GB/T36780-2018
辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPeppermildmottlevirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数22页
- 文件大小1.38M
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辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T36780一2018 辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法 DeteetionanlidentifieationofPeppermildmottlevirs 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T36780一2018 次 目 前言 范围 2 规范性引用文件 3 病毒基本信息 原理 仪器、用具及试剂 5.1仪器 5.2用具 5.3试剂 取样 6.1种子取样 6.2生长期植株取样 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 7.2斑点酶联免疫吸附测定 7.3胶体金免疫层析测定 7.4RT-PCR检测 7.5实时荧光RT-PCR检测 7.6接种反应 结果判定 样品保存与结果记录 9.1样品保存 9.2结果记录 附录A资料性附录辣椒轻斑驳病毒其他信息 附录B规范性附录双抗体夹心酶联免疫吸附测定 附录c(规范性附录)斑点酶联免疫吸附测定 附录D(规范性附录胶体金免疫层析测定 附录E规范性附录RT-PCR检测 ? 附录F(规范性附录实时荧光RT-PCR检测 15 16 附录G(资料性附录种子感染水平和取样量 17 附录H资料性附录接种反应 19 参考文献
GB/36780一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:检验检疫科学研究院、天津出人境检验检疫局、中华人民共 和国甘肃出人境检验检疫局
本标准主要起草人:魏梅生、郭京泽,朱水芳、孔君、李桂芬、赵文军、王军平,文朝慧、尤佳
GB/36780一2018 辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法 范围 nildlmotnleuirus 本标准规定了辣椒轻斑驳病毒(Peppe”mi s)的检疫鉴定方法
本标准适用于寄主植株和未处理种子上辣椒轻斑驳病毒的检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 病毒基本信息 学名Pep/r" mildmottlezuirus 缩写:PMMoV 中文名;辣椒轻斑驳病毒 异名;烟草花叶病毒潜隐株系;烟草花叶病毒Samsun潜隐株系 分类地位;植物杆状病毒科(irgairidae),烟草花叶病毒属(Tobamovirus P\MMoV的其他信息参见附录A
原理 P\MMoV的蛋白和基因组特征是该病毒检测鉴定的依据
采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定 DAs-ELISA、斑点酶联免疫吸附测定(Dot-ELISA、胶体金免疫层析测定、RT-PCR实时荧光 RT-PCR等方法来特异性检测该病毒,并判断样品是否带有PMMoV
PMMoV的侵染性是该病毒生物学活性的重要指标
采用生物学接种的方法来判断病毒的活性
5 仪器、用具及试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g)
高速冷冻离心机(最大转速15000r/min) 小型瞬时离心机(最大转速7000r/nmin).
普通冰箱(4 超低温冰箱(一80C 制冰机(每日制冰能力为110kg). 旋涡振荡器(最大转速2800r/min) 磁力搅拌器(搅拌容量50ml~2000ml.
GB/T36780一2018 高压灭菌锅(最大压力为0.235MPa,可调控温度范围为105C~135) pH计量程0.00~14.00,精度士0.01) 超净工作台(高效滤膜可除去99.99%以上的0.3m粒子). PCR仪(温度范围499,控温精度士0.25). 微波炉(烧烤型 电泳仪(输出电压5V600V,输出电流2mA200mA. mm×150mmm×90mm 电泳槽(长度×宽度×高度为310 凝胶成像分析仪(光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板,UV干涉滤光片、 机载图像捕捉软件、图像分析软件). 酶标仪(波长范围340nm一850nm). 5.2用具 酶联板
可调移液器(2.5L、10L、20l、100Al、200L、1000l)
可调移液器头
离心管
研钵、,微型磨杵等
5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAS-ELISA试剂见附录B Dot-ELIsA试剂见附录c
胶体金免疫层析测定试剂见附录D. RT-PCR检测试剂见附录E 实时荧光RT-PCR检测试剂见附录F
o 取样 6.1种子取样 6.1.1防交叉污染 依据取样的大小,按种子的千粒重,取出小样的分量
取样时要避免交叉污染,保持设备、台面、容 器、手等的清洁
6.1.2待测种子的取样 种子的取样和病害的感染水平有关,为确保种传病害检测到的概率为95%或99%,可根据病害的 感染水平或健康的容许水平来确定取样大小,具体可参见附录G
为保证感染水平在0.1%以上的病种子检测到的概率为95%,辣椒种子的最少取样量为3000粒种 子,每个小样的量最多为250粒种子
可根据种子的千粒重来推算出所取样品的重量
6.2生长期植株取样 在植物的生长前期或中期,从具有典型花叶或斑驳症状的植株上采集叶片
GB/36780一2018 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加人已包被PMMoV抗体的酶联板中,进行DAs-EIISA检测
每个样品平 行加到两个孔中
健康的植物组织作为阴性对照,感染PMMoV的植物组织作为阳性对照,样品提取 具体操作见附录B
缓冲液作为空白对照;其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致
7.2斑点酶联免疫吸附测定 斑点酶联免疫吸附测定,见附录C 7.3胶体金免疫层析测定 病叶中病毒的检测也可采用胶体金免疫层析测定,见附录D. 7.4RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照
分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录E
如采用商品化一步法试剂盒,则按照 试剂盒说明进行
7.5实时荧光RI-PC检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照
分别提取样品 和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录F
如采用商品化 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行
7.6接种反应 接种反应参见附录H
结果判定 8 样品检测流程及结果判定按下述原则进行 酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阳性,同时RT-PCR(或实时荧光RT-PCR)的检测 结果为阳性,则判定样品携带PMMoV -酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阴性,则判定样品不携带PMMoV
样品保存与结果记录 g.1样品保存 经检测确定携带PMMoV的样品应在适合的条件下保存以备复核
种子应干燥低温保存,活体的 病株在隔离温室中保存,其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80C冰箱中
做好登记和标记工 作,保存期限至少1年
9.2结果记录 记录包括样品来源,种类、检测时间,地点、方法和结果、检测人员签字
DAs-ELISA检测应有酶 联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图
GB/T36780一2018 附录 A 资料性附录 辣椒轻斑驳病毒其他信息 A.1 寄主范围 自然寄主主要为辣椒属植物(Capsicumspp.)
番茄和光姻草(Nicotianaglauca)之外的多数茄科 植物易感染该病毒
PMMoV感染莺色黎(Chenopodium r)和昆诺阿藜(C.qguimoa)引起 anaranticolor 局部腿绿斑,无系统感染
感染曼陀罗(Daua.srumwniwm),心叶烟(Niwuian4luadin 白肋烟 1oSq、 N.tabacumcev.whiteBurley)、枯斑珊西烟(N.abacumcev.Xanthine),林烟草(N.syestris)产生局部 坏死斑,无系统感染
感染Capsicum.chacoense,C.praetermissumn" 引起严重的顶部坏死
A.2危害症状 引起辣椒植株矮化,叶片轻微褪绿,果实变小、畸形、斑驳
有时果实上出现凹陷坏死区域
A.3分布 美国,加拿大、墨西哥、丹麦、冰岛、英国、法国、比利时、希腊、意大利荷兰、西班牙,捷克、匈牙利、保 加利亚、埃及、塞内加尔,赞比亚,埃塞俄比亚、南非、突尼斯、阿根廷、苏里南,巴西、委内瑞拉、安提瓜和 巴布达、巴巴多斯、海地、牙买加,蒙塞拉特岛、圣卢西亚、特立尼达和多巴哥,巴拿马、澳大利亚、新西兰、 土耳其、以色列、日本、韩国、
A.4传播方式 病毒可通过种子和机械接种传播,介体不易传毒
病毒通过辣椒种子传播,病毒存在于种皮的外 部,基本上不侵染胚乳
种传率在22%一29%,种子收获贮藏后种传率下降
病种子、植株病残体和带 病毒的土壤是病毒重要的侵染来源
幼苗在田间移栽的过程中,容易被感染 A.5粒体形态 病毒粒体直杆状,大小为312nm×12nm,粒体中央有明显轴心
病毒蛋白亚基螺旋排列,螺距为 2.3nmm
A.6基因组 单分体基因组,正单链RNA,基因组RNA由6357个核苷酸组成
共有4个ORF,编码4个蛋 白,分别为126kDa,183kDa病毒复制酶、30kDa细胞间移动蛋白和17.5kDa病毒外壳蛋白
GB/36780一2018 致病型 辣椒属植物中有l、Ll",L、L,L等抗性基因
烟草花叶病毒属病毒能否克服L基因介导的抗 性,由病毒的致病型所决定,烟草花叶病毒属病毒有P、P,P.2,P.2.、P.3..等5种致病型
已发现 PMMoV有P.a,P.3.,P.a..等3种致病型,分别能够系统侵染带有L,L,L抗性基因的辣椒
GB/T36780?2018 ? 淶??) ??? B.1? B.1.1?? ?б??塣 B.1.2 ??塣 B.1.3?? ???塣 B1.4 (pNPP). B.1.5??? PBST 1.3 (NasO g ?PvP,?24000?40000) 20g NaN, 0.2g pH7.4,4C档 B.1.6? ?(Na.CO. 1.59g ?(NaHHCO. 2.93g (NaN, 0.2g pH9.6,??1L,4C档 B.1.7PBST?(??? 8.0 ?NaCI g Na,HPO) 1.15 g (KH,PO.) 0.2g ?(KCD) 0.2g -20Tween-20) 0.5ml pH7.4,?1L B1.8????? PBST L
GB/36780一2018 2.0" 牛血清白蛋白(IESA)或脱脂奶粉 聚乙烯毗咯炕酮PVP,相对分子质量2400040000) 20.0g 叠氮化钠(NaN.) 0.2g 调pH至7.4,4C储存
B.1.9底物(pNPP)缓冲液 氯化镁MgCl, 0.lg 叠氮化钠NaN. 0.2g 97mL 二乙醇胺 用盐酸调pH至9.8,蒸溜水定容至1L,4储存
B.2程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,l00L/孔,加盖,37C孵育2h,清空孔中溶 液,PEBST洗涤3次,每次3min. B.2.2样品制备 待测样品按1:10(即1g样品加10m抽提缓冲液)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,2000r/min 离心10min,上清即为制备好的检测样品
阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行
B.2.3加样 加人制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100L/孔,加盖,4C冰箱孵育过夜,取出的酶联板 用自来水彻底冲洗,再用蒸僧水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min B.2.4加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100AL/孔,加盖 37C孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗,再用蒸水洗涤1次,PBsT洗涤3次,每次3min
B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为lmg/ml(现配现用),按1004L/孔,加人到酶联板 中,室温避光孵育
B.2.6读数 在不同的时间内如30 1h,2h,或更长时间,用酶标仪在405nm处读OD值,或用肉眼观察显 min、 色情况
B.3结果判断 B.3.1对照孔的OD值(缓冲液孔阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即 缓冲液孔和阴性对照孔的oD值小于0.15,当阴性对照孔的OD值小于0.05时,按0.05计算; 阳性对照oD值与阴性对照oD值之比为5一10;孔的重复性基本 一致
GB/T36780一2018 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下 样品OD值与阴性对照OD值明显大于2,判为阳性;样品OD值与阴性对照OD值之比在 囤值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品OD值与阴性对照OD值之 比明显小于2,判为阴性
B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/36780?2018 ? C 淶??) ??? C.1? c.1.1?? ?????0.45m C.1.2? ??塣 c.1.3?? ???,?????,???? C.1.4 ?(NBT 5--4--3-(BCIP C.1.5PBs? ?NaCI 8.0g (NaHP(O 1.15 g (KH.PO 0.2g (KcI g 0,2 pH7.4,?1L C.1.6PBST?(??? PBS? -20(Tween-20 0.5ml C.1.7?? 5.0 ?? g PBST? 100ml C.1.8?? 12.1 ???(Tris) g ?(NaCI) 8.0g ?(Mg(Cl 0.l g pH9.0,?1L
GB/T36780一2018 C.2 程序 C.2.1 样品制备 待测样品按1;20即1g样品加人20ml
PBS缓冲液)加人PBS缓冲液,用研钵研磨成浆 2000r/min离心10min,上清即为制备好的检测样品
阴性对照、阳性对照作相应的处理
C.2.2点样 在硝酸纤维素膜上用铅笔画加样方格(5mm×5mm),在方格内分别点人2.5AL的检测样品、阴 性对照和阳性对照,晾干
并做好标记
C.2.3封闭 膜在封闭缓冲液中37C振荡孵育1h
C.2.4加第一抗体 用封闭缓冲液稀释抗体,加人工作浓度的第一抗体,37C振荡孵育1h
PEBST缓冲液洗涤3次 4次,每次3min. C.2.5加酶标第二抗体 加人工作浓度的酶标第二抗体,37C振荡孵育1h
PBST缓冲液洗涤4次5次,每次3min
c.2.6加底物显色 在10mL底物缓冲液中加人66L.浓度为50mg/mL
的NBT(溶于70%的二甲基甲酰胺中)和 3L浓度为50mg/mL的BCIP(溶于100%的二甲基甲酰胺中)混匀
室温避光条件下,将膜在其中 振荡孵育,待充分显色后,用蒸儡水漂洗终止反应
C.3结果判断 当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品出现紫色斑点,则检测结果为 C.3.1 阳性
C.3.2当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品未出现紫色斑点,则检测结果为 阴性
0
GB/36780一2018 录 附 D 规范性附录 胶体金免疫层析测定 D.1试剂 D.1.1PBST样品抽提缓冲液pH7.4 亚硫酸钠(Na.SO. 1.3长 聚乙烯毗咯婉酮(PVP,相对分子质量2400040000 20发 氯化钠(NaCI &.0g 磷酸氢二钠(Na,HPO. .l5x 磷酸二氢钾(KH,PO) 0.2g 氯化钾KCI 0.2& 吐温-20(Tween-20) 0.5ml 溶于蒸憎水中,定容至1L D.1.2Iris-HCl样品抽提缓冲液pH8.2 三胫甲基氨基甲炕(Tris) 1.2g 亚硫酸钠(NaSO. 1.3g 氯化钠(NaCI 8.0g 氯化钾(KCI) 0.2 g 聚乙烯毗咯炕酮PVP,相对分子质量2400040000) 20g ween-20 0.5m 吐温-20(Tw 溶于蒸圜水中,用盐酸调pH至8.2,定容至1L
D.2操作步骤 样品制备方法同B.2.2
测试前将试纸条恢复至室温
将试纸条含胶体金复合物的一端插人到样品中,样品液不要超过胶 min20min 体金试纸条上的Max线
测试观察的时间以10 为好,对于病原浓度低的样品可适当延 长至30min 或更长的时间
D.3结果判断 D.3.1质控C线显紫红色,测试T线也显红色,检测结果为阳性(图D.l. D.3.2质控C线显紫红色,测试T线未显色,检测结果为阴性(图D2). D.3.3质控c线和测试丁线均未显色,说明试纸条失效.检测结果无效
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GB/T36780一2018 C线 T线 Max线 图D.1阳性(+)结果 C线 T线 Max纱 图D.2阴性(一)结果 D4贮存 试纸条应在2C8C冰箱内密封干燥保存
使用时注意未用的试纸条密封
以免吸湿而失效
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GB/36780一2018 附录 E 规范性附录 RT-PCR检测 E.1试剂 E.1.1核酸提取试剂 Trizol或RNA提取试剂盒 E.1.2电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲炕(Tris 242g 57.1m 冰乙酸(CHO. 7.2以 乙二胺四乙酸二钠(NagEDTA2H.O) 双蒸水定容至1000mL,用时稀释至1×TAE E.2检测步骤 E.2.1 核酸提取 称取0.1lg样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5ml离心管中,加人1ml的Trizol 12000; ;4C 试剂,剧烈振荡3min; r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5ml氯仿
猛烈振荡15sr4C12000; r/min离心15min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积异丙 醇,混匀;室温静置10min;412000r/min离心10min,弃上清;加人1mL.75%的冷乙醉洗涤沉淀 4C10000 r/min离心10 nmin,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30ALDEPC处理过的水中， -20C保存备用
注:此处核酸提取也可按照商品化RNA提取试剂盒进行操作
E.2.2引物序列 正向引物(PMMoV-f)5'-AGAACTcGGAGTcATcGGAC3'; 反向引物(PMMaV-)5'" '-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3'
扩增片段长度:576bp
E.2.3反转录 反应体系;20AL;在0.2mLPCR管中加人总RNA14L,dNTPs(10mmol/L)1AL,DEPC处理过 的水10AL反向引物PMIMoV-r(20mol/L2AL.70C保温5min;冰上放置5mim;再加人5×反转 录缓冲液4AL,RNA酶抑制剂(40U/AL)1AL,.M-MLV(200U/pHL)1AL,42C保温1h,得到cDNA 后用作PCR的模板
设置阳性对照,阴性对照及空白对照
E.2.4CR扩增 反应体系:20!L;在0.2mLPCR管中加人10×PCR缓冲液(含Mg+)2AL,dNTPs(10mmol/L) 0.6AL,正向引物PMMoV-及反向引物PMMoV-r(均为20mol/L)各0.5L,TaqDNA聚合酶 13
GB/T36780一2018 2U/L)1AL,模板2L和DEPC处理过的水13.4Ml
设置阳性对照、阴性对照及空白对照
反应程序;94c5min;94C30s,5230s,721min ,35个循环;727 Imin
E.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNA片段作为分子量 标记,进行电泳
电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄记录
E.3结果判定 阳性对照在576bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,测定序列比对为PMMoV的,可判定为阳性
阳性对照在576bp左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,可判定结果为 阴性
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GB/36780一2018 附录 F 规范性附录 实时荧光RT-PCR检测 F.1试剂 核酸提取试剂同E.1.1
-步法实时荧光RT-PCR试剂
F.2引物探针 上游引物(PMMoV-F);5'-TTAGATTTcCC'TGCTACTGGTTTCAA-3' 下游引物(PMMoV-R):5'-CAGTTGTAGGATTTTGCGG.ATTT-3' 探针(PMMoV-Probe):5'-FAM-TGTcGGCACTTCTcGGAGCC'TTTG;TAMRA-3 F.3核酸提取 方法同E.2.1 F.4实时荧光RT-PCR反应 反应体系:0.2mL离心管中加人2×一步法实时荧光RT-PCR试剂缓冲液皿10L,E.rTaqHS 5U/AL)0.4AL.反转录酶混合液0.4AL.,PMMoV-F(10mol/L)0.4l,PMNMaV-R(10mol/L) 0.4AL,PMMoV-Probe(10mol/L)0.6AL,ROX参比染料0.4AL,模板RNA2AL,补DEPC处理过的 水至20L
设置阳性对照、阴性对照及空白对照
反应程序;45C10min,95C10min;9515s,601min,共45个循环 F5结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照C值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的C'值多40时,判定P\MMoV阴性 待测样品的ct值<35时,判定PMNMoV阳性
待测样品的C值小于40且大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的c值>40,判定 PMMoV阴性;如果重新测试的C值小于40且大于35,且分离曲线明显时,则判定结果为阳性
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GB/T36780一2018 附 录 C 资料性附录) 种子感染水平和取样量 种子的取样量见表G.1
表G.1种子的取样量 样品量/粒 感染水平/% 95%概率 99%概率 0.0 29960 46050 14980 23 020 0,02 0.05 5990 9210 0.1 2990 4600 1500 0,2 2300 0,5 600 920 300 460 150 230 50 10 16
GB/36780一2018 附 录 H 资料性附录 接种反应 H.1试材 H.1.1抽提缓冲液 氯化钠(NaCl 8.0g 磷酸氢二钠(Na,HPO 1.15" 0.2 磷酸二氢钾KHlPO 8 溶于1L蒸水,调pH至7.27.4
121C,高压灭菌15min. H.1.2指示植物 辣椒轻斑驳病毒的指示植物心叶烟(Nicotianaglutinsa)或枯斑珊西烟(Nicotianatabacumcv. XanthiNN),需在光照充分,温度为20一25C的条件下培育
选择具有5片6片真叶,长势良好 的植株
H.2接种 H.2.1抽提样品的接种 样品按1;10(即1g样品加人10ml抽提缓冲液)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆
每个抽提 样品接种2株植物,每株接种2片叶
将320目的金刚砂撒在指示植物植物的叶片上
在叶片上加 1滴接种物(100L200AL),用带手套的手指轻抹
接种不同的样品手套要同步更换,或者用碱性肥 皂将手彻底洗干净
接种后立即用自来水冲洗植株
H.2.2阳性和阴性对照的接种 辣椒轻斑驳病毒病汁液或提纯的病毒等可作为阳性对照
样品抽提缓冲液或用健康样品的抽提液 可作为阴性对照
接种方法同H.2.1 H.3培养 接种后的植物在温度为20C25,不少于12h的光照条件下,生长5d7d
温度高于28C 不利于发病显症
H.4结果检查 辣椒轻斑驳病毒接种心叶烟或枯斑珊西烟会产生枯斑
若接种的样品在叶片上产生大量的枯斑,并且阴、阳性对照正常,则这些枯斑是可信的
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GB/T36780一2018 若仅出现个别枯斑,则需将枯斑加少量的抽提缓冲液重复接种,以确认病毒的侵染性
通常情况下 由病毒侵染形成的枯斑再次接种时,会产生大量的枯斑
必要时可用ELISA确认接种的结果
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辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法GB/T36780-2018
背景
辣椒是一种常见的蔬菜作物，具有很高的营养价值和经济价值。然而，由于病毒等病害的侵袭，辣椒的产量和质量都会受到很大的影响。因此，在对辣椒进行种苗培育、生产、流通等环节中，进行病毒检测尤为重要。
GB/T36780-2018标准
GB/T36780-2018标准规定了针对植物病毒进行检疫鉴定的技术要求、方法和程序。该标准主要适用于对进口和出口植物及其种子进行检疫鉴定，以及对植物材料的科学研究。
辣椒轻斑驳病毒
轻斑驳病毒是辣椒上的一种常见病毒病害，会导致植株生长缓慢、叶片变黄、花期推迟等现象。因此，在辣椒的生产和流通过程中，对轻斑驳病毒进行检测尤其重要。
GB/T36780-2018标准下的鉴定方法
根据GB/T36780-2018标准，对辣椒轻斑驳病毒的检疫鉴定应遵循以下步骤：
- 采集样本：在辣椒植株发病初期采集叶片和茎部样本。
- 提取核酸：将样本中的核酸提取出来，可以使用RNA或DNA提取试剂盒。
- PCR扩增：将提取出的核酸进行PCR扩增，利用引物检测是否存在轻斑驳病毒。
- 结果分析：根据PCR扩增的结果，判断样本中是否存在轻斑驳病毒。
总结
GB/T36780-2018标准下的辣椒轻斑驳病毒检疫鉴定方法能够有效地提高农业检疫工作者的检测水平，保障农产品质量和安全。在辣椒的生产和流通环节中，建议广泛应用该标准，加强对轻斑驳病毒的检测和防控。
