鸭病毒性肠炎诊断技术

鸭病毒性肠炎诊断技术

国家标准 GB/T22332一2008 鸭病毒性肠炎诊断技术 Diagn0stictechniquesforduekvirusenteritis 2008-08-22发布 2008-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22332一2008 前 言 本标准部分技术采用OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2004)推荐的试验方法,并把具体操作 程序予以细化 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位华南农业大学、广东出人境检验检疫局 本标准主要起草人:郭霄峰、廖明洪洁心
GB/T22332一2008 鸭病毒性肠炎诊断技术 范围 本标准规定了鸭病毒性肠炎病毒(DVEV)分离和鉴定及聚合酶链式反应(PCR)试验的诊断技术 要求 本标准适用于鸭病毒性肠炎的诊断 临床症状和病理变化 家养的鸭和雏鸭从7日龄至成年均可感染发病 在易感鸭群,初始症状通常为突发持续性高死亡 现象,产蛋量明显下降 由于感染禽的品种、年龄、性别以及病毒毒力的不同,暴发鸭病毒性肠炎 DVE)后临床症状、剖检病变有很大的差异 种鸭临床症状为流泪,怕光、烦渴、缺乏食欲,共济失调、 水样腹泻和流鼻液 通常病鸭羽毛蓬乱,肛门粘有污物 病鸭借助翅膀支撑方能保持平衡,整个外观虚 弱、精神沉郁 但2周一7周龄鸭中损失比成鸭低,其症状为脱水、体重下降,喙呈蓝色,肛门染有血迹 剖检时发现,死亡的鸭并不消瘦 性成熟的公鸭的阴茎可能脱垂 性成熟母禽的卵巢滤泡出血 特征性大体病变以血管受损,带有组织出血和体腔游离血液,消化道粘膜表面有环状出血和白喉样损 坏,淋巴样器官受损,实质器官呈退行性病变为特征 白色北京鸭的特征性病变是血管及内脏器官损 伤,消化道上皮细胞出现嗜酸性核内包涵体和胞浆内包涵体 病毒分离 3.1材料准备 1.1病料的采集:一般应在感染初期或发病急性期从濒死期禽或活禽采取 濒死期禽采集肝、脾、脑 3 等组织样品 活禽用灭菌的棉拭子涂抹泄殖腔 带有分泌物的棉拭子放人每毫升含有1000IU青霉 素,l0004g链霉素,pH7.27.6的磷酸盐缓冲液(PBS)中 送检病料应置于50%的甘油生理盐 水中 3.1.2病料的保存;采集的样品若在48h内处理,可于4C保存;否则应放一20C以下保存(一70C 贮存最好). 3.1.3病料的处理:将棉拭子充分捻动、拧干后除去拭子 样品液经3000r/min4C离心30min,取 上请液作为接种材料 组织样品先用pH7.2- -7.有的s副成了信-10信乳剂.auoymm1C离心 30min 1,取上清液作为接种材料 为防止细菌污染,可在样品液中加人青霉素(100oIU/mL),链霉素 10004g/mL.),卡那霉素(10004g/mL.),37C温箱中作用30min 进行无菌检验 3.1.4鸭胚:10日~11日龄的非DVE疫苗免疫鸭 3.2实验操作 3.2.1胚胎接种;取经处理并且无菌检验合格的样品以0.2ml/胚的量经绒毛尿囊膜接种10日~ 11日龄的非DVE疫苗免疫的鸭胚,每个样品接种4个5个胚,于38C38.5C恒温箱中孵育 72h前每天照胚1次一2次,以后每天照胚5次 弃去72h前死亡的胚胎,冻存72h~120h内的死胚 或活胚 病毒收获;无菌收取72h一120h内的死胚或活胚的皱毛尿囊膜和尿囊液， -20C保存备用 如第一代分离结果为阴性,需盲传三代
GB/T22332一2008 PCR 4.1引物 P1:GAGcGTATTTAGTAGAAAcTGc(上游 P2:TGAATGTTGTGATTGTTc(下游) 4.2病毒核酸的抽提 4.2.1组织样品用pHH7.2一7.6的PBS制成5倍10倍乳剂,3000r/min4C离心30min,上清液作 为待检材料 4.2.2取一支1.5ml的指形管,加人400L待检胚液或4.2.1上清液和30L(20mg/mL)核糖核 酸酶,混匀后,室温下作用20nmin 4.2.3加43L10%的十二烧基碱磺酸钠溶液和5L(10mg/mL)蛋白酶K.42C水浴温育过夜 4.2.4加等量的Tris-盐酸饱和盼(pH7.6),充分混匀,12000r/min离心5nmin,小心吸出上层水相于 另一个指形管中 4.2.5加等量的盼-三氯甲烧-异戊醇(25:24:1),充分混匀,12000r/min离心5min,小心吸出上层 水相于另一个指形管中 4.2.6加1/10体积3mol/1的乙酸钠(pH5.4),2.5倍体积预冷的无水乙醇,15000r/min离心 一20 C保 20min,弃去乙醉,沉淀用75%的乙醉洗涤一次,真空干燥，用20L灭菌双猴水溶解沉淀， 存备用 4.3操作程序 取一支0.5mL 的指形管,依次加人下列试剂2..5AL10×的PCR缓冲液,1.0nl上游引物、 1 .0L下游引物,0.5AL.dNTP,1.0L病毒核酸,l8.5L灭菌双燕水,0.5LTaqDNA酶 于PCR 仪中运行:94C30s，55C30s，72C30s,25个循环,72C8 8min 同时设立阳性和阴性对照 PCR产物的检测 反应结束后,PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳,每个样品的加样量为5L10AL,同时以 100bpDNA分子质量标准物为参照 50V恒压电泳40min,于紫外灯下观察 4.5结果的判定 阳性对照在416bp处有一条特异的DNA条带,阴性对照没有目的带,证明本实验成立 待检样品 在相同位置有DNA带,判为阳性,否则为阴性