医用有机硅材料生物学评价试验方法

医用有机硅材料生物学评价试验方法

国家标准 GB/16175一2008 代替GB/T16175一1996 医用有机硅材料生物学评价试验方法 Bioogienlevaluationtestmethodsftomediealorgamiesilieonmaterials 2008-01-22发布 2008-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T16175一2008 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 评价与试验选择 样品制备 细胞毒性试验 迟发型超敏反应试验 刺激试验 急性全身毒性试验 亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性试验 10热原试验 12 ll遗传毒性试验 12植人试验 21 23 13溶血试验 附录A(资料性附录)细胞培养常用溶液和培养基制备 25 附录B(资料性附录遗传毒性试验用试剂制备 2 31 参考文献
GB/16175一2008 前 言 本标准代替GB/Tl6175一1996《医用有机硅材料生物学评价试验方法》 本次修订按GB/T16886 《医疗器械生物学评价》对标准内容进行了修改和调整 本标准与GB/T16175一1996的主要差异如下: -增加了规范性引用文件; -试验选择指南改为评价与试验选择,取消了试验选择表; -修改了材料浸提液制备方法,取消了供试品表面积或重量与浸提介质比例表 修改了细胞毒性试验,包括浸提液和直接接触试验; -过敏试验修改为迟发型超敏反应试验,增加了封闭贴敷迟发型超敏反应试验; 将皮内刺激试验、原发性皮肤刺激试验和眼刺激试验整合为刺激试验,包括皮肤刺激试验、眼 刺激试验和皮内反应试验 取消了口腔黏膜刺激试验; 增加了亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性试验; 增加了遗传毒性试验,包插鼠伤寒沙门氏菌回复突变试险(Ams试验入.小鼠淋巴瘤细胞突变 试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验; 修改了植人试验,增加了皮下和骨植人试验; 增加了附录B遗传毒性试验用试剂制备 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由国家食品药品监督管理局提出 本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口 本标准起草单位;国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心,上海生物材料研究测 试中心 本标准主要起草人:由少华、孙皎,朱雪涛、黄哲玮、黄经春、王昕、侯丽、曾冬明 本标准于1996年3月首次发布
GB/T16175一2008 引 言 本标准给出的试验方法是根据GB/T16886.1《医疗器械生物学评价第1部分;评价与试验》的基 本原则,特别针对医用有机硅材料的生物学评价需求所设立的 本次修订是在GB/T16886《医疗器械 生物学评价》标准和《药典以下简称《药典)二部中相应试验方法学原理和试验 步骤的基础上,并根据医用有机硅材料的特性制定而成,因此本标准是与GB/T16886标准和《药 典》方法具有方法学等同性,适用于医用有机硅材料生物学评价的方法标准 本次修订对热原试验直接引用《药典》中的适用章节;对GB/T16886标准中未给出详细试验 步骤的试验项目进行了细化,例如细胞毒性、急性全身毒性、亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性、遗传毒性 和植人试验;对GB/T16886标准中已详细给出试验步骤的刺激,迟发型超敏反应试验,本次修订采用 直接引用相应GB/T16886标准的方式 鉴于亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性、遗传毒性试验均为发展中的生物学试验,本标准给出的试验 方法并非为唯一的方达任何经确认符合GB/16886标准基本试验原理且适用于医用有机硅材料的 试验方法均可视为与本标准具有方法学等同性
GB/T16175一2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法 范围 本标准规定了医用有机硅材料的生物学评价试验方法 本标准适用于医用有机硅材料的生物学评价 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分:评价与试验(GB/T16886.1一2001,idtIsO l0993-1;1997 3 GB/T16886 医疗器械生物学评价第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 GB/T16886 3 -1997,idtIsOl0993-3:1992) GB/T16886.5 医疗器械生物学评价第5部分;体外细胞毒性试验(GB/T16886.5一2003 idtISO10993-5:1999 GB/T16886. 6 医疗器械生物学评价第6部分;植人后局部反应试验(GB/T16886.6一1997 idtISO10993-61994) GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验 (GB/T16886.10-2005,IsOl0993-10;2002,IDT) GB/T16886.11医疗器械生物学评价第11部分;全身毒性试验(GB/T16886.1l一1997、 idtISO10993-11:1993 GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品(GB/16886.12 2005,ISO10993-12;2002,IDT) 药典(二部 评价与试验选择 3 总则 1 医用有机硅材料按其预期与人体接触的性质和接触时间按照GB/T16886.1规定的基本原则进行 生物学评价 试验选择 GB/T16886.1中给出了应考虑的评价试验 对于可能影响机体生殖功能的材料,应补充做生殖 和发育毒性试验 样品制备 4.1 总则 试验与对照样品制备应按GB/T16886.12的要求进行 如果试验方案要求使用试验材料的浸提 液,所用浸提介质相浸提条件应与最终产品的特性和使用以及试验目的相适应 在选择没提条件时应 考虑试验材料的理化特性、可溶出物或残留物
GB/T16175一2008 4.2浸提条件 如需制备浸提液,材料与浸提介质比例按GB/T16886.12的规定 常规浸提条件见表1 表1常规浸提条件 浸提温度/C 浸提时间/Ah 浸提设备 37士1 24士2 电热恒温培养箱 37士1 72士2 电热恒温培养箱 50士2 72士2 电热恒温培养箱 电热恒温干燥箱 70士2 24士2 121士2 电热燕汽灭菌器 1士0,l1 注:(37士1)C浸提(24士2)h一般仅用于浸提介质为含血清细胞培养基时 细胞毒性试验 5.1方法提要 本试验系将试验样品接触培养细胞,通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察,评价试验材料对体 外细胞的毒性作用 注:也可采用其他等效的符合GB/T16886.5要求的细胞毒性试验 试剂 氯化钠、氯化钾,氯化钙、硫酸镁,磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、葡萄糖、酚红、台盼蓝,乙二胶 四乙酸二钠(EDTA、胰蛋白酶,Eagle培养基,RPMI1640培养基、胎(小)牛血清,青霉素G(钠盐)、硫 酸链霉素、乙醇、苯酚、二甲基亚碱(DMSO) 5.3主要设备和用具 超净工作台.Co培养箱,恒温水浴箱,电冰箱、倒置显微镜、光学显微镜压力蒸汽灭菌器、抽滤 瓶、磁力搅拌器、培养板(皿、液氮罐或超低温冰箱,天平 细胞株 试验用细胞株可采用ATcCCCCL.1[NCTCcdone929(小鼠成纤维细胞]或其他适宜细胞 试验 采用传代48h72h生长旺盛的细胞 5.5试验前准备 5.5.1器具灭菌 与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力燕汽灭菌器内121C30nmin,或置 电热干燥箱内160C2h 5.5.2无菌室要求 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求 5.5.3细胞培养基、细胞消化液、平衡盐溶液制备 按附录A给出的方法或其他经确认适宜的方法制备 5.5.4试验样品制备 无菌试验材料直接取样试验 未灭菌试验材料宜采用与成品相同的灭菌过程或其他适宜方 5.5.4.1 法灭菌 5.5.4.2需制备浸提液时可采用含血清(或无血清)细胞培养基或质量浓度为9g/L的氯化钠注射液 为浸提介质,制备方法按GB/T16886.5的规定 5.5.5对照品制备 5.5.5.1阴性对照品:可采用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料,例如高密度聚乙烯
GB/T16175一2008 5.5.5.2阳性对照品:可采用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料,例如用有机锡作稳定剂的聚氯 乙烯,质量浓度为5g/儿L的苯酚溶液或体积分数为5%的二甲基亚碱(DMsO)溶液 5.5.5.3需制备浸提液时同5.5.4.2 5.6试验步骤 5.6.1总则 根据试验材料特性选择下列试验中的一种或多种适宜方法进行评价 5.6.2浸提液试验 5.6.2.1四陛盐(NT)比色法 将配制好的1×10'/m细胞悬液接种于96孔培养板,设置空白对照,阴性对照、阳性对照和试验 样品组,每组各设至少6孔,每孔接种100L细胞悬液 置CO培养箱(含体积分数5%二氧化碳气 体,下同)37C培养24后,弃去原培养液 空白对照组加人新鲜细胞培养液,阴性对照组加人阴性对 照品浸提液,阳性对照组加人阳性对照溶液或阳性对照品浸提液,试验样品组加人试验材料浸提液,每 孔100aL,置cO培养箱继续培养72h 注:如采用质量浓度为9g/1的氯化钠注射液为浸提介质时,需使用浓缩培养基将浸提液稀释至规定浓度 72h后,置显微镜下观察细胞形态 每孔加人20aL质量浓度为5g/L的MTT溶液,继续培养 4h后弃去孔内液体,加人150lDMs0,置振荡器上振荡10min,在酶标仪570nm和630nm波长下 测定吸光度,按式(1)计算相对增殖率 NGR=A×100% 式中: RGR 相对增殖率,%; 试验样品组(阴性、阳性对照组)吸光度; 空白对照组吸光度 根据RGR按表2分级判定 阴性对照组的反应应不大于1级,阳性对照组至少为3级反应 如阴 性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验 表2细胞毒性反应分级 级别 相对增殖率/% 100 8099 50~79 3049 029 5.6.2.2显微镜观察法 将配制好的1XI/m上捆胞悬液接种于直径5mm培养皿内,每皿2ml 置co培养箱37C培 养至近汇合单层细胞形成 弃去原培养液 阴性对照组加人阴性对照品浸提液,阳性对照组加人阳性对照液或阳性对照品浸 提液,试验样晶组加人试验材料浸提液,每皿各加2ml 每组平行操作3皿,置CO，培养箱继续培养 72h 注;如采用质量浓度为9g/L的叙化钠注射液为浸提介质时,需使用浓缩培养基将浸提液稀释到规定浓度
GB/T16175一2008 置显微镜下观察,按表3分级判定 阴性对照组应为0级反应,阳性对照组至少为3级反应 如阴 性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验 表3细胞毒性反应分级 级别 反应程度 反应观察 无 细胞形态正常,贴壁生长良好,胞浆内有离散颗粒;无细胞溶解 极轻微 至多20%的细胞呈圆形,疏松贴壁,无胞浆内颗粒;偶见细胞浴解 轻度 至多50%的细胞呈圆形,无胞浆内颗粒;明显可见细胞溶解和细胞间空区 中度 至多70%的细胞呈圆形或溶解 重度 细胞层几乎完全破坏 5.6.3直接接触试验 注;本试验不适宜于极低密度和高密度材料,可能会导致细胞物理性损伤 试验和对照材料应处置成直径为10mm的圆片或表面积约为100mm,接触细胞面为平面 将配制好的1.5×10/mL细胞悬液接种于直径35mm培养皿内,每皿2mlL 置cO培养箱37C 培养至近汇合单层细胞形成 弃去原培养液,每皿加人2mL新鲜细胞培养基 将试验和阴性对照、阳性对照样品分别轻轻放人 培养皿内,每皿放置一片样品,使其沉于皿底与细胞单层直接接触 每组平行操作3皿 置cO培养 箱继续培养48 置显微镜下观察,按表4分级判定 阴性对照组应为0级反应,阳性对照组至少为3级反应 如阴 性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验 表4细胞毒性反应分级 级别 反应程度 反应观察 样品下面和周围区域细胞无异常迹象 极轻微 样品下面有些细胞出现形态异常或退化迹象 轻度 细胞反应区域局限在样品下方范围或超出样品边缘小于5mm 中度 细胞反应区域超出样品下方范围5mm10mm 重度 细胞反应区域超出样品下方范围10mm以上 5 结果评价 在阴性对照和阳性对照产生预期反应的情况下,分析评价试验样品细胞毒性反应程度 5.8试验报告 试验报告中应给出下列信息 试验材料名称; a 批号; b 试验和对照样品制备; C dD 试验用培养基、细胞株制备; 试验步骤 细胞反应和其他情况; g观察结果 h 结果评价
GB/T16175一2008 迟发型超敏反应试验 6 方法提要 本试验包括最大剂量迟发型超敏反应试验和封闭贴敷迟发型超敏反应试验,用以评价试验材料在 试验条件下引发迟发型超敏反应的潜在性 6.2总则 最大剂量迟发型超敏反应试验为首选方法 试验样品如不适宜皮内注射或预期用于制造与皮肤接 触器械的试验材料可选择封闭贴敷迟发型超敏反应试验 试剂 质量浓度为9g/L的氧化钠注射液、新鲜精制植物油、二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene,DNCB) 十二炕基硫酸钠、弗氏完全佐剂 注;本标准各试验中所用新鲜精制植物油推荐采用符合美国药典规定的棉籽油或芝麻油,也可使用其他经验证证 实无生物学毒性反应的植物油 6. 4 主要设备和器具 压力蒸汽灭菌器,电剃刀,天平,动物天平、注射器,研钵 6.5试验前准备 6.5.1器具灭菌 与试验和对照样品接触的所有器具置压力燕汽灭菌器内121c30nmin. 6.5.2试验动物准备 按GB/T16886.10的规定 6.5.3弗氏完全佐剂制备 6.5.3.1无水羊毛脂与液体石蜡的体积比为46(冬季使用比例为3:5) 将无水羊毛脂加热溶解后 取40m置研钵中,稍冷却后边研磨边加液体石蜡，直至60mL液体石蜡加完 置压力蒸汽灭菌器内 121C30min,即制备成弗氏不完全佐剂,4C保存备用 6.5.3.2在弗氏不完全佐剂中按4mg/ml5g/mL加人死的或减毒的分枝杆菌如卡介苗或结核 杆菌),即得弗氏完全佐剂 6.6最大剂量迟发型超敏反应试验 6.6.1浸提介质 质量浓度为9g/L的氯化钠注射液、新鲜精制植物油 6.6.2阳性对照样品 质量浓度为1g/L的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体 6.6. 试验样品制备 3 按GB/T16886.10规定选择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化钠注射 液和植物油浸提液 6.6.4试验步骤和结果评价 按GB/T16886.10一2005的7.4进行操作和评价 6.7封闭贴敷迟发型超敏反应试验 浸提介质 质量浓度为9g/L的氧化钠注射液,新鲜精制植物油 6.7.2阳性对照样品 质量浓度为1g/L的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体 6.7.3试验样品制备 按GB/T16886.10规定制备试验样品 试验材料如不能直接贴敷,应按GB/T16886.10规定选
GB/T16175一2008 择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化钠注射液和植物油浸提液 6.7.4试验步骤和结果评价 按GB/T16886.10一2005的7.5进行操作和评价 6.8试验报告 试验报告中应给出下列信息 a) 试验材料名称; I 批号; c)试验和对照样品制备 d)试验步骤; e 试验部位观察记录; f 结果评价 刺激试验 方法提要 本试验包括皮肤刺激试验,眼刺激试验和皮内反应试验 皮肤刺激试验适用于评价预期与皮肤接 触的材料 眼刺激试验适用于评价预期与眼接触的材料 皮内反应试验系将材料浸提液注人家兔皮 内,适用于评价试验材料在试验条件下对接触组织的潜在刺激性 7.2试剂 质量浓度为9g/L的氯化钠注射液、新鲜精制植物油、质量浓度为50g/L的甲醛溶液 7.3主要设备和器具 压力蒸汽灭菌器、检眼镜、天平、动物天平、动物固定器、注射器 试验前准备 4.1器具灭菌 7 与试验和对照样品接触的所有器具置压力燕汽灭菌器内121C30min 7.4.2试验动物准备 按GB/T16886.10的规定 7.5皮肤刺激试验 7.5.1试验样品制备 按GB/T16886.10规定制备试验样品 试验材料如不能直接贴敷,应按GB/T16886.10规定选 择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/儿的氯化钠注射液和植物油两种浸提液 7.5.2试验步骤 按GB/T16886.10一2005的6.3进行操作,每次与皮肤接触期为24h 阴性对照采用同批浸提介 质,阳性对照采用质量浓度为50g/儿L的甲醛溶液或其他能产生相应阳性反应的材料 7.5.3结果评价 按GB/T16886.102005的6.3进行评价 7.6眼刺激试验 7.6.1试验样品制备 按GB/T16886.10规定制备试验样品 试验材料如不适宜直接与眼接触,应按GB/T16886.10 的规定选择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/I的氯化钠注射液和植物油两种浸 提液 7.6.2试验步骤和结果评价 按GB/T16886.102005的第B.3章进行操作和评价
GB/T16175一2008 7.7皮内反应试验 7.7.1试验样品制备 按GB/T16886.10规定选择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化钠注射 液和植物油两种浸提液 7.7.2试验步骤和结果评价 按GB/T16886.10一2005的B.2进行操作和评价 7.8试验报告 试验报告中应给出下列信息 试验材料名称 n) b) 批号; c)试验和对照样品制备; d) 试验步骤; 试验部位观察记分; f 结果评价 急性全身毒性试验 方法提要 本试验系将试验样品注人小白鼠静脉和腹腔内,在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情 况,以评价试验材料是否具有潜在的急性全身毒性作用 8.2试剂 质量浓度为9越/儿的领化纳注射液.,新鲜精制植物油 8.3主要设备和器具 压力蒸汽灭菌器、动物天平、小白鼠固定器、注射器 8.4试验前准备 4.1器具灭菌 8 与试验和对照样品接触的所有器具置压力燕汽灭离器内121c30mn. 8.4.2试验动物准备 .4.2.1试验采用健康、初成年小白鼠,同一品系并同一来源,雌鼠无孕,体重17g一23g 试验前使 88 小白鼠适应实验室环境 做过本试验的小白鼠不得重复使用 8.4.2.2每种浸提液用小白鼠10只,随机分为试验样品和对照样品两组,每组5只 复试时每组取 18g~19g的小白鼠10只 8.5试验和对照样品制备 按GB/T16886.12规定选择适宜的浸提条件,每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化钠注射 液和植物油两种浸提液 同批号浸提介质作为对照样品 8.6试验步骤 8.6.1样品注射 8.6.1.1自尾静脉分别注人氧化钠注射液浸提液和介质对照液,以不超过0.1ml/s的恒定速度注 射,注射剂量为50mL/kg 8.6.1.2由腹腔分别注人植物油浸提液和介质对照液注射剂量为50mL/kg 8.6.2注射后观察 注射完毕后，观察小白鼠即时反应.并于4h.24h.!8h和72h观察和记录试验组和对照组动物 的一般状态,毒性表现和死亡动物数,在72h时称量动物体重 动物反应观察判定按表5规定
GB/T16175一2008 表5毒性反应观察 症 状 反应程度 正常,无症状 注射后无毒性症状 轻微 注射后有轻微症状但无运动减少,呼吸困难或腹部刺激症 中度 注射后出现明显的腹部刺激症状,抽搐、俯卧、呼吸困难,运动减少,眼脸下垂或腹泻 注射后出现虚脱、发绀,震颤或严重腹部刺激症状,腹泻,眼脸下垂或呼吸困难(体重急剧 重度 下降，一般低于15g 注射后死亡 死亡 8.7结果评价 8.7.1在72h观察期内,试验组动物的反应不大于对照组动物,则判定试验样品无急性全身毒性 反应 8. .7.2如试验组动物有2只或2只以上出现中度毒性症状或死亡,3只或3只以上出现体重下降超过 10%,则判定试验样品有急性全身毒性反应 .7.3如试验组动物出现轻微毒性症状,或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡,或虽无毒性症 状但组内动物体重普遍下降,则另取小白鼠10只为1组进行复试,复试结果符合8.7.1要求,判定试验 样品无急性全身毒性反应 8.8试验报告 试验报告中应给出下列信息 a) 试验材料名称 B 批号; c)试验和对照样品制备; 注射剂量; d) 动物反应情况 f 结果评价 亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性试验 方法提要 本试验通过将试验样品植人动物体内或注人动物静脉、腹腔、皮下、皮内或肌内,在规定试验周期 内，测定试验样品一次或多次接触对试验动物的影响,以评价试验材料是否具有潜在的亚急性(亚慢 性)或慢性全身毒性作用 注也可呆用其他符合GB;/T16886.11要求的亚忽性(亚慢性)和慢性全身毒性试验 本试验可设计成与植人试 验结合进行 9. 2 试剂 质量浓度为9g/L的氧化钠注射液、新鲜精制植物油 9 主要设备和器具 压力蒸汽灭菌器、动物天平、注射器 9 试验途径选择 试验接触途径应尽可能与试验材料的临床应用相关,可选择下列适宜途径进行试验 植人途径适用于植人材料; a D)静脉途径适用于直接或间接液路或与血液接触的材料 腹腔途径适用于液路或与腹腔接触材料以及不宜静脉途径接触的试验样品; c
GB/T16175一2008 皮下途径适用于皮下接触方式有利于评价材料毒性作用时; d) e)皮内途径适用于皮内接触方式有利于评价材料毒性作用时; 肌内途径适用于肌内接触方式有利于评价材料毒性作用时 D) 9.5试验组设定 9.5.1每一种试验样品应设立试验样品组和对照组 对照组动物除了不接触试验样品,其他处置方式 应与试验组动物完全一致 9.5.2除植人途径外,其他接触途径的试验样品组一般宜设高、中、低3个剂量水平组,也可采用适宜 的单剂量组试验(即限度试验) 选择剂量水平时应考虑临床接触剂量与安全应用因素,如采用加严剂 量组时应考虑下列参数: -临床接触表面积的倍数; 接触周期的倍数 浸提分数或具体化学物的倍数; 24h接触期的倍数 注:与经典的化学物全身毒性试验不同,医用材料一般不会产生剂量反应作用,因此高剂量水平不一定必须产生毒 性作用 然而,试验所采用的剂量范围宜提供有效的人体安全性极限评估 9.6试验前准备 器具灭菌 9.6.1 与试验和对照样品接触的所有器具置压力燕汽灭菌器内121C30min 9.6.2试验动物选择 9.6.2.1应按GB/T16886.11的要求选择试验动物 植人途径首选家兔,静脉、腹腔,皮下,皮内、或 肌内途径接触首选小白鼠或大白鼠 试验应采用健康、初成年动物,同一品系并同一来源,雌性动物未 产并无孕 家兔体重在2.0kg一3.0kg范围内;啮齿动物最好在离乳后6周龄内,不大于8周龄;犬最 好4月6月龄,不大于9月龄;试验开始时,所用动物体重差异应不超过平均体重的士20% 每一试 验剂量组需要的动物数量根据试验目的来确定,推荐的动物种属和每剂量组最少动物数量见表6. 表6动物种属和数量 试验类型 非啮齿类动物(如家兔、犬 咽齿动物如小白鼠、大白鼠 亚急性毒性 10只(雕,雄各5只)" 6只(雌,雄各3只)y" 亚慢性毒性 20只(雕,雄各10只)" 8只(雕、雄各4只)" 慢性毒性 0只(雌,雄各20只)" 亦可采用单一性别动物,如预期试验材料仅用于女性时,试验应采用雌性动物 采用加严剂量组时动物数量可减少至雌、雄各10只 慢性毒性试验动物的数量应能保证可以对试验结果进行适当的统计学评价 9.6.2.2应在试验前使试验动物适应实验室环境 试验和对照样品制备 9.7.1采用植人方式时按GB/T16886.6的规定制备适宜的试验和对照样品 g.7.2采用静脉注射途径时选择适宜的浸提条件,可用质量浓度为9g/L的氧化钠注射液制备试验样 品 同条件制备浸提介质对照液 9.7.3采用腹腔、皮下,皮内注射途径时选择适宜的浸提条件,根据试验评价目的可用质量浓度为 9g/L的氧化纳注射液和(或)植物油制备试验样品 同条件制备浸提介质对照液 9.7.4采用肌内注射途径时选择适宜的浸提条件,可用质量浓度为9g/儿L的氯化钠注射液制备试验样 品 同条件制备浸提介质对照液
GB/T16175一2008 9.8试验步骤 9.8.1试验接触 9.8.1.1体内植人时按GB/T16886,6和本标准第12章的规定进行 对照组可植人阴性对照样品" 或不植人对照样品仅进行与试验样品相同的手术步骤 9.8.1.2静脉、腹腔、皮下,皮内或肌内注射途径接触时,试验样品组和介质对照组分别自动物的静脉、 腹腔、皮下、皮内或肌内注人试验样品和介质对照液 单次静脉快速注射时一般在1min内注射完毕 亦可根据试验样品具体情况采用慢速注射,大白鼠静脉注射速度通常不超过2mL/min 各动物种属 最大注射剂量体积见表7 表7最大注射剂量体积 动物种属 静脉注射体积/(mL/kg腹腔注射体积/mL/kg皮下注射体积/mL/kg肌内注射体积/ml/kg 50 小白鼠 50 50 20 大白鼠 40 20 兔 10 10 20 10 犬 20 注，啃齿动物肌内注射时推荐小白鼠每一注射点不超过 0.1ml,大白鼠每一注射点不超过 0.2mL 9.8.2接触周期 9.8.2.1除植人途径外,其他接触途径一般每周7d进行试验操作,较长期接触试验也可根据试验样 品具体情况每周操作5d. 9.8.2.2亚急性全身毒性试验接触周期为l4d28d,静脉接触时大于24h,但小于14d 亚慢性全 身毒性试验接触周期啃齿动物通常为90d,其他种属动物不超过其寿命期的10%,静脉接触时为 14d一28d 慢性全身毒性试验接触周期一般为6个月12个月 g.8.3接触后观察 9.8.3.1体重和饲料,水消耗 试验接触前及试验终结时应测量体重,试验期间至少每周测量一次动物体重 必要时长期接触试验应考虑测定饲料和水的消耗量 9.8.3.2临床观察 每日观察和记录试验样品组和对照组动物的一般状态,如皮肤、被毛,眼和黏膜改变,以及呼吸、循 环、自主和中枢神经系统、躯体运动神经活动性和行为表现等状况 必要时,在接触试验样品之前和试 验期间对高剂量组和对照组动物进行眼科检查,如发现有眼部改变迹象时应检查全部试验动物 记录死亡的动物数并及时进行尸检,垂死动物及时隔离并处死 9.8.3.3临床病理学检查 应根据试验样品预期毒性作用,在试验接触周期内和(或)接触终结时,选择进行下列适宜的检查 项目 血液学方面,包括;凝血(PT,APTT)、血红蛋白浓度、血细胞比容、,血小板计数、红细胞计数、 a) 白细胞计数和白细胞分类计数等; b)临床血液生化方面,包括电解质平衡、碳水化合物代谢和肝、肾功能 某些试验样品由于其特 定的作用模式,可能还需测定白蛋白、ALP,ALT、AST、钙、氯化物、胆固醇、肌酸酥,GGT、葡 萄糖,无机磷、钾,钠、总胆红素、总蛋白、甘油三酯、尿氮、各种酶类等 需评价免疫毒性时可 考虑测定总免疫球蛋白水平 注;可根据试验接触周期确定适宜的检查次数如试验周期为26周时在试验进行到13周时安排检查一次 尿液检验不作为常规检验,仅在预期或观察到有这方面的毒性反应的情况下才考虑进行 检验时 在试验接触的最后一周在一定时间间隔内(如16h~24h)采集尿液,推荐检验的项目包括外观、胆红 10
GB/T16175一2008 素、尿糖、酮体、隐血、蛋白、沉渣、比重或渗量、尿量等 9.8.3.4大体病理学检查 试验终结时,将全部试验动物无痛处死后进行大体尸检,包括体表及体表开孔、头部,胸腹腔及 内脏等 将试验动物的肾上腺、脑、附睾、心脏、肾、肝、卵巢、脾、睾丸、胸腺和子宫在取出后尽快称量其湿重 根据试验材料预期作用途径选择需进一步进行组织病理学检查的器官或组织,取下后置于适宜的固定 液中 9.8.3.5组织病理学检查 应对高剂量组和对照组动物的器官和组织进行完整的组织病理学检查 应对全部显示有大体损害迹象或尺寸改变的器官和组织进行检查 如设有中、低剂量组,应对动物肺脏进行组织病理学检查是否有感染迹象,还应考虑对中、低剂量组 进行肝、肾组织病理学检查,高剂量组如显示损害迹象应进行器官组织病理学检查 9.9结果评价 9.9.1列表给出各种试验数据,并采用适宜的统计学方法对数据进行分析评价 分析评价试验接触剂量与毒性反应产生的相关性、异常反应的发生率和严重程度包括行为和 临床性异常、大体损害、显微镜下改变、靶器官的鉴别,死亡率、以及任何其他有意义的一般性和特异性 反应 g.10试验报告 试验报告中应给出下列信息: a)试验材料名称 b 批号; c)试验动物 d 试验和对照样品制备 试验步骤 e f 观察记录; g)结果评价 热原试验 1 10.1方法提要 本试验系将试验样品注人家免静脉，在规定的时间内观察家兔体温升高的情况，以评价试验材料 是否具有潜在的致热作用 10.2试剂 质量浓度为9g/几的无菌无热原氯化钠注射液 10.3主要设备 超净工作台、电热干燥箱、电热恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器,热原测试仪、动物天平、注射器、家兔 固定器 10.4试验前准备 10.4.1 器具除热原 与供试液接触的所有玻璃器皿置电热干燥箱内180C干烤至少2h,或250C干烤至少30nmin 也 可采用其他适宜的方法除热原 10.4.2测温器具 家兔体温测试应使用精密度为士0.1C的热原测温仪或肛门体温计 1l
GB/T16175一2008 10.4.3实验室环境 10.4.3.1在试验前1d~2d,供试用家兔应处于同一温度环境中,实验室和饲养室的温度相差不得大 于5C，实验室温度应为17C28C 10.4.3.2在试验全过程中,室温变化应不大于3C,避免噪音干扰 10.4.4试验用家兔 按药典二部附录XMD的规定挑选试验用兔 10.5试验样品制备 按第4章中的规定选择适宜的浸提条件,采用质量浓度为9g/L的无菌无热原氧化钠注射液制备 试验样品 10.6试验步骤 按药典(二部)附录ID的规定进行,家兔注射剂量为10mL/kg 10.7结果评价 试验样品经初试或复试后符合药典(二部)附录D的规定时,判定试验材料无致 热作用 试验报告 10.8 试验报告中应给出下列信息: 试验材料名称; a) b) 批号 e)试验样品制备 d 注射剂量 e)家兔体温记录" 结果评价 f 11 遗传毒性试验 注:也可采用其他经确认符合GB/T16886.3要求的遗传毒性试验 11.1鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验) 11.1.1方法提要 本试验是在有或无代谢活化系统的情况下,通过试验样品诱导组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌 的突变情况,以评价试验材料潜在的致突变性 本标准推荐的是平板掺人法 注:其他信息参见OECD导则471 11.1.2主要设备 超净工作台,电热干燥箱,恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、压力燕汽灭菌器,低温高速离 心机、低温冰箱(一80C)或液氮罐、匀浆器 11.1.3活化系统,培养基和试剂 试验用活化系统(S9和S9混合液),培养基和试剂按附录B的规定制备或购买市售产品 1.1.4菌株及其鉴定和保存 11.1.4.1菌株 本试验用于测试试验样品诱变性时应至少采用四个菌株,本试验推荐五株鼠伤寒沙门氏菌突变菌 株:TA98,TAl00,TA1535、TA1537、TA1538 适当时也可采用其他菌株,如TA97、TAl02等 11.1.4.2菌株特性 菌株特性应与表8相符 突变型菌的某些特性易丢失或变异,在下列情况下应鉴定菌株的基因型 a 在收到培养菌株后; b 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时; 12
GB/T16175一2008 当每皿自发回变数不在正常范围时; d)当对诱变剂丧失敏感性时; 使用主平板传代时; e f 投人使用前 表8菌株鉴定结果 基因型 菌株 自发回变菌落数" 组氨酸 脂多糖 R因子 urB 缺陷" 屏障缺失 抗氨芋青霉素 修复缺陷" TA98 30~50 十 TAl00 120~200 TA1535 0一35 X X TA1537 3~28 725 TA1538 “十"表示需要组氨酸 “十”表示有抑制带 “十"表示具有R因子 “十”表示无修复能力 该数值为参考值,可在验证的基础上确定本实验室的规定数值范围 1.1.4.3菌株鉴定方法 11.1.4.3.1 增菌培养 125 在5mL营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物，于(37士2)C、(115!/min r/min)振荡培养 10h~12h 11.1.4.3.2组氨酸缺陷型的鉴定 加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸),不加组氨酸者每100ml底层培养基 中加0.5mmolD生物素0.6mL;加组氨酸者每100mL底层培养基中加L-组氨酸(每100ml中含 0.4043g)1ml和0.5mmolD生物素0.6mL,冷却至50C左右,各倒两个平皿 接种;取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个,按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线)接种 在培养基表面,37C培养48h 结果判定;五株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜,无组氨酸培养基平皿上除自发回变 菌落外无菌膜,说明受试菌株确为组氨酸缺陷型 11.1.4.3.3脂多糖屏障缺陷的鉴定 加热融化营养肉汤培养基 接种;取菌液0.lml移人平皿,迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷却至50C左右)适量倒人平皿.,混 匀,平放凝固 将一片无菌滤纸片放人已凝固的培养基平皿中央,用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶 紫溶液10AL,37C培养24h,每个菌株做一个平m 结果判定:阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带,说明存在rha(深粗型)突变 TA98、TAl00、 TAl535、TA1537、TA1538均有抑制带,野生型鼠伤寒沙门氏菌没有抑制带 13
GB/T16175一2008 11.1.4.3.4R因子的鉴定 加热融化营养肉汤琼脂培养基,冷却至50C左右,适量倒人平皿中,平放凝固,用移液器吸0.8%氨 节青霉索10lL,在凝固的培养基表面依中线涂成一条带,待氨节青霉素溶液干后,用接种环与氨乍青 霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株,并且接种一个不具有R因子的菌株作氨节青霉素抗性的对照 -个平皿可同时鉴定几个菌株),37C培养24h 结果判定;菌株经过24h培养,在氨节青霉素带的周围依然生长不受抑制,即有抗氨节青霉素效 应,证明带有R因子 11.1.4.3.5uvrB修复缺陷型的鉴定 在营养肉汤琼脂培养基平皿表面用接种环划线接种需要的菌株 接种后的平皿一半用黑纸覆盖 在距15w紫外线灭菌灯33cmm处照射8s,37C培养24h 结果判定;对紫外线敏感的菌株仅在没有照射过的一半生长 11.1.4.3.6自发回变率的测定 准备底层培养基平皿.8个 融化顶层培养基8管,每管2mL..在45C水浴中保温 在每管顶层培养基中,分别加人待鉴定的试验菌株菌液0.1ml,一式两份,轻轻摇匀,迅速将此试 管的内容物倾人已固化的底层培养基平皿中,转动平皿,使顶层培养基均匀分布,平放固化,37C培养 48h计数菌落数 结果判定:每一菌株的自发回变率应落在表8所列正常范围内 11.1.4.4菌株保存 鉴定合格的菌种应保存在深低温如-80C)或加人9%光谱级DMsO作为冷冻保护剂,保存在液 氮条件下(一196C),或者冰冻干燥制成干粉,4C保存 除液氮条件外,保存期一般不超过2年 主平 板贮存在4C,超过两月后丢弃 1.1.5试验前准备 11.1.5.1器具灭菌 与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸汽灭菌器内121C30min,或置 电热干燥箱内160C2h 11.1.5.2无菌室要求 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求 11.1.6试验样品制备 11.1.6.1采用质量浓度为9g/L的氯化钠注射液为浸提介质制备试验样品时选择适宜的浸提条件， 宜制备高、中,低三个剂量组或适宜的单剂量组 注:9.5.2给出了剂量水平选择信息 11.1.6.2采用DMso制备试验样品时.浸提比例应加倍,在(37士1)C条件下浸提(24士2)h. 注:由于DMso对细菌有毒性作用,试验时加液体积减半 11.1.7对照样品制备 11.1.7.1阴性对照 同批号试验材料浸提介质,不加试验材料同条件制备 11.1.7.2阳性对照 每 一试验菌株推荐的诱变剂和浓度见表9所列,适当时也可采用其他已知诱变剂 14
GB/T16175一2008 表9诱变剂 试验菌株 阳性对照 诱变剂浓度 TA98 Dexon(pdimethylaninobenzenediazosulfonicAcidSodiumSalt) 用无菌注射用水配制 l.0mg/ml Dexon(pdimethylaminobenzenediazosulfonieAeidSodiumSalt)1.0mg/ml,用无菌注射用水配制 TA100 2-氨基坊 0.1mg/mL,用DMso配制 TAl535 叠氮化纳 1.0mg/mlL,用无菌注射用水配制 TA1537 1.ommg/ml用无菌注射用水配制 Dexon(pdimmethylaminobenzenediaz0osulfonieAeidSodiumSalt) 2-氨基坊 .,用DMso配制 0.lmmg/ml TA1538 2-硝基坊 1.0mg/ml,用DMsO配制 注:诱变剂可配制为10倍贮备液,分装在具塞玻璃试管内2C一8C贮存,临用时稀释至上述浓度 11.1.8试验菌液制备 取营养肉汤培养基5mL,加人无菌小三角瓶或无菌试管中,将主平板或冷冻保存的菌株培养物接 种于营养肉汤培养基内,在37C士2C,(115r/min~ n~125r/min)振荡培养10h~12h至对数增长期,活 菌数不少于1×10"/mL 培养瓶用黑纸包裹,以防光线照射细菌 11.1.g9预试验试验步骤 1.1.9.1对未知或怀疑可能对试验菌株有抑制作用的试验样品,应进行预试验 11.1.9.2预试验步骤如下 融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2mL.,在45C水浴中保温 在每管顶层培养基中 分别加人按11.1.8制备的试验菌株新鲜菌液0.1ml,一式两份,轻轻摇匀,迅速将此试管的 内容物倾人已固化的底层培养基平皿中,转动平皿,使顶层培养基均匀分布,平放固化 取无 菌滤纸圆片直径为6mm)放在已固化的顶层培养基的中央位置上; 用移液器分别取0.1mL试验材料氧化钠浸提液和(或)0.05mLDMsO试验材料浸提液点在 纸片上 同a)法操作,阴性对照组加人0.1mL氯化钠注射液和(或)0.05mLDMsO;阳性对照加人 10.0mg/mlDexon0.1ml; 37C培养48h72h观察结果 dD 除阳性对照外,试验样品和浸提介质平皿应无抑制区域 如对试验菌株有抑制作用,可通过 11.1.9.3 稀释调整至无毒性浓度 主试验(平板掺入法)试验步骤 11.1.10.1融化顶层培养基分装于无菌小试管,每管2ml,在45C水浴中保温 在保温的顶层培养基中依次加人每种试验菌株新鲜菌液0.1ml混匀;试验样品组分别加 叙化钠浸提液利(或>0.05mLDMIso浸提液,每组三管,活化组再加10%S9混合液0.5mL. m 无活化组加0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5ml 再混匀,迅速倾人底层培养基上,转动平皿使顶层培养 基均匀分布在底层上,平放固化 11.1.10.3阴性对照组分别加人0.1ml氯化钠注射液和0.05mlDMSsO,活化组再加10%S9混合 液0.5ml,无活化组加0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5ml 阳性对照组分别加表9列出的诱变剂 活化组再加10%S9混合液0.5ml,无活化组加0.2mol/L磷酸盐缓冲液0.5ml 阴性及阳 0.lml 性对照组分别设三个平行皿,其他步骤同1l.1.10.2 1.1.10.4全部平皿置37C培养48h一72h观察结果 15
GB/T16175一2008 11.1.11 结果评价 计数并记录每一平皿的回变菌落数,计算出三个平行皿的平均值 11.1.11.2阴性对照组回变菌落数应在预期的范围内(见表8),阳性对照组回变菌落数应至少为预期 范围见表8)的3倍,否则对不在范围内的菌株应重新试验 11.1.11.3在背景生长良好条件下,试验样品组变异频率比阴性对照至少增加两倍即回变菌落数 >2×阴性对照数)即为阳性反应 如回变菌落数的增加与剂量相关并具有统计学意义,或者至少在一 个剂量水平出现可重复的并有统计学意义的阳性反应时,即可认为试验材料为Ames试验阳性物质 11.1.12试验报告 试验报告中应给出下列信息: a)试验材料名称 D) 批号; e)试验和对照样品制备; 试验用菌株; 试验步骤" e f 每皿计数和每组回变平均菌落数; g)结果评价 11.2小鼠淋巴瘤细胞突变试验 11.2.1方法提要 本试验是在有或无代谢活化系统的情况下，通过试验样品诱导小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk+/-3.7.2C)基因正向突变情况以评价试验材料潜在的致突变性 本标准推荐的是微孔板法 注:其他信息参见OECD导则476 1.2.2主要设备 超净工作台,co培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、电冰箱、倒置显微镜,光学显微镜、压力蒸 汽灭菌器、抽滤瓶、磁力搅拌器 11.2.3活化系统,培养基和试剂 11.2.3.1试验用活化系统(S9混合液)参照附录B的规定制备或购买市售产品 1.2.3.2RPMI1640培养基按附录B的规定制备 1.2.3.3THMG将THG溶液按附录B的规定制备 11.2.4细胞株 11.2.4.1细胞株 推荐使用小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Yk-3.7.2C) 经过传代培养后,细胞呈对数生长状态但 细胞持续培养最多不超过3个月 鉴于细胞性状稳定性要求,试验细胞株最好新取自冻存细胞 细胞 在35C38C振荡培养,增殖周期为10h左右 11.2.4.2细胞自发突变清除 应适时检查冻存细胞的自发突变率 当细胞突变率偏高时,按下列步骤对自发突变细胞进行清除 将对数生长的细胞配制成2×10个/mL,加人100倍的THMG液,加人量为总体积的1% 置cO培养箱(含体积分数5%二氧化碳气体,下同)培养24h; g"离心5min,除去上清液,加人新鲜RPMI1640培养基,细胞密度调整为 b 培养24h后以200" 2×10个/mL 加人100倍的THG液,加人量为总体积的1% 培养45h~48h,注意避免 过度培养; 将培养后的细胞以200g离心5min,除去上清液后加人冻存液，细胞密度调整为2×1o 个/mL5×10个/mL 分装于冻存管中冻存 16
GB/T16175一2008 11.2.4.3支原体污染检测 在制备冻存细胞液之前以及准备丢弃过期的细胞之前进行支原体的检测,以保证在细胞培养周期 中无支原体的污染 支原体污染的检测可以采用直接培养法或间接Hoechst染色法 11.2.4.4核型稳定性检测 通过检测平均染色体数目来判断核型稳定性,通常在细胞生长周期过程中和准备丢弃过期的细胞 之前进行,以保证在细胞培养周期中没有发生核型的变化 核型分析,包括染色体分带在制备冻存细胞 液前进行 11.2.5试验前准备 11.2.5.1器具灭菌 与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸汽灭菌器内121C30min,或置 电热干燥箱内160C2h 11.2.5.2无菌室要求 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求 11.2.6试验样品制备 可采用无血清RPM1640培养基或质量浓度为9g儿的氧化钠注射液等其他适宜溶剂作为浸提 介质,选择适宜的浸提条件,宜制备高、中,低三个剂量组 也可根据细胞毒性预试验的相对存活率进行 剂量设计，一般在相对存活率为阴性对照组的20%一80%范围内设三个剂量组 注:9.5.2给出了剂量水平选择信息 对照样品制备 11.2.7 11.2.7.1阴性对照 同批号浸提介质 11.2.7.2阳性对照 无活化系统采用甲磺酸甲酯(methylmehanesulphonate.MAMs),新鲜配制,浓度为104g/mL;有 活化系统采用7,12-二甲基苯煎[7,12-dimethylbenza)anthracene,DMBA],浓度为2.5g/mL 也可 采用其他适宜的阳性对照品 11.2.8试验步骤 11.2.8.1接触处理 取生长良好的细胞,调整细胞密度为1X10'/mL 无活化系统组取10mL细胞悬液与9mL试验 或对照样品以及150mmol/L氯化钾溶液1mL混合;有活化系统组取10mL细胞悬液,加人9mL试 验或对照样品以及S9混合液1mL 将上述各种混合液置于50mL带盖离心管中37C振荡培养4h, 振荡频率为70r/min一80r/min 11.2.8.2表达 将上述各种混合液以200只离心5min,去除上清液,用无血清RPMI1640培养基洗涤细胞两次 重新悬浮于RPMI1640培养基中,调整细胞密度为3×1o个/mL,37C培养2d 于24h时检查细胞 密度并调整为3×10个/mL 11.2.8.3平板制备 按下列方法制备各组微孔平板: PE,(0天的平板接种效率)平板取11.2.8.1接触处理后的细胞悬液,梯度稀释至细胞数量为 a 8 3个/ml接种96孔板,每孔加0.2ml即每孔平均细胞接种数为1.6个) 每种剂量接种两 块平板 b)PE.(第2d的平板接种效率)平板;第2d表达培养结束后,取适量细胞悬液,按a)所述方法接 种96孔板,每种剂量接种两块平板 TFT拮抗平板:第2d表达培养结束后,取适量细胞悬液,调整细胞密度为l×10'个/mL,加 17
GB/T16175一2008 人TFT(三氟胸苷,终浓度为34g/mL),混匀,接种96孔板,每孔加0.2mL(即每孔平均细胞 接种数为2000个) 每种剂量接种两块平板 将全部平板放置于cO培养箱37C培养12d 11.2.8.4集落计数 目视观察计数各平板无集落生长的孔数 突变集落按大集落(LC:直径>1/4孔径,密度低)和小 集落(SC直径<1/4孔径,密度高)分别计数,极小集落可再继续培养3d后计数 11.2.9数据处理 平板效率(PE 和PE, 11.2.9.1 一lnEW/TW PE= 式中: PE 平板效率,PE 或PEa; EW 无集落生长的孔数; TW 平板总孔数; -每孔接种细胞数 1.6 11.2.9.2相对存活率 PE RS X×100% PE on 式中: RS 相对存活率,%; PE 试验样品组PE平板效率; PE -对照组PE 平板效率 1.2.9.3IFT抗性突变频率(MIF 拨式(4)分别计算大集落突变频率(L.MF).小集落突变频率(SMF)和总突变频率(TMF) -nEwTw/" MF×10看= PE 式中: MF -TFT抗性突变频率; EW 无集落生长的孔数 TW 平板总孔数; -每孔接种细胞数,2000; PE PE 平板效率 11.2.9.4小集落突变百分率(SCM CM(%)=(s一MF)/(T一MF 5 11.2.10结果评价 试验成立条件;阴性对照的PE在60%~l40%范围内,PE在70%~130%之间,T-MF小于本实 验室历史记录的2倍(或一240×10-6)小集落突变百分率在30%一60%范围内,阳性对照T-MF与阴 性对照有显著差异,或比阴性对照高100×10-"以上 否则应重新进行试验 在试验成立的前提下,试验样品各剂量组T-MF出现有统计学意义的剂量反应性增长,或至少有 一个剂量组T-MF与阴性对照有显著差异,或比阴性对照高100×10-以上并具重现性,为阳性结果 11.2.11试验报告 试验报告中应给出下列信息: a 试验材料名称 b 批号; 18
GB/T16175一2008 试验和对照样品制备; c) d) 细胞株名称; 试验步骤; o D 数据处理; 结果评价 g 11.3体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 11.3.1方法提要 本试验是在有或无代谢活化系统的情况下,将培养细胞与试验样品接触后再用中期分裂相阻断剂 如秋水仙素和秋水仙胶)处理,以抑制处于有丝分裂中期阶段的细胞 然后呆集细胞并分析中期细胞 染色体畸变情况,以评价试验材料潜在的致突变性 注;其他信息参见OECD导则473 11.3.2主要设备 超净工作台,cO 培养箱,恒温水浴箱、电冰箱,倒置显微镜、光学显微镜、压力燕汽灭菌器、抽 滤瓶 11.3.3活化系统、培养基和试剂 试验用活化系统(S9混合液)按照附录B的规定制备或购买市售产品 11.3.3.1 11.3.3.2RPMI1640培养基按附录A的规定制备 11.3.3.3Hanks液、胰蛋白酶液按附录A的规定制备 11.3.4细胞株 可选用仓鼠肺细胞(CHL)或仓鼠卵巢细胞(CHO),推荐首选CHL 需按照11.2.4.3和 11.2.4.4的方法定期检查试验所用细胞核型和有无支原体污染 细胞应置于一80C或液氮冻存 1.3.5试验前准备 11.3.5.1器具灭菌 与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸汽灭菌器内12130min,或置电热干燥 箱内160c2h 11.3.5.2无菌室要求 无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求 11.3.6试验样品制备 浸提介质可选用无血清RPMIl640培养基或质量浓度为9g/L的氯化钠注射液等其他适宜的溶 剂,选择适宜的浸提条件,宜制备高,中,低三个剂量组 或高剂量采用50%细胞生长抑制剂量,中、低 剂量采用倍数稀释剂量 注l:9.5.2给出了剂量水平选择信息 注2如采用DMs0为浸提介质,使用时浓度应不大于0.5% 11.3.7对照样品制备 11.3.7.1阴性对照 同批号浸提介质 11.3.7.2阳性对照 无活化系统可采用甲磺酸甲酯methylrmethanesulphonate，MMS、甲磺酸乙酯ethyl mmethanesulphonate,EMS),乙基亚硝基脉(ethylnitrosourea)、丝裂霉素c(mitomyeinC),4硝基憧啾 N氧化物(小uirounolincNoxside);有活化系统可采用苯并(a)芭[len(a)pyrne],环睛酷股 cyclophosphamide) 也可采用其他适宜的阳性对照品 采用50%细胞生长抑制剂量为试验剂量 19
GB/T16175一2008 11.3.7.3空白对照 如不能证实所用浸提介质不具有致突变性,还应设空白对照 1.3.8试验步骤 11.3.8.1预试验 对未知细胞毒性反应的试验样品和阳性对照材料应进行预试验,以确定50%细胞生长抑制剂量 试验步骤参照第5章中试验方法进行 11.3.8.2接触处理 试验在加人或不加人s9的条件下进行 按下列步骤操作 a)试验前一天,将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)内,置于CO培养箱内培养; 吸去培养m《瓶)中的培养液,加人试验或对照样品,.S9混合液(不加S9混合液时,需用培养液 b 补足、以及不含血清的RPM1640培养液,置于培养箱中 有活化系统接触8h,无活化系统 接触24h; 吸去培养皿(瓶)中的液体,用Hanks液洗细胞3次,加人含血清RPMI1640培养液,置于培养 箱中.于24h收获细慰 于收获前2h一4h加人绸胞分裂中期阻断剂(如秋水仙素,作用时间 为4h,终浓度为14g/mL) 11.3.8.3收获细胞与制片 按下列步骤进行 消化:用胰蛋白酶液消化细胞,待细胞脱落后加人含血清RPMI1640培养液终止胰蛋白酶作 a 用,混匀,放人离心管内以1000r/min1200r/min离心5min7min,弃去上清液; 低渗;加人0.075nmol/儿氯化钾溶液7mL,用滴管将细胞轻轻地吹打混匀,放人37C水浴中 低渗处理7min,加人2ml固定液(甲醇;冰醋酸,3:1)混匀 以1500r/min离心5min~ 7nmin,弃去上清液; 固定;加人7mL固定液,混匀后固定7min,以1500r/min离心7min,弃去上清液 同法再 固定12次,弃去上清液; 滴片;加人数滴新鲜固定液混匀 用混悬液滴片,自然干燥; d 染色;用姬姆萨染液染色; ee 镜检:在光学显微镜下每一试验组至少选择100个分散良好的中期分裂相(染色体数为2n士2) fD 进行染色体畸变分析 分析时应记录每一观察细胞的染色体数目,对于畸变细胞还应记录显 微镜视野的坐标位置及畸变类型 11.3.9数据处理 将结果数据按每试验组列表显示 计算指标包括细胞畸变数、染色体结构异常百分率、各剂量组及 对照组不同类型染色体异常数与频率等 分裂细胞数应分别统计，一般不包括在总异常频率中 对染 色体畸变细胞率用检验进行统计学处理,以评价试验样品的致突变性 11.3.10结果评价 试验成立条件:阴性对照组染色体畸变率在正常范围内(小于4.9%),阳性对照组染色体畸变率应 大于10.0% 否则应重新试验 在试验成立的前提下,以下两种情况下可判定试验材料在本试验系统中在具有致突变性 a)试验样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义,并有与剂量相关的增加 b)试验样品在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义并有可重复性的阳性反应 11.3.11试验报告 试验报告中应给出下列信息 20
GB/T16175一2008 a)试验材料名称 b) 批号; e)试验和对照样品制备 细胞株名称; d e)试验步骤; f 数据处理; 结果评价 g 植入试验 12 12.1方法提要 本试验系将试验样品植人动物皮下、肌肉或骨组织内,通过观察植人后试验样品周围组织反应程 度,以评价试验材料的组织相容性 注本试验还可设计为同时对试验材料的亚急性(亚慢性)毒性作用进行评价 12.2试剂 戊巴比妥钠、硫喷妥钠、2%碘酊、75%乙醇溶液、质量浓度为9g/L的氯化钠注射液 12.3主要设备和用具 压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱、切片机、显微镜常规外科手术器械、穿刺针、骨钻 12.4试验前准备 器具灭菌 12.4.1 与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121C30min或电热干燥箱内160C2h 12.4.2试验动物准备 按GB/T16886.6的规定选择适宜的试验动物 12.5试验途径选择 试验接触途径选择应按GB/T16886.6的规定,可根据试验材料的临床应用和材料特性选择适宜 的组织部位 12.6试验和对照样品制备 按GB/T16886.6的规定制备相应尺寸的皮下、肌肉或骨植人样品 将植人样品清洗干净后沥干 采用适宜方法灭菌,植人前用质量浓度为9g/L的无菌氯化钠注射液浸洗 12.7试验步骤 12.7.1动物麻醉和消毒 动物麻醉可采用质量浓度30g/儿戊巴比妥钠或质量浓度20g/L硫喷妥钠,亦可采用其他适宜麻 醉剂 按外科常规手术要求以2%碘和75%乙醇溶液消毒试验区域 注，推荐的动物麻醉方法;家兔用质量浓度30g/L戊巴比妥钠静脉注射1.0m/kg,或质量浓度20g/儿硫喷妥纳 静脉注射1.3mL/kg一2.5mL/kg;大白鼠、小鼠和家兔用质量浓度20g/I戊巴比妥钠腹腔注射2.3mL/kg; 大白鼠用质量浓度10E儿梳喷紧销静脉或腹腔注射豆.0nmL./ke- ~10.0mlL/kg 12.7.2皮下组织植入试验 根据试验所用动物选择下列之一方法: a)背部植人:按GB/T16886.6中规定方法进行 可用手术刀片切开植人点皮肤用止血钳分 离皮下组织,在一个皮肤切口制备一个或数个皮下囊,囊的底部距离皮肤切口应约为10mm 以上,每个囊内放置一个植人物,植人物之间应不能互相接触 用医用缝合线缝合皮肤切口 亦可用穿刺针与皮肤成30"角刺人皮下,取一探条插人针头内将试样推人皮下组织内 注:套针植人法对试验部位组织的创伤轻微,可降低由于手术创伤造成的对试验结果的干扰 21
GB/T16175一2008 b 颈部植人采用小白鼠时，在骶骨上方用手术刀片切一10mm长的切口,用止血钳向颈部开 -隧道,通过隧道向颈部推人植人物并使之固定 采用大白鼠时,在颈部两侧分别植人一个 对照植人物和试验样品植人物,植人物之间应不能互相接触 离开植人物一段距离用适宜的 缝合线封闭植人隧道，以防止植人物移动 12.7.3肌肉植入试验 按GB/T16886.6中规定方法进行 优先采用套针植人法,可用手术刀片切一很小的切口,亦可直 接用穿刺针刺人皮肤内,用探条将样品推人深度约1cm的肌肉内 采用手术植人法时,切开植人点皮 肤后分离皮下组织和筋膜,用止血钳分离肌肉,将样品推人肌肉内 用医用缝合线缝合肌筋膜和皮肤切 口 植人时如有过量出血,应选择另一位置植人 12.7.4骨植入试验 按GB/T16886.6中规定方法进行 采用常规手术操作切开植人部位皮肤,用止血钳分离组织暴 露出股骨或胫骨的皮质,采用低转速间歇地在骨上钻孔,操作时用质量浓度为9g/L的无菌氯化钠注射 液和吸引器充分灌洗,以免过热使局部组织坏死 植人前将孔扩至所需直径或用丝锥攻出螺纹 柱状 样品用手按压植人,螺纹状样品用器械按预定转距旋紧到位并记录该转距 用医用缝合线缝合肌筋膜 和皮肤切口 12.8结果观察 12.8.1临床观察 植人后1d、3d和5d观察植人点皮肤反应,有无出血、红肿和样品排出等异常现象 在植人周期 内每天观察动物的一般状态 记录死亡的动物数并及时进行尸检,垂死动物及时隔离并处死 12.8.2解剖观察 12.8.2.1按GB/T16886.6中规定,根据试验材料评价需求确定适宜的植人周期 植人后一般可于 2周、4周.12周.26周或更长周期时分别无痛处死试验动物切取包裹样品周围约0.5cm一1.0cm的 组织,将切下的组织块置质量分数为10%的甲醛溶液中固定 注:甲醛溶液用质量浓度为9g/1的氯化钠溶液进行10倍稀释 12.8.2.2肉眼观察植人部位组织有无异常病变 12.8.3组织病理学检查 12.8.3.1将固定后的组织石蜡包埋后切片,进行HE和VG染色,在光学显微镜下观察 每只动物每 -植人期至少各观察三片试验样品和对照组组织切片 比较试验样品与对照品周围组织反应,宜评价 的生物学反应指标包括: -纤维化、纤维囊腔和炎症程度; 由组织形态学改变而确定的变性 材料、组织界面炎性细胞类型,即嗜中性白细胞、淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性白细胞、巨噬细胞和 多核细胞的数量及分布; 根据核碎片和或)毛细血管壁的破裂情况确定是否存在坏死 其他组织改变,如血管分布、脂肪浸润、肉芽肿和骨形成; 材料变化,如破裂、纤维存在,降解材料残留物的形态和物质 -对于多孔和降解植人物,定性、定量测定长人材料内的组织 对于降解(吸收性)试验材料,在试验中期或接近完全降解水平阶段取出的组织样品内宜还存在一 些降解植人物的残留材料 对骨内植人物,要特别关注组织与试验样品之间界面反应情况 应评价骨接触部位和植人物周围 骨的数量以及其间的非钙化组织,注意骨吸收和骨形成情况 22
GB/T16175一2008 12.8.3.2推荐的炎性反应分级见表10. 表10炎性反应分级 级别 炎性反应 试验样品周围未见炎性细胞 试验样品周围仅见极少量淋巴细胞 试验样品周围可见少量嗜中性粒细胞和淋巴细胞,偶见多核异物巨细胞 试验样品周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应,并可见组织细胞、吞噬细胞、毛细血 川 管和小血管 12.8.3.3推荐的纤维囊腔形成分级见表11 表11纤维囊腔形成分级 级别 纤维囊腔形成 囊壁较薄,由少量胶原纤维和12层纤维细胞组成 囊壁有变薄而致密趋势,由少量胶原纤维细胞组成,偶见纤维母细胞 试验样品周围形成囊腔结构,主要由纤维母细胞、胶原纤维和少量纤维细胞组成 试验样品周围形成疏松的囊壁,可见毛细血管和纤维母细胞 注，如试验设计为同时对试验样品的亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性作用进行评价,应按照GB/T16886.11中相 关方法和本标准第9章的规定增加相应项目的检查 12.9结果评价 分析比较各植人期试验样品与阴性对照品之间组织反应的差异,综合评价试验样品与活体组织间 的生物相容性 12.10试验报告 试验报告中应给出下列信息: a)试验材料名称; b) 批号; c)试验步骤; d 临床观察情况; 解剖观察情况 e 组织病理学观察结果; fD 结果分析和评价 g 13 溶血试验 注:其他血液相容性试验方法见GB/T16886.4 13.1方法提要 本试验系将试验样品与血液直接接触,通过测定红细胞释放的血红蛋白量以评价试验材料的体外 溶血程度 13.2试剂 草酸钾、质量浓度为9g/L的氯化钠注射液、新鲜抗凝兔血 注:采集时间不超过24h的新鲜枸橡酸钠抗凝人体全血如经验证确认适用时可替代兔血用于本试验 13.3主要设备 电热恒温水浴、分光光度计、离心机、天平 23
GB/T16175一2008 13.4试验样品制备 13.4.1称取试验样品15g 管类材料切成约0.5em长小段;其他类型材料切成约0.5cm×2cm条 状或相应大小块状 13.4.2如为低密度材料或其他不适宜采用试验样品15g的情况下,可按GB/T16886.12规定的浸 提比例制备试验样品,管类材料切成约0.5cm长小段;其他类型材料切成约0.5em×2cm条状或相 应大小块状 13.5新鲜稀释抗凝兔血制备 根据试验用血量由健康家兔心脏采血 如采血10mL,加质量浓度20g/L草酸钾溶液0.5m,制 备成新鲜抗凝兔血 取新鲜抗凝兔血8mL,加质量浓度9g/L的氯化钠注射液10mL稀释 13.6试验步骤 13.6.1试验样品组每管加人试验样品5g,或是在13.4.2的情况下按GB/T16886.12规定的浸提比 阴性对照组每管加人氧化钠注射液10ml;阳性对照 例加人试验样品,再加人氯化钠注射液101 组每管加人蒸溜水10ml 每组平行操作3管 13.6.2全部试管放人恒温水浴中37C士1C保温30min后,每支试管加人0.2ml稀释兔血,轻轻混 匀,置37C士1C水浴中继续保温60min. 13.6.3倒出管内液体以800尽离心5min. 13.6.4吸取上清液移人比色皿内,用分光光度计在545nm波长处测定吸光度 13.7结果计算 试验样品组和对照组吸光度均取3管的平均值 阴性对照管的吸光度应不大于0.03，阳性对照管 的吸光度应为0.8士0.3,否则应重新试验 试验样品溶血率按式(6)计算 三×100% 二 HR= 式中: HR 试验样品溶血率,%; -试验样品组吸光度; B -阴性对照组吸光度; -阳性对照组吸光度 13.8结果评价 试验样品溶血率小于5%符合本试验要求 13.9试验报告 试验报告中应给出下列信息 a) 试验材料名称; I 批号; c)试验步骤; d)各组吸光度; e)试验样品溶血率; f结果评价 214
GB/T16175一2008 附 录A 资料性附录 细胞培养常用溶液和培养基制备 A.1平衡盐溶液(Bss)制备 A.1.1按表A.1配方准确称量各种试剂 表A.1常用Bss配方 单位为克每升 DHanks 试剂 PBS Earle Hanks NaC 8.00 6.80 8.00 8.00 Kcl 0.20 0.40 0.40 0.40 CaC 0.20 0.14 0.20 0.20 MgsO7Ho NaHPOH.O 1.56 0.06 0.06 NaH,PO2H.O 0.14 KHPO 0.20 0.06 0.06 NaHCO 2.20 0.35 0.35 葡萄糖 1.00 l.00 0.02 0.02 酚红 0.02 A.1.2配制方法 配制BsS时应注意避免钙、镇离子的沉淀.下面以Halks液为例说明ss配制步猴 a)按表A.1配方精确称量试剂,如含水分子与配方不同,应换算后称量， b) 先将氯化钙溶解在100ml.水中,其他试剂依次溶解在750ml.水中 e)用数滴质量浓度为56g/L的碳酸氢钠溶液溶解盼红 d)将氯化钙溶液缓缓倒人上述750ml试剂溶液中,并不时搅动,防止出现沉淀 随即加人酚红 溶液后,移人1000mL容量瓶内，加水至刻度; a 分装后置压力蒸汽灭菌器内115C灭菌30min,4C保存 注:细胞培养用溶液所用的水均指使用玻璃蒸僧器新鲜制备的三次蒸水 A.2消化液制备 A.2.1胰蛋白酶溶液(质量浓度为2.5/L 2.5g 胰蛋白酶粉 D-Hanks液 1000mL 充分搅拌溶解后过滤除菌,分装人瓶,置冷冻箱内保存 使用前置37C水浴箱内溶解,用质量浓度 为56g/L的碳酸氢钠溶液调节pH至7.2左右 .2.2乙二胺四乙酸二钠(ED1A)溶液 8.0 氯化钠 g 氯化钾 0.2g 1.15g 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 0.2g 25
GB/T16175一2008 EDTA 0.2g 1000 nml 将前四种试剂溶解后加人EDTA,搅拌溶解,过滤除菌或置压力蒸汽灭菌器内115C灭菌30min 分装人瓶,4C保存 A.3四陛盐(MTT)染色液制备 MTT 0.5 5g 100mL PBS液 搅拌溶解,置压力蒸汽灭菌器内ll5C灭菌30n 4C保存 min， 细胞培养基制备 A.4.1RP\MII1640培养基 RPM1640干粉培养基 规定剂量 碳酸氢钠 规定剂量 L谷氨酰胺(根据包装袋上说明添加 规定剂量 水 1000ml 将培养基干粉溶于总量1/3的水中搅拌溶解后补加水至1000ml 根据包装袋上说明添加碳酸 氢钠和L谷氨酰胶,搅拌溶解 加人抗生素,最终浓度为青霉素100U/ml链霉素100g/ml 过滤 除菌,分装后4C保存 使用前加人胎牛血清(或小牛血清)100mL/儿L,p调至7.2~7.4 26