国家标准 GB/T31582一2015 牛性控冷冻精液 Bovinefrozensexed-semen 2015-05-15发布 2015-10-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31582一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业部提出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口本标准起草单位:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)、内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司、北京奶牛中心、农业大学、全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心南京. 本标准主要起草人:张晓霞、李喜和周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利张海涛,刘玉、赵小丽、赵鹏、陆汉希,王建国,胡树香,施亮、张勇、钱松晋
GB/T31582一2015 牛性控冷冻精液范围本标准规定了牛性控冷冻精液技术要求、抽样,试验方法,判定规则和标识,包装本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T2828.22008计数抽样检验程序第2部分;按极限质量LQ)检索的孤立批检验抽样方案 GB/T2828.112008计数抽样检验程序第11部分;小总体声称质量水平的评定程序 GB4143牛冷冻精液 GB/T5458液氮生物容器术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 性控冷冻精液froensexedsemen 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液 3.2 精子分离准确率xorYratioofsexed-semenm X精子或Y精子占分离后精子总数的百分率要求 4.1 种公牛经审定或鉴定的公牛,体质健康,无遗传病,不允许有《动物防疫法》中所明确的二类疫病中的任何一种 4.2新鲜精液色泽乳白色或谈黄色,精子活力>65%.精子密度>4x10个/mL..精子畸形率<15% 4.3 每剂量解冻后精液 4.3.1外观细管无裂痕,两端封口严密
GB/I31582一2015 4.3.2剂型、剂量细管冷冻精液;微型,剂量>0.18ml 4.3.3精子活力 >35%即>0.35) 4.3.4前进运动精子数 80万个 4.3.5分离准确率 >85% 4.3.6精子畸形率 15% 4.3.7细菌菌落数 800个抽样 5.1抽样检验方案 5.1.1生产方抽样检验按照GB/T2828.22008中第4章,采用极限质量LQ=20,模式A一次抽样方案,确定抽样公牛样本量 5.1.2质量监督抽样检验按照GBT388.1一230s中第后章,该群体公牛为一核查总体.采用ol- =10,选用第I检验水平的抽样方案;查GB/T2828.11一2008中表B.2,确定抽样公牛的样本量 5.1.3复检和仲裁抽样检验复检可根据原抽样方案确定,仲裁应按照5.1.2规定的方案进行抽样检验,按照7.4.2规定的方案进行评定 5.2抽样方法随机抽样试验方法 6.1外观用目测法,其结果应符合4.3.1的规定
GB/T31582一2015 6.2剂量检验按附录A中A.2规定的方法,其结果应符合4.3.2的规定 6.3精子分离准确率检验按A.3规定的方法,其结果应符合4.3.5的规定解冻后精液质量精子活力,前进运动精子数、精子畸形率及细菌菌落数的检验按照A.4一A.8规定的方法,其结果应分别符合4.3.3、4.3.4、4.3.6、4.3.7的规定检验 7.1 检验分类 7.1.1常规检验对冷冻精液的单项目检验是型式检验的一部分,主要是在生产批人库前和销出库时的检验 7.1.2型式检验对冷冻精液全部项目检验,评定产品质量是否全面符合标准也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督抽样检验时选定项的检验 7.2检验项目 7.2.1常规检验按照4.3.1和4.3.3的规定 7.2.2型式检验按照4.3.1一4.3.7的规定 7.3结果判定 7.3.1常规检验样品中任何一项目检验未达到4.3.1和4.3.3的规定要求,则判为不合格 7.3.2型式检验样品中任何一项目检验未达到4.3.l4.3.7的规定要求,则判为不合格 7.4抽样检验对群体质量水平的评定 7.4.1生产方抽样检验生产方抽样检验按照GB/T2828.2一2008中第4章的规定,通过对样本检验,若样本中不合格品数等于或小于接收数Ac,则接收该批(合格),否则不接收该批(不合格)
GB/I31582一2015 7.4.2质量监督抽样检验按照GB/T2828.11一2008中规定,在样本中d(不合格品数)L,即抽检样本不符合要求,核查总体不合格标识,包装 8.1 标识 8.1.1品种种公牛的品种以代号表示,具体遵照GB4143的规定 8.1.2内容应在细管壁和包装袋上印制以下内容,印制标识要请楚,并按以下顺序排列生产单位代号 a 公牛品种; b e公牛注册号; 生产日期或批次; d e)分离精子标记X或Y 8.2包装牛性控冷冻精液细管用塑料管包装,每个包装不得超过25剂
GB/T31582一2015 附录A 规范性附录牛性控冷冻精液质量检验方法 A.1抽样 A.1.1样品的收集抽样;从贮存冷冻精液的液氮容器中按规定随机抽取样品送样;将抽取的样品送至质量检测机构 A.1.2抽样方案 A.1.2.1生产方抽样检验按5.1.1确定样本数 A.1.2.2质量监督抽样检验按5.1.2确定样本数 A.1.2.3抽样方法按牛号顺序排列,由抽样人员现场按样本头数随机确定各样品公牛 A.1.2.4全部取样对已投产的每头公牛取样 A.1.3取样方法确定取样公牛,从贮存冷冻精液的液氮容器中随机抽取大于15剂的性控冷冻精液 A.1.4样品的保存存放性控冷冻精液的液氮容器质量应符合GB/T5458的规定,使用前经过清洗后加人液氮,样品浸在液氮中取放样品时在空气中暴露时间不得超过10s 由专人保管样品,样品不允许脱离液氮,抽样登记单与样品随行样品包装、标记应保持原样 A.2剂量检测主要器材 A.2.1 小试管、勇刀,刻度吸管 A.2.2检测方法取2剂细管性控冷冻精液自然解冻后舅去超声被封口猫,把精液推人一小试管内,用1.0ml刻度吸管准确吸取精液,并读取总精液量
GB/I31582一2015 A.2.3计算样品的剂量值为2剂性控冷冻精液总剂量的平均值,按式(A.1)计算 V= (A.1 " 式中: 剂量值,单位为毫升(mL); 样品总剂量值,单位为毫升(mL A.3X精子或Y精子分离准确率的检测机器检测方法 A.3.1 A.3.1.1主要器材流式细胞仪或精子纯度检测仪、循环恒温水浴锅、超声波发生器、5ml试管、移液器,0.22Am过滤器、,50um过滤器 A.3.1.2主要试剂及配制方法主要试剂及配制方法如下 a 荧光染料Hochest33342(0.05%);将10mg荧光染料Hochest33342定容于20ml双燕水中,在5C条件下避光保存,有效期90d bTrissheath工作液(pH8.0)取Tis4.776g,柠檬酸2.32g.D-果糖1.710g溶于120ml双燕水中搅拌至完全溶解,用4mol/儿的NaOH将pH值渊到8.0,用双燕水定容至200mL 该液用0.22m的过滤器过滤灭菌后添加国产青霉素2万单位、国产链霉素1万单位,置5 冰箱保存,有效期14d 该液渗透压290mOsm士10mOsm. 注:以上化学试剂纯度均为分析纯 A.3.1.3检测方法在5ml试管里,先加20Al荧光染料Hochest33342(0.05%),再加1mlTris-sheath工作液 pH8.0)充分混匀,最后将解冻后精液加人管内,精液体积范围30L100L 混匀后放人34C 水浴锅水浴20min 取出染好的精液,用超声波发生器断去精子尾部后,用50m过滤器过滤到5ml试管中处理好的精液放置避光处开启流式细胞仪,作好仪器图像定位将处理好的精液放人加样器,按照流式细胞仪精子纯度检测操作流程,检测上述染色样品重复以上操作3次,取其平均值染色后样品应在4h内检测完毕 3次检测数据误差值大于5%时,应重新操作 A.3.1.4计算 X精子的分离准确率按式(A.2)计算 A十A 十A A.2 A=
GB/T31582一2015 式中: -X精子性控平均分离准确率,%; -X精子性控第1次检测分离准确率,%; A -X精子性控第2次检测分离准确率,%; A X精子性控第3次检测分离准确率,% A A.3.2精子特异性DNA探针检测方法 A.3.2.1主要器材荧光显微镜、培养箱、干燥箱、干浴器,移液器 A.3.2.2主要试剂及配制方法主要试剂及配制方法如下 a)PBS;取袋装PBS干粉用1000mL双蒸水稀释,室温保存; b Y精子特异性DNA探针，一20C保存; c 10%胃蛋白酶;称0.1g胃蛋白酶加lml 双蒸水(提前预热到37),25Al分装，一20 保存; d 0.005%胃蛋白酶;25AL的10%胃蛋白酶加人49.5mL双燕水以及0.5ml1.0mol/1的盐酸,37C水浴 SolutionA;称取0.121gTris碱和0.9gNaCl溶于100ml双蒸水,充分混匀,4保存备用 SolutionB;称取0.3856gDTT溶于1mL精子洗涤液,充分吸打混匀.一20C保存备用; fD SolutionC;称取1gSDS和1.9g四碉酸钠溶于100ml.双燕水中,反复颠倒混匀,室温保存备用; 20×ssC:称取87.6NaCl,44.1柠檬酸钠,溶于500ml双蒸水中(用盐酸将pH调到 h 7.0),高压灭菌,4C保存备用; 2xssC溶液(pH7.0):在一个量筒里量出100mL的20×SsC溶液,与约880mL的双蒸水混合,用1nmol/L.的Hcl溶液将pHH调到7.0,用双燕水将溶液定容到1L,高压灭菌,室温下存储如果有任何可见的沉淀,就要丢弃溶液 0.4xssC溶液(pH7.0);20mL的20×ssC溶液与约970mL双蒸水混合,用1mol/几的 HCI溶液使pH下降到7.0,用双燕水使液体量达到1L,用1mol/几的HC将pH调到7.0. 用双燕水将溶液定容到1L,高压灭菌,室温下存储,如果有任何可见的沉淀,就要丢弃溶液; pH7.0/0.3%NP410.50mL的0.4Xssc(pH7.0)加上150L的NP410.,均 k)0.4×SSC溶液，匀混合 l 2×SsC溶液，pH7.0/0.1%NP40:50ml的2×SsCpH7.0)加上50l.的NP40,均匀混合; mol/L甘氨酸(pH8.5):7.05g甘氨酸加人100mL双蒸水,室温保存; m n甲醛固定液依次取12.5ml10%中性甲醛,37ml.PBs,2.5mL.1mol/儿MgCl.混合均匀. 室温保存 DAPI o 注:以上化学试剂纯度均为分析纯 A.3.2.3检测方法取一剂细管牛性控冷冻精液置37C水浴解冻,推人1.5mL试管中，精子用溶液A离心洗涤后将
GB/T31582一2015 其浓度调至2.5×10°/mL,依次使用溶液B溶液C、无水乙醇处理精子使其解凝聚,然后滴片,烘干烘干后的片子在冰箱中放置过夜,隔天取出片子晾干后,首先在2XSsc(pH7.0)孵育,然后用胃蛋白酶溶液消化,消化后的片子用1×PBS冲洗,甲醛固定,最后用70%、85%、100%乙醇处理将处理好的精子玻片上滴上精子特异性DNA探针封片,杂交过夜隔天在0.4×SsC溶液(0.3%NP40)溶液中除去封片胶,在2xssc(0.1%NP-40)溶液中除去盖玻片,最后依次使用0.4XssC溶液(p7.0).2x ssC溶液(pH7.0)溶液洗片,片子风干后滴上DAP在显微镜下计数统计具有蓝色荧光的总精子数和绿色杂交点的Y精子数每次检测2张带有精子样品的载玻片,每张载玻片计数200个左右的精子,最后计算出总数 A.3.2.4计算 X精子的分离准确率按式(A.3)计算 A-(-H A.3 ×100 式中: -X精子性控分离准确率,%; Y Y精子数,单位为个 T 总精子数,单位为个 A.4精子活力的检测主要仪器和器材 A.4.1 相差显微镜、电视显微系统、计算机、恒温水浴箱、5.0mL试管、载玻片或精液性状板、盖玻片、显微镜恒温装置、移液器 A.4.2检测方法 2剂细管性控冷冻精液分别直接置于37C水浴中解冻,取解冻后混合精液约20Al 置于载玻片上,加盖玻片后立即在200倍~400倍相差显微镜或电视显微系统上观察活力,载物台温度保持38C 每个样品观察3个视野 A.4.3计算精子活力是3个视野精子活力评价值的平均数,按式A.4)计算 1十？十3 M= (A.4 式中: M 精子活力,%; 第一视野活力评价值,%; 1 第二视野活力评价值,%; 12 第三视野活力评价值,% n A.5每剂量中精子总数检测 A.5.1主要器材血球计数板、血色素管、1mL刻度吸管,小试管、计数器、移液器、显微镜或电视显微系统
GB/T31582一2015 A.5.2检测方法准确吸取20Al解冻后精液,注人盛有0.98ml 的3.0%氯化钠溶液的试管内,混匀,使之成为 50倍稀释的稀释精液将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好,用移液器吸取稀释精液于血盖片边缘,使精液自行流人计数室,均匀充满,在显微镜下或电视显微系统上观察计数 A.5.3计算每剂量中精子总数按式(A.5)计算 S=Q×104×50×V A.5 式中: S 每剂量中精子总数,单位为个; 计数室25个中方格的总精子数,单位为个; 剂量值,单位为毫升(mL) 每样品观察上下两个计数室,取平均值,如两个计数室计数结果误差超过5%,则应重检 A.6每剂量中呈前进运动精子数每剂量中呈前进运动精子数按式(A.6)计算 C=S×M (A.6 式中每剂量中前进运动精子数.-单位为个每剂量中精子总数,单位为个 S 精子活力,% M A.7精子畸形率的检测主要器材 A.7.1 显微镜、载玻片,血球分类计数器,染色板,吸管 A.7.2主要试剂及配制 A.7.2.1磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠(NaH,PO2H.o)0.55g、磷酸氢二钠(Na,HPO12H,O)2.25g,双蒸馏水定容至100ml A.7.2.2中性福尔马林固定液取骑酸二氢钟(NalHo.2Ho0.55尽.磷酸氨二纳(NaHPo.12H.o)2.25g,用0.89%飘化钠约50.0mL溶解后加人8.0mL40%甲醛HCH0(使用前经碳酸镁中和过滤),再加0.89%氯化钠溶液定容至100.0ml A.7.2.3姬姆萨原液将姬姆萨染料1.0g放人 66.0mL 分别用量筒量取甘油[cH.(o]66.0mL.甲醉(cH.on 研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止,然后将甘油全部加人并置60C恒温箱中,溶解4h后,再加
GB/T31582一2015 人甲醇充分溶解,过滤后贮于棕色瓶中待用,贮存时间越久染色效果越好 A.7.2.4姬姆萨染液取姬姆萨原液(A.7.2.3)2.0mL.加磷酸盐缓冲液3.0mL及蒸僧水5.0ml 现配现用以上所用化学试剂纯度应达到分析纯 A.7.3制片染色、镜检,计算 A.7.3.1抹片取解冻后精液1滴,滴于载玻片一端,用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片成35"夹角,将样品均匀地拖布于载玻片上,自然风干(约5min),每样品制作2个抹片 A.7.3.2固定在已风干的抹片上滴1.0mL2.0ml中性福尔马林,固定15min后用清水缓缓冲去固定液,吹干或自然风干 A.7.3.3染色将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上,把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间让其充满平槽并使抹片接触染液,染色1.5h后用清水缓缓冲去染液,晾干待检 A.7.3.4镜检将制备好的抹片在显微镜(400倍~600倍)下观察,每个抹片观察200个以上的精子(分左,右2个区),取2片的平均值,2片的变异系数不得大于20%,若超过应重新制片 A.7.3.5计算精子畸形率按式(A.7)计算 A= A.7 一 ×100 式中精子畸形率,% A 畸形精子数,单位为个 A 精子总数,单位为个 S A.8细菌菌落数的检测主要器材 A.8.1 培养箱、超净化工作台、天平、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅,培养皿 A.8.2培养基的配制普通琼脂的制作;取牛肉浸膏反.0g,蛋白陈10.0g、磷酸氢二钾(KHPO 3H.o)1.0g、氧化纳 NaCl)5.0g,用蒸憎水1000ml溶解后加琼脂粉20g加温融解调整pH至7.47.6,并用脱脂棉过滤,分装于三角烧瓶中经高压灭菌(0.1MPa,20min) 也可使用营养琼脂培养基 10o
GB/T31582一2015 A.8.3检测方法将每份样品制作灭菌平皿2个并标注样品号取2剂细管性控冷冻精液在37C水浴中解冻,细管用酒精棉球消毒后分别注于2个灭菌平皿内;在无菌条件下,把50C52C的培养基倒人平皿内,每平皿15ml,并水平晃动平皿使精液混合均匀,待琼脂凝固后倒置平皿,同时作空白对照平皿,置37C 恒温箱内培养48h取出,统计出每个平皿内细菌菌落数 A.8.4计算样品的细菌菌落数为2个平皿中统计菌落数的平均值,按式(A.8)计算 n十n B一 A.8 式中: B 细菌菌落数,单位为个; 第1个平皿菌落数,单位为个; n 第2个平皿菌落数,单位为个 1

了解牛性控冷冻精液GB/T31582-2015

随着畜牧业的发展，冷冻精液技术逐渐成为提高种畜遗传水平的重要手段之一。而牛性控冷冻精液作为一种新型的冷冻精液，在近年来得到了广泛的应用和推广。

一、牛性控冷冻精液的定义

牛性控冷冻精液是指在人工授精时，通过对优良种公牛精液进行特定处理，使其在冷冻保存过程中能够保持较好的活力和存活率，并且能够有效地降低雌性动物的怀孕周期和非特异性阴道炎的发生率。

二、GB/T31582-2015标准要求

GB/T31582-2015标准明确规定了牛性控冷冻精液的要求和检验方法。主要包括以下内容：

原料精液的选择和处理
添加剂的选用和使用量
冷冻过程的温度和时间控制
存储条件和期限
质量指标的检测方法

三、牛性控冷冻精液的优点

相比传统的冷冻精液，牛性控冷冻精液具有以下优点：

增加了精液的存活率和受孕能力，提高了繁殖效果
减少了雌性动物的怀孕周期，缩短了育种周期
降低了非特异性阴道炎的发生率，减轻了雌性动物的疼痛和不适感

四、结论

牛性控冷冻精液是一种新型的冷冻精液，在畜牧业中得到了广泛应用。GB/T31582-2015标准为其规范了生产和检验要求，保证了其质量和安全。相信随着科技的发展，牛性控冷冻精液在畜牧业中的应用前景将更加广阔。