国家标准 GB/T29431一2012 番茄溃疡病菌检疫鉴定方法 Deteetion.amdidemtfetionofcCavibaetermichiganensissubsp mnichiganensisSmithDavisetal 2012-12-31发布 2013-06-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29431一2012 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位:珠海出人境检验检疫局、华南农业大学、农业大学、中华人民共和国北京出人境检验检疫局本标准主要起草人:乐海洋、彭仁、刘琼光、罗来鑫、张建军、刘勇、冯欣、龚忠年、林友伟、张卫东、高文娜
GB/T29431一2012 番茄溃疡病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了番茄溃疡病菌的检疫鉴定方法本标准适用于番茄种子、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃疡病菌的检疫和鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样番茄溃疡病菌基本信息中文名:番茄溃疡病菌密执安棒形杆菌密执安亚种) 学名;Cavibauctemichiganesi、subsp mihigaensis(Smith,1910)Davisetal.,1984，简称 Cmm 异名CurynthucteriammichiganenepV.mihiganene(Smith)Dye&.Kemp;Corynebacteriun nichiganense(Smith)Jensen. 72 病害英文名:Bacterialcankeroftomato. 属细菌域Bacteria,放线菌门Actinobacteria,放线菌纲Actinobacteria,放线菌目Actinomvcetales、微杆菌科Miecrobaeterieae,棒形杆菌属cauibucer 该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子,番茄种子内外层都可带菌在田间和温室,该病菌由伤口、气孔和自然孔口侵人寄主组织,主要通过灌溉水,雨水、修枝剪,培养料等传播该病菌在土壤和病残体组织中可存活2年3年番茄溃疡病菌的其他基本信息参见附录A 方法原理根据番茄溃疡病菌的危害状,对检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并带回实验室作进一步分离鉴定,依据病原菌的培养性状、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行判定仪器和用具生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅,光照恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平、低温冰箱接种环,牙签、注射器、恒温水浴锅高速冷冻离心机(12000r/min以上,匀浆机、PCR仪、电泳装置(电泳仪和水平电泳槽,凝胶成像分析仪、微量可调加样器等
GB/T29431一2012 主要试剂蔗糖,蛋白陈、酪蛋白水解物,酵母膏、,葡萄糖,磷酸氧二钾(K;HPO,磷酸二氢钾(KH,PO,硫酸镁(MgSO 7H.O),琼脂、綦畦酮酸钠,硫酸多粘菌素,放线菌酮、棚酸(H,BO.、甘油、磷酸氢二钠 NaeHPO),吐温-20(Tween-20、硫代硫酸钠NagS,O、氯化铵(NHCI)、Trizma碱烟酸、亚碚酸钾、甘露糖、碳酸钙(CaCO.),乙二胺四乙酸(EDTA)、三羚甲基氨基甲烧(Tris)、十二烧基碱酸钠 (SDs),液氨、三叙甲烧、异戊醉,异丙醉,琼脂糖(电泳用)、TuqDNA聚合酶,DNAMarker 检测鉴定方法 7.1现场检疫和抽样番茄种植田间的病害调查或进出境番茄样品的现场检疫中,若番茄植株或果实病害症状表现与附录A中描述类似,取样带回实验室作进一步分离鉴定;对番茄种子可进行种植观察或样品分离鉴定取样方法和步骤按照sN/T2122 7.2种植观察将待测的番茄种子种植于温室或实验室的育苗钵(钵内土壤或基质应灭菌)中,每份种子样品种植 5000粒左右,最少不低于3000粒种子,生长环境温度24C34C,相对湿度大于或等于70%,种子出苗后15d内观察幼苗发病情况如果种植期间有发病幼苗,且表现出番茄溃疡病苗期的典型症状参见附录A),则进一步采集可疑病株进行分离鉴定 7.3分离培养 7.3.1种子中病原细菌的分离培养 7.3.1.1种子细菌浸提液制备将24g种子(至少12g)样品加人灭菌袋,加种子提取缓冲液(按1g种子加4mL提取缓冲液比例).C培养过夜(最少14),在匀浆机上至少浸7 tmin 分离培养番茄溃疡病菌所用的缓冲液、培养基配方见附录B 7.3.1.2半选择性培养基平板分离用三层消毒纱布(或过滤袋)过滤种子浸提液,至少取2ml过滤提取液.800从离心15min,仔细除去上清液,沉淀用十分之一离心体积的无菌种子提取液悬浮,并用无菌种子提取液进行10倍梯度稀释(稀释到100倍),取0.1nmL 每一稀释度分别涂布于D2ANX和sCM或nmsCM半选择性培养基平板同时,用无菌种子提取缓冲液制备Cmm标准菌株10倍系列稀释液,取0.1mLCmm标准菌株的每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上,以保证至少一个平板菌落数在50200个范围内将培养皿于26C C培养,在5d,7d,10d各检查平板菌落生长情况检查Cmm标准菌株在两种培养基上生长情况和菌落形态特征检查待测样品培养皿中是否有Cmm可疑菌落,与Cmm标准菌株比较记录可疑菌落和其他菌落数在D2ANX上培养5d7d后,Cmm菌落黄色,黏液状,凸起在SCM上培养10d后,Cmm菌落灰白半透明,黏液状,最后为不规则型,中间内部有黑点(斑在msCM上培养10d后,Cmm菌落半透明米白,黏液状,最后为不规则型,中间内部带有黄色/橙色点(斑)
GB/T29431一2012 菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异通常Cmm的形态和颜色在SCM和msCM会发生变化如果存在菌落形态和颜色的变化,每批样品每个皿至少挑取5个可疑菌落在YDC培养基上做进一步纯化培养观察在YDC上,Cmm菌落黄色,圆形,凸起,黏液状,挑取具有这些特征的菌落,做进一步的番茄致病性测定注意在YDC上划线过程中,若菌落未分开,其菌落形态不一定总是圆形的,如果存在这种情况,可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉(Mirabilisjalapa)接种检测,若测定为阳性,则进一步在番茄上进行致病性测定,若测定为阴性,则表明为非Cm朋细菌 7.3.2病组织中病原细菌的分离培养用灭菌剪刀剪取病变组织(叶片,茎秆,果实)上的病斑,在70%酒精或含有效氯7%的次氯酸钠溶液中表面消毒50s一60s,无菌水清洗3次,然后将其移至灭菌培养皿中,加5~10滴无菌水,用灭菌锁 10min,即制成组织液用灭菌的接种环蘸一环组织液,在SCM 子和剪刀将病组织捣碎,静置5 mln 或mSCM培养基上划线,每处理重复3次,25C28C下培养 Cmm在SCM或mSCM培养基上生长较慢,在25C28C下需培养7d -0d才可见典型浅黄色菌落;纯化或活化Cwn则用YIc培养基为好.24h一48h内就可见典型金黄色岚落挑取典型岚落,做进一步的番茄致榈性测定如果存在与典型菌落有相似特征的可疑菌落,可挑取这些可疑菌落先进行紫茉莉接种检测,如果测定为阳性,则进一步在番茄上进行致病性测定,如果测定为阴性,则表明为非Cmm细菌紫茉莉接种检测供测试的菌株在YDC 琼脂斜面上培养48h后用无菌水洗下，调整悬浮液中细菌的浓度为 1×10'CFU/ml 用一次性注射器注射接种紫茉莉叶片,同时接种标准菌株做阳性对照,接种无菌水为阴性对照接种后植株置于18C一36C环境下36h一48h,观察过敏性坏死现象当用Cmm接种后,紫茉莉的叶片在36h一48h内就能出现典型的过敏性坏死斑其他棒状杆菌及常见植物病原细菌均不能引起紫茉莉产生过敏性坏死反应 7.5番茄上致病性测定感病番茄幼苗如华南红宝石、佳粉10号、合作908等)在生长环境温度25C一32C,相对湿度习 70%条件下生长到23片真叶(大约播种后3周4周),用灭菌牙签蘸取YIC平板上可疑菌落,在番茄幼苗的子叶和第一片真叶之间茎的位置,穿刺法接种同时接种标准菌株做阳性对照,无菌牙签蘸取无菌水接种做阴性对照接种后植株置于25C32C条件至少8h光照培养,并适时浇水保持苗床土壤湿润接种后2周3周,观察植株的萎蔫症状,与阳性对照进行比较并做好相关记录由Cmm 引起的典型症状是在接种位置产生溃疡斑,变黄,边缘坏死,真叶萎藉 7.6分子生物学检测在上述检测和鉴定的基础上,可通过分子生物学检测进一步确定和验证从分离培养的细菌菌株中提取DNA也可直接用菌液,浓度1×10CFU/mL),或从表现典型症状的病组织中提取DNA,作为模板,进行PCR检测和电泳分析用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照,用非Cmm的植物病原细菌 DNA作为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR扩增具体检测方法见附录C 结果判定若经症状检验并分离的细菌菌株在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符,致病性测定表现典型症状,且PCR检测结果为阳性,扩增的片段大小与描述相符,则可以判定为检出Cmm 其余情况判定为未检出Cmm.
GB/T29431一2012 样品保存保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥,防虫防鼠处妥善保存3个月对检出番茄溃疡病菌的样品应至少保存6个月,以备复检,谈判和仲裁,该类样品保存期满后,需经灭菌后方可处理 10 菌株保存从检测样品中分离并鉴定为番茄溃疡病菌的菌株,应妥善保存将菌株接种于YDC或523斜面培养基上,然后置于4C冰箱中保存,定期(30d)转接;或将菌种接种于10%一20%(体积分数)灭菌甘油笔下长期保中一80C下保存(1年一2年);必要时可将菌株用真空冷冻干燥机冻干后一8o 存(5年10年
GB/T29431一2012 附录A 资料性附录番茄溃疡病菌(Cmm)其他信息 A.1地理分布亚洲,,印度、伊朗,.以色列、日本,黎巴嫩;非洲,埃及,肯尼亚、摩洛哥,南非,多哥,突尼斯、乌干达、赞比亚、津巴布韦;欧洲:土耳其、奥地利,比利时、保加利亚,芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利,爱尔兰、意大利,立陶宛、荷兰、挪威,波兰、葡萄牙,罗马尼亚、西班牙,瑞士,英国、乌克兰、俄罗斯;大洋洲;澳大利亚、新西兰;美洲;美国,墨西哥、加拿大,伯利兹、哥斯达黎加、古巴、巴拿马、多米尼加,巴西、哥伦比 ,智利,秘鲁等60多个国家亚、阿根廷、 A.2寄主范围番茄(Lycobersiconesculentum、树番茄(Cyphomandrabetacea、心叶烟(Nicolianaglulin0sa、 ,马铃薯(Solanumtuberusum),人参果(solanummuricalum,龙葵(Sola 乳茄(Solanummammosm)、 numnigrwm,裂叶茄(Solanumtrilorum) 人工接种可侵染小麦(Tri ilicumspp.,大麦Ho ordlen uwlgare),黑麦(Secalecereale),燕麦(Aenaspp.,向日葵(Helianthusannuus),西瓜(C'irwllwslana lus),黄瓜(Cucu satieus),辣椒(Ca ,茄子(Solam1 unmelongena)等 n1 pS1c71a7171n A.3症状番茄溃疡病是一种系统性病害,从番茄育苗到收获期均可发生在温室条件下,最初的症状是叶片表现萎蔫,叶脉之间产生白色,后是褐色的坏死斑点,最后表现出永久性萎蔫,致使整株干枯死亡在田间,最初的症状是低位叶片的边缘出现卷缩、下垂、凋萎,似缺水状随病情发展,叶脉和叶柄上出现小白点,在茎和叶柄上出现褐色条斑、下陷、向上下扩展,并且爆裂,露出黄到红褐色的髓腔,出现溃疡症状幼嫩果实发病后皱缩、滞育、畸形果实感病后往往出现白色圆形小点,扩展后变为褐色,中心粗糙、略微突起,直径约3mm左有,斑点边缘围绕着白色晕圈,呈典型的“鸟眼状” 鸟眼斑是诊断番茄溃疡病的典型症状此外,不同的季节和栽培条件下溃疡病的发生症状不尽相同辣椒叶片病斑灰绿色,不规则、木栓质疤疹,中央褐色,瘪疹往往崩溃,成不规则形褐斑,叶片脱落果实上形成鸟眼状斑,与番茄果实上的症状类似生物学特性病原细菌短杆状或棒杆状，革兰氏染色阳性，无芽抱，无鞭毛，严格好氧大小为 0.3um一0.4am)×(0.6um1.2am),在523培养基(见附录B)上28C培养,菌落黄色、圆形、略突起、边缘整齐,光滑不透明、黏稠状,直径2mm一3mm 在YDc上,Cmm菌落黄色,凸起,黏液状接种烟草和紫茉莉可产生过敏性坏死反应硝酸盐还原阴性,尿酶阴性,明胶液化慢,水解七叶苷,水解淀粉能力很弱或不水解生长需要氨基酸、生物素,烟酸和硫胺素最高能忍耐4%的盐度,能利用葡萄糖,蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖,麦芽糖和甘油,不能利用鼠李糖棉子糖、松三糖、甘露醇、山梨醉能利用苯甲酸、柠檬酸、延胡索酸、丁二酸和苹果酸,不能利用甲酸、丙二酸、草酸、酒石酸、丙酸及半乳糖酸液化明胶,不产生咧噪,但产生Hs,不还原硝酸盐,石蕊牛乳还原不产生氨尿酶、苯丙酸脱氨酶、氧化酶色氨酸脱氨酶阴性,过氧化氢酶为阳性
GB/T29431?2012 ? B 淶?? ??(Cmm)?? B.1??(pH7.4) NaHPO7.75g;KH,PO1.65;Tween-200.2mL;NaaS.(O.0.5g(??δ ??);??1000mL,pH?7.4,121C?15min B.2D2ANx ?2.0g;??4.0g;10.0g;MgSO7H.O0.3g;NH,Cl1.0g;Trizma 1.2g;?18g;?1000mL,121C?15min,?50C?2.8mL? 10mg/mL.?0.1mol/LNa(oH),0.5mL?(200mg/mL,???),1ml. ?(10mg/mL,??) B.3sCM ?0.1g;10.0g;H,BO.)1.5g;MgSO7H.00.25g;KHPO2.0g;KH,PO. 1.5g;?18g,?10mg;?100ml..121C?15min,?0C? 3ml?(10mg/nmL,?0.lmol/LNa(OH),1mL??(200mg/nmL,?? ),5mL(20mg/mL,??) B.4msCM ?0.1g;?10.0g;H,BO.)1.5g;MgSO7H.,O0.25g;K,HPO2.0g; KH.PO1.5g;?18g;?1000mL.121C?15min,?50C?3ml. ?(10mg/ml.,?0.1mol/Na(OH),1nml??(200mg/ml,???). 5mL(20mg/ml,??) B.5YDc(?--?) ?10.0g;D20.0g;CaCO?(lightpowder)20.0g;?18.0g;?? 1000mL.121C?15nmin B.6523(pH7.0pH7.1 ?8g;?4g;MgSG7H,O0.3g;10g;2g;?18g;?? 1000mL.pH?7.0?7.1,121C?15min.
GB/T29431一2012 附录 c 规范性附录番茄溃疡病菌(Cmm)CR检测方法 c.1试剂及配制 c.1.1DNA抽提液配方 100mmol/LTris-HCl,pH8.0 100mmol/L.EDTA 1004g/mL蛋白酶K 250mmol/LNaCl c.1.2cTAB沉淀液配方 1%CcTAB(质量浓度)(十六烧基三乙基祺化铵 50mmol/LTris-HC,pH8.0 10mmol/IEDTA,pH8.0 c.1.3TE缓冲液配方 10mmol/LTris-HCl,pH8.0 mmol/IEDTA,pH8.0 c.1.4TAE电泳缓冲液(pl8.5)配方冰乙酸 Tris 242g 57.1ml 燕僧水定溶至 NaEDTA2H.O 37.5g 1000ml 灭菌后常温保存,用时稀释50倍 0x电泳上样缓冲液(p8.5)配方 C.1.5 20%质量浓度)Ficol400 0.1rmol/ILNaEDTA(pH8.0 1.9%质量浓度)SDS 0.25%(质量浓度)澳酚蓝 C.2样品DNA提取 C.2.1病组织中总DNA提取将待检测的新鲜病组织约0.2g用剪刀剪碎,置于灭菌研钵中,加人适量液氮,迅速研磨,成粉状然后将其转移至1.5mL 离心管中,加人1.2mlDNA抽提缓冲液(含2%3苑基乙醇),充分混匀 65C水浴中孵育30min 室温12000r 离心10min, 1,取上清液700AL移至另一1.5mL离心管 /min 加人等体积的三氯甲烧-异戊醉(241). 中,加人5AlRnaseA(10g/mL),37水浴孵育30 min 颠倒混匀室温12000r r/min n离心10min in,取上清液600ML移至另一1.5ml离心管中,加人等体积 CTAB沉淀液,混匀,室温12000r/min离心10min,弃上清液加人600L氧化钠(1.2mol/L)室温静置5min,加人等体积的三氯甲烧-异戊醇(24:1),颠倒混匀室温12000r/min离心10min,取上清液600L移至另一1.5mL 离心管中,加人0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温静置30 min
GB/T29431一2012 12000r/min离心10min,弃上清液用70%冷乙醇洗涤沉淀两次,无水乙醇洗涤沉淀一次,晾干加人50ALTE缓冲液溶解DNA沉淀一20C长期保存 C.2.2病原细菌DA的提取将供试菌株在523斜面培养基上培养48h(28C) 在每一试管中加人0.1mol/L磷酸钠缓冲液 10mL洗下菌苔将细菌悬浮液转移至一干净的12mL离心管中,12000r/min离心15 1,弃上清 min， L,20mg/mL蛋白酶K30L.混匀.37C水液在沉淀中加人TE缓冲液5ml,10%SDS溶液300 浴孵育1h 加人等体积的三氯甲婉-异戊醉(241),混匀 10000r/min离心5min.将上请液移至一个新管中加人等体积的酚-三叙甲烧-异戊醉(25:24:1).混匀,10o00r/min离心5min,将上清液一个新管中加人0.6倍体积的异丙醉,轻轻混合至DNA沉淀,10000r/min离心5min.弃上清移至液,用70%乙醉洗涤沉淀,晾干,加人50AlTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20C长期保存注此步也可省略可直接用培养的菌株稀释成>10CFU/mL的菌悬液作模板进行PR检测 C.3CR检测 C.3.1CR反应体系 C.3.1.1检测Cmm采用的PCR引物序列见表C.1 表c.1检测Cmm的PCR引物序列 CR产物大小引物名称引物序列则 bp Spm4f 正向引物:5'-TCAGGCGTCTGTTCTGGC-3” 223 Spm2r 反向引物;5'-CCCACCACCATCCACAAC-3” c.3.1.2检测Cm川采用的PCR反应体系见表c.2 表C.2检测Cmm的PCR反应体系加样体积组成 AL 2.5 10×CR缓冲液(含MgC浓度为15mmolL dNTP各2,5mmol/1 TaqDNA聚合酶(2.5U/L 0.4 正向引物(10pmol/L 反向引物(l0pmol/AL 模版DNA(1ng/A山~10ng/AL) 17.1 双燕水 25 总体积 C.3.2PCR反应循环参数检测Cmm采用的PCR反应条件为 94C预变性5 min;随后94C,30s,60C,40s,72C,1min ,进行35个循环;最后72C延伸
GB/T29431一2012 7min,并置于4C保温上述PCR反应用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照,用非Cmm的植物病原细菌DNA作为阴性对照,用双蒸水作空白对照 c.3.3PCR扩增产物的检测用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加样品孔中,用DNAMarker做相对分子质量标记,进行电泳分析,电泳结束后,在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍摄并记录实验结果

番茄溃疡病菌检疫鉴定方法GB/T29431-2012

一、GB/T29431-2012标准介绍

GB/T29431-2012是由中国国家质量监督检验检疫总局发布的关于番茄溃疡病菌检疫鉴定的标准。该标准规定了番茄溃疡病菌检测的样品采集、处理、分离、纯化、鉴定等流程。

二、样品采集和处理

番茄溃疡病菌检测的样品可以是植物体的各个组织部位、土壤、水源等。样品的采集要求在病害初期，避免植株已经死亡或过度老化。样品处理时，要迅速将样品送到实验室，以保证样品的新鲜度。

三、分离和纯化

番茄溃疡病菌检测的分离和纯化是检测过程中至关重要的一步。该标准规定了多种不同的分离和纯化方法，如筛选法、过滤法、培养法等。在这些方法中，培养法被广泛应用于番茄溃疡病菌的分离和纯化。

四、鉴定

番茄溃疡病菌的鉴定可以通过形态学、生理生化特性、分子生物学等多种方式进行。其中，分子生物学技术的应用使得番茄溃疡病菌的鉴定更加快速、准确、可靠。

五、结论

GB/T29431-2012标准为番茄溃疡病菌检疫鉴定提供了科学、规范的操作指南。在番茄溃疡病菌的检测和防控中，该标准的应用将有助于提高检测的准确性和可靠性，从而更好地保护农业生产和食品安全。