果或测量结果的标准差来表示
标准差越 大,精密度越低 注3:精密度的定量度量严格依赖于所规定的条件,重复性条件和再现性条件为其中两种极端情况 [GB/T20001.4一2015,定义3.3]
GB/T37875一2019 3.1.4 重复性repeatabhility 重复性条件下的精密度
注:重复性可以用结果的离散特性来定量表示
[[GB/T20001.42015,定义3.5 3.1.5 重复性条件repeatabilityconditions 为获得独立测试/测量结果,由同一操作员按相同的方法、使用相同的测试/测量设施、在短时间间 隔内对同一测试/测量对象进行测试/测量的观测条件
注重复性条件包括" 相同的测量程序或测试方法 同一操作员; 在同一条件下使用同一测量或测试设施; 同一地点 在短时间间隔内的重复
[GB/T20001.4一2015,定义3.6] 3.1.6 再现性reprodueibilty 再现性条件下的精密度
注1:再现性可以用结果的离散特性来定量表示
注2结果通常理解为已修正的结果
[GB/T20001.4一2015,定义3.8] 3.1.7 再现性条件reprdueibilityconditions 由不同的操作员按相同的方法、使用不同的测试/测量设施、对同一测试/测量对象进行观测以获得 独立测试/测量结果的观测条件
[GB/T20001.42015,定义3.9 3.1.8 批间差异batch-to-batehvariationm 在重复性条件下,同一厂家不同批次提取纯化试剂盒的核酸提取产量、纯度和完整度等指标的精 密度
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
DNA;脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid mRNA;信使核糖核酸(messengerRibonueleicAed) OD;光密度(OpticalDensity) RNA;核糖核酸(RibonuecleieAeid RNA;核糖体核糖核酸(ribosomalRibonucleicAed TAE;由三胫甲基氨基甲烧(Trisbase)、乙酸(Aceticaed)和乙二胺四乙酸EDTA)组成的缓 冲液 tRNA转运核糖核酸(trans Ses RibonucleicAcid)
GB/37875一2019 评价指标 4.1产量 核酸提取纯化试剂盒从一定质量或体积的样本中提取得到的DNA或RNA的总质量
应达到或 符合试剂盒说明书声称的提取产量要求
4.2纯度 核酸提取物中目标核酸的纯度,以核酸提取物中目标核酸与残留杂质的相对比值(如OD/OD80 和OD/ /oD,a)或电泳图条带等表示核酸提取产物的纯度
注，残留杂质包括来自于样本的蛋白质,多糖,多酚等,来自于提取溶剂的有机溶剂,异硫凯酸等,以及DNA提取时 残留的RNA,RNA提取时残留的DNA,mkRNA提取时残留的rRNA等
4.3完整度 提取核酸时,防止物理因素(剪切力、高温化学因素(强酸、强碱)和生物因素(核酸酶)破坏,保持 核酸一级结构完整而不发生改变的程度
4.4重复性 重复性条件下,核酸提取产量、纯度和完整度的精密度
4.5再现性 再现性条件下,核酸提取产量、纯度和完整度的精密度
4.6批间差异 重复性条件下,同一厂家试剂盒,不同批次间的核酸提取产量、纯度和完整度的精密度
4.7细菌内毒素残留 核酸提取物中残留的来源于革兰氏阴性菌细胞壁的细菌内毒素脂多糖的含量
注，对于用于转染的质粒或其他用于生物体内试验的核酸,需要检测细菌内毒素的残留量 评价方法 5.1总则 核酸提取纯化试剂盒的质量评价,应使用与试剂盒声称适用的样品一致或接近的标准物质(包括日 常用于评估测量程序精密度的标准物质/标准样品,即质量控制样品)
当没有标准物质时,可使用足够 均匀的、与试剂盒声称适用的样品一致或接近的样品
应使用经计量检定或校准的仪器
5.2产量 采用紫外分光光度法、,荧光法等测定核酸提取液中的核酸浓度,经计算,得到提取核酸的产量
测定方法参见附录A中的A.1
5.3纯度 对蛋白质,多糖、多酚、异硫氮酸等残留杂质,采用紫外分光光度法,测定260nm,280nm,2301 nm
GB/T37875一2019 下的光密度ODm,OD,ODm,计算ODm/OD丽和ODe/OD;值,评估提取核酸的纯度
对DNA提取时残留的RNA,RNA提取时残留的DNA,mRNA提取时残留的rRNA,采用琼脂糖 凝胶电泳法,检测非目标核酸残留的电泳条带,评估提取核酸的纯度
测定方法参见A.2
5.4完整度 采用琼脂糖凝胶平板电泳法、芯片电泳法等方法进行核酸完整度的测定
分析不同相对分子质量 大小核酸片段的荧光亮度或峰高,评估提取核酸的完整度
测定方法参见A.3
5.5重复性 在同一实验室,由同一操作员使用相同的设备,采用同一批次的提取纯化试剂盒,对标准物质或足 够均匀的样品,进行提取纯化
在1d内重复提取不少于6个平行样品
以重复性条件下提取核酸的 产量、纯度和完整度的精密度为指标评价重复性,计算见式(1)
RSD. ×芒×100% 式中 RSD. 重复性测量结果的相对标准偏差,%; 平行测定样品的数量,个; 第i个样品的测量结果; "个样品的测量结果的平均值
5.6再现性 在不少于百家不同的实验室,由不同的操作员使用不同的设备,采用同一批次的核酸提取纯化试剂 盒,对同一标准物质或足够均匀的样品,进行提取纯化
各重复提取3个平行样品
以再现性条件下提 取核酸的产量、纯度和完整度的精密度为指标评价再现性,计算见式(2)
RSDR X ×100% m 式中 RSD -再现性测量结果的相对标准偏差,%; 参加再现性评价的实验室的数量,家; m1 第i家实验室的3个平行样品测量结果的平均值; 5 家实验室测量结果的总平均值
5.7批间差异 在同一实验室,由同一操作员,使用相同的设备,采用同一核酸提取纯化试剂盒的3个不同批次,对 同一标准物质或足够均匀的样品,进行提取纯化
各批次试剂盒分别重复提取3个平行样品
以上述 条件下试剂盒批次间提取产量、纯度和完整度的精密度为指标评价批间差异,计算见式(3)
RsD, ×100% x
GB/37875一2019 式中: RSD. 批间差异测量结果的相对标准偏差,%; 样品不同批次的数量,个; -第i个批次的3个平行样品测量结果的平均值;
-b个批次样品的测量结果的总平均值
5.8细菌内毒素残留 对于提取用于转染的质粒或其他用于生物体内试验的核酸试剂盒,对提取核酸中的细菌内毒素残 留进行定量
测定方法参见A.4
质量评价报告 应包括试剂盒所提取核酸的产量、纯度,完整度,及其重复性、再现性和批间差异
如有必要,还应 包括细菌内毒素残留
GB/T37875一2019 附 录 A 资料性附录) 核酸提取产量、纯度、完整度和细菌内毒素残留的测定方法 核酸提取产量测定方法 A.1.1紫外分光光度法 A.1.1.1试剂和仪器 去离子水.18.2Mn. 核酸样品溶解缓冲液; 微量紫外分光光度计; 微量移液器 A.1.1.2操作步骤 用去离子水将检测池清洗三次,每次2L.,用无尘纸擦拭干净
加人2AL核酸样品溶解液作为空 白对照,在260nm波长下校零
取核酸提取溶液2L,在260nm波长下测定,每测一次,用去离子水 清洗检测池三次
注利用微量紫外分光光度计测定核酸提取溶液的oDm.OD测量值的范围在0.05一1.0之间才能保证测量值的 有效性
如果不在此范围,可进行适当的稀释或浓缩
A.1.1.3结果计算 核酸提取产量计算方法;按照式(A.1l)计算核酸提取原溶液中的核酸质量浓度p,按照式A.2)计算 提取核酸产量m
p=OD×N×e/b (A.1 式中 -核酸提取原溶液中的核酸质量浓度,单位为纳克每微升(ng/L); ODm 核酸在260nm下的光密度 N -样品稀释倍数; -消光系数,依赖于波长双链DNA为50ngcm/AL,单链DNA为33ng”cm/pL RNA为40ng”cm/L); 光程,单位为厘米(e cm
(A.2 =pxV 式中 n 提取核酸产量,单位为纳克(ng); -核酸提取原溶液中的核酸质量浓度,单位为纳克每微升(ng/AL); 核酸提取原溶液的体积,单位为微升(pL)
A.1.2荧光法 采用荧光计测量,荧光染料标记核酸的荧光强度与核酸含量成正比
此方法可以排除核糖核酸、脱 氧核糖核酸以及蛋白质三者之间的相互干扰
GB/37875一2019 A.1.2.1试剂和仪器 荧光法核酸定量试剂盒;含核酸荧光染料、核酸样品溶解缓冲液、标准品溶液; 去离子水,18.2MQ: 微量荧光计:; 微量移液器; 涡旋仪
A.1.2.2操作步骤 配制检测工作液;将试剂盒中的各组分恢复至室温
在0.5mLPCR薄壁管中,使用核酸样品溶解 缓冲液,按比例将适量核酸荧光染料试剂稀释至1×(如:取1AL荧光染料试剂,加人199Al核酸样品 溶解缓冲液),现用现配
工作液配制好后,3h内使用
配制待检标准品溶液;取190AL检测工作液至2个0.5mLPCR薄壁管中,分别加人10AL标准 品1溶液和标准品2溶液,轻轻涡旋振荡2s3s,尽量避免气泡产生
配制待检核酸样品溶液:取180L一199AL检测工作液至样本的PCR管中,分别加人1L~ 20L待检样本,使PCR管中每个样本终体积为200AL,轻轻涡旋振荡2s3s,尽量避免气泡产生
将所有待检PCR管置于室温避光孵育2min
按照荧光计的操作说明,测定荧光信号值
为保证结果的准确性,标准曲线上的每个浓度应做2个平行
每个样品应重复检测三次,从与荧光 染料的混合开始
A.1.2.3结果计算 使用核酸标准品溶液绘制标准曲线,通过标准曲线线性回归方程计算核酸提取原溶液中核酸浓度
然后根据式(A.2)计算提取核酸产量
A.2纯度测定方法 A.2.1紫外分光光度法 A.2.1.1试剂和仪器 去离子水,18.2Mn; 核酸样品溶解缓冲液; 微量紫外分光光度计; 微量移液器
A.2.1.2操作步骤 用去离子水将检测池清洗三次,每次2AL.用无尘纸擦拭干净
加人2ALpH7.08.5的核酸样品溶解液作为空白对照,在230nm、260nm和280nm波长下 校零
取核酸样品溶液2l核酸样品溶液,在230nm,260nm和280n波长下测定,每测一个样品,用 去离子水清洗基座三次
注1:利用紫外分光光度计测定核酸样品溶液的OD.e,ODn,OD.,OD测量值的范围在0.051.0之间才能保证 测量值的有效性
如果不在此范围,可对核酸样品溶液进行适当的稀释或浓缩
GB/T37875一2019 注2;oDm/oD和oD,/OD.比率是依赖于用于空白和样品测量的缓冲pH值和离子强度
对照及样品稀释 液需使用10mmol/儿Tris
HCl,pH值7.5,用水作为稀释液将导致比值偏低,此时可尝试将pH值调到8.0 左右再检测
A.2.1.3结果计算 计算oD/oD,oDm/oD的比值
每个样品重复测定3次,计算求得平均比值
A.2.1.4纯度判断 理论上核酸在260nm处达到最大的吸收峰,蛋白质在280nm处达到最大的吸收峰,多糖和有机 溶剂在230nm处达到最大的吸收峰
通过计算OD./OD和OD/OD判断提取产物的纯度
纯DNA.oD./oDm之l.8(1.8一2.0(>2.0,表明有RNA污染;<1.8,表明有蛋白质,多酚等污 染)
OD2/OD230>2.0(2.02.5)( 一20.表明有残存的多糖,盐或其他有机溶剂 纯RNA.oD./OD2.0(1.8一2.0)(<1.8时表明有蛋白质污染;>2.0时表明可能有异硫氢酸 残存)
OD/OD0>2.0(2.0一2.5)(<2.0,表明有残存的多糖、盐或其他有机溶剂. A.2.2琼脂糖凝胶平板电泳法 采用琼脂糖凝胶平板电泳法检测非目标核酸残留的电泳条带
方法可参考A.3中的琼脂糖凝胶 平板电泳法
对DNA提取时残留的RNA,DNA中的RNA污染为较小片段的电泳条带
对RNA提取时残留的DNA,DNA污染为较大片段的基因组DNA残留电泳条带
对RNA,包括真核样品的28S和18s的rRNA条带,原核样品23S和16s的rRNA条带,以及细 胞内mRNA和tRNA的非常明亮的连续条带 A.3完整度测定方法 A.3.1DNA琼脂糖凝胶平板电泳法 根据核酸本身携带的电荷和相对分子质量的差异,经琼脂糖凝胶平板电泳实现分离
核酸分子经 染色剂染色,在凝胶成像系统的紫外光激发下,发出荧光
根据电泳条带的位置,与DNA分子量标准 进行对比,判断核酸片段的相对分子质量,分析核酸完整度
A.3.1.1试剂和仪器 灭菌双蒸水; TAE缓冲液;趁基甲基氨基甲棕(Ti)212g,冰乙酸7.1mL.,0.5molLEDTA游液100ml pH8.0),灭菌双蒸水加至1000mL,121C高压灭菌15min
得到50×TAE电泳缓冲液
用灭菌双 蒸水稀释至1×TAE 6×核酸上样缓冲液;含0.25%澳酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油的水溶液 琼脂糖,生化级; 澳化乙锭,生化级; 澳盼蓝,生化级; DNA分子量标准,分析纯; 平板电泳仪; 凝胶成像系统 微量移液器
GB/37875一2019 A.3.1.2操作步骤 A.3.1.2.1制胶 按表A.1选择合适的凝胶浓度,以20ml胶体为例,称取0.2g琼脂糖凝胶,按比例加人20ml1× TAE缓冲液,放人锥形瓶中
摇匀,微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解,稍冷却加人适量的澳化乙锭至 浓度为0.54g/mL
水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒人已冷至60C左右的胶液,室温冷 却凝固30min一45min,待完全凝固后,使之形成均匀水平的胶面
缓慢拔起梳子,确保点样孔完好
使加样孔端置阴极端放进电泳槽内
在槽内加人1xTAE电冰缓冲液直至液面覆盖过胶面
表A.1琼脂糖凝胶电泳分离范围 琼脂糖凝胶浓度/% 可分辨的线性DNA大小范围/kb 0,4 5一60 0.7 0.8l0 1.0 0.4一6 1.5 0.2~4 1.75 0.2~3 0.13 2.0 A.3.1.2.2点样 取1AL上样缓冲液(6×),加人5L待测DNA提取溶液,混合均匀,以微量移液器加人点样孔下 部
上样的DNA提取溶液浓度不低于1ng/L
本条件下,宜使用15000DNA分子量标准或 ADNA/Hind标准,上样量4L
A.3.1.2.3电泳 接通电泳仪和电泳槽并接通电源,调节电压至100V3V/em~5V/em),开始电泳
可见染色条 带由负极向正极移动,当澳酚蓝移动至距胶板前沿约1e处,可停止电泳
根据实际情况对电压和时 间进行调整
A.3.1.2.4观察 经琼脂糖凝胶平板电泳后使用凝胶成像系统与DNA分子量标准进行对比,分析DNA完整度
根 据条带位置判断DNA链的长度,根据条带的荧光强度大致判断DNA量 A.3.1.3完整度判断 一条清晰明亮的条带,无拖尾和弥散,说明DNA的完整性好
若 若琼贴糖凝胶电冰主带单一 ,为- 条带拖尾或者弥散,均为完整度差,说明提取的DNA发生了较严重的降解
A.3.2RNA琼脂糖凝胶平板电泳法 A.3.2.1试剂和仪器 灭菌双蒸水;
GB/T37875一2019 MOPS缓冲液(10×);0.4mol/儿L吗味代丙炕磺酸(MOPS)pH7.0),0.1mol/L醋酸钠(NaAe) 溶液，10mol/L
EDTA; 上样染料:50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%澳酚蓝,0.4%二甲苯蓝 甲醛,分析纯; 乙醇,分析纯 H.O.,分析纯 去离子甲酰胺,生化级 琼脂糖,生化级; 澳化乙锭,生化级; 0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯处理的水) RNA分子量标准,分析纯; 平板电泳仪; 凝胶成像系统; 微量移液器
A.3.2.2操作步骤 A.3.2.2.1 制胶和灌胶 称取0.5【琼脂糖,置干净的100mL锥形瓶中,加人40mL燕僧水.微波炉内加热使琼脂糖彻底浴 化均匀
待胶凉至60C一70C,依次向其中加人9ml甲醛、,5ml10×MOPS缓冲液和0,.54L嗅化 乙锭,混合均匀
经去污剂洗干净(一般浸泡过夜)水冲洗一乙醇干燥一3%H.O
灌满一室温放置 10min -0.1%DEPC水清洗电泳槽,烘干后,灌制琼脂糖凝胶
A.3.2.2.2上样 取DEPC处理过的500L离心管,依次加人如下试剂:10×MOPS缓冲液2L,甲醛3.5AL,甲 酰胺(去离子)10L,RNA样品4.5AL,混匀
将离心管置于60C水浴中保10min,再置冰浴上2min. 向管中加人3Al上样染料混匀
以微量移液器加人点样孔下部,上样量4L
A.3.2.2.3电泳 电泳槽内加人1×MOPS缓冲液,7.5V/mL的电压条件下电泳
A.3.2.2.4观察 使用凝胶成像系统与RNA分子量标准进行对比,分析RNA完整度
根据荧光位置判断RNA链 的长度;根据蒙光强度大致判断RNA量 完整总RNA的电泳谱图为清晰的两条条带,真核样品为28S和18S的rRNA条带,原核样品为 23S和16S的rRNA条带
A.3.3DNA和RNA的芯片电泳法 将试剂盒提取所得的核酸提取液,依据芯片电泳仪的操作指南,在核酸芯片电泳装置下由微流体芯 片进行分离,测定不同片段大小核酸的荧光信号强度
对DNA提取物,测定DNA样本中不同片段长度DNA的分布和丰度大小,综合计算后评价DNA 10
GB/37875一2019 完整性
对真核生物总RNA,测定真核生物核糖体小亚基28SrRNA与18SrRNA的丰度比,计算后评价 真核生物总RNA完整性,比值>1.5为高质量，l.31.5为尚可使用,<1.3为较差
对原核生物总RNA,测定原核生物核糖体小亚基23SrRNA与16SrRNA的丰度比,计算后评价 原核生物总RNA完整性,比值>1.5为高质量,1.31.5尚可使用,<1.3为较差
数值越大表明核酸 完整度越高,质量越好
对总RNA提取物,电泳时会产生清晰的两条条带(真核样品为28S和18S的rRRNA条带,原核样 品为23S和16S的rRNA条带)
28SrRNA条带的强度应当大致为18SrRNA条带的两倍
2:1的 比率(28S:18S)是判断RNA完整性的重要指标
部分降解的RNA样品电泳条带会弥散,没有清晰的 rRNA条带,或者不会出现2:1比率(28s:18S)
完全降解的RNA会表现为在极低相对分子质量处 的弥散状
如果28S和18SrRRNA条带清晰,且(28S:18S)>1,该完整性可以满足绝大部分后续试验 的要求
完整的mRNA的电泳谱图无明显的rRNA条带,为0.5kb~6kb大小范围的弥散
A.4细菌内毒素残留测定方法 测定方法参考《药典X(2015年版)四部的"13细菌内毒索检查法"中的方法"“光 度测定法”
核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范GB/T37875-2019
随着分子生物学和基因工程技术的发展，核酸提取和纯化已成为许多实验室中不可或缺的步骤。为确保核酸提取和纯化的质量和准确性，制定了一系列相关的技术规范和标准。其中，GB/T37875-2019《核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范》就是目前国内较为权威的技术规范之一。
该技术规范从试剂盒的定义、分类、性能指标等方面入手，针对常见的提取样品类型和处理方法，规定了相应的试剂盒质量评价方法。主要包括以下方面：
- 试剂盒的外观检查，包括包装、标签等信息的检查
- 试剂盒中各试剂成分的确认和检验，包括核酸提取缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等试剂的检验
- 试剂盒性能指标的评价，包括核酸回收率、纯度、灵敏度、特异性等方面
- 试剂盒的贮存和使用情况的监测，包括温度、湿度等因素的监测和记录
通过以上评价方法，可以全面、准确地评估核酸提取纯化试剂盒的质量和性能。在实际操作中，还需结合具体的样品类型和实验要求进行选择和优化。
总之，GB/T37875-2019技术规范对核酸提取纯化试剂盒的质量评价提供了科学、规范的方法和标准，对于保证实验结果的准确性和可靠性具有重要意义。
