牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法

牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法

国家标准 GB/T40253一2021 牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法 Codlefdiagnosisformilkroeytwsisofoysters一Mierscopie 1eth0ds 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/40253一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由农业农村部提出 本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口 本文件起草单位:水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站 本文件主要起草人:白昌明杨冰、王崇明黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨,余卫忠
GB/T40253一2021 牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法 范围 本文件规定了牡蛎小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求,针对主要病原马可 尼小胞虫(Mikroeytosm ackini),给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料、仪器设 备、样品、试验步骤和结果判定 本文件适用于牡蛎感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断;以及牡蛎感染马可尼小胞虫的流行病学 调查和诊断;其他贝类可参照执行 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 SC/T7205.l一2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分组织印片的细胞学诊断法 SC/T7209,.32007牡蛎小胞虫病诊断规程第3部分;透射电镜诊断法 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 缩略语 下列缩略语适用于本文件 DAFA;戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液(davidson'salcoho-formalin-aceticacidixative) 试剂或材料 5.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸僧水或去离子水或相当纯度的水 5.2苏木素 5.3碘酸钠 5.4钾明矶 5.5柠檬酸 5.6水合三叙乙醛 5.7伊红Y水游性》. 5.8焰红B水溶性》. 5.9石蜡(熔点52C54C);切片级 5.10中性树胶:生物染色用 5.11甲醇
GB/T40253一202 5.12二甲苯 5.13无水乙醇 5.1495%乙醇 5.15甲醛(37%) 5.16冰醋酸 5.17吉姆萨(Gimesa)染液 5.18过滤海水;经纱网(>200目)过滤的海水 5.19DAFA固定液;按附录A的A.1配制 迈尔-班尼特苏木精(MayerBennettHematoxylimn)染色液;按A.2配制 5.20 5.21伊红-焰红染色液;按A.3配制 5.2285%乙醇;按A.4配制 5.2380%乙醇;按A.5配制 5.2475%乙醉;按A.6配制 5.2570%乙醇:按A.7配制 5.2650%乙醇;按A.8配制 o 仪器设备 6.1显微镜;配备高倍镜(40×)和油镜(100×) 6.2石蜡切片机;满足4"m74m厚度的石蜡连续切片要求 6.3展片水浴锅 6.4烘片机 6.5恒温箱 样品 7.1采样对象 牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类 7.2采样数量、方法和保存运输 采样数量、方法和保存运输应符合sc/T7205.1一2007附录B的要求 海水温度低于10C时为采 样的最佳时期 7.3样品的采集 稚贝附着后一2nmm)和幼贝(2nmm30nmm)取内脏团;成贝(>30mm)取闭壳肌和外套膜 8 试验步骤 8.1组织印片检测法 8.1.1印片制作 用解剖刀将样本剖开,用吸水纸轻轻吸去剖面过多的黏液,随后将剖面在载玻片上印迹,制成印片， 自然干燥后滴加甲醇覆盖印片部分,固定5min7min 空气干燥
GB/40253一2021 8.1.2染色 8.1.2.1将干燥的印片移人吉姆萨染液中染色,染色时间约30 min 8.1.2.2用缓慢的自来水流或洗瓶冲洗,去除多余染液 8.1.2.3室温晾干 8.1.3封片 滴加2滴中性树胶,封片 8.1.4观察 用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野,油镜下观察虫体特征 马可尼小胞虫呈卵圆形,直径2n 从m 4 m(参见附录B). 8.2组织病理检测法 8.2.1切片制作 8.2.1.1 脱水 将组织块依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中,流程如下;75%乙醇(1h45min)-85%乙醇 1h45min)-85%乙醇(1h45min)-95%乙醇(45min)-95%乙醇(45min)-无水乙醇(45min)- 无水乙醇(45min) 8.2.1.2透明 脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇;二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中,流程如下: 无水乙醇:;二甲苯(1:1)(25min)-二甲苯(20min)--二甲苯(20min). 8.2.1.3浸蜡 恒温箱温度调节至高于石蜡熔点,流程如下;透明后的组织块依次浸人两个盛有融化石蜡的烧杯中 各80nmin 8.2.1.4包埋 在恒温箱(温度调节至高于石蜡熔点)中熔蜡,将熔蜡倒人包埋盒与包埋模具也可用折叠纸盒),用 预温的锻子迅速夹取组织块,切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具,置于冰上使其冷却凝固 8.2.1.5切片 用蜡铲或刀片将包埋块四周修平,使上下两面修成平行面,保留组织周围附着宽2mm3mm的 石蜡 用石蜡切片机切片,厚度5m 对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片 8.2.1.6展片 将切片平放于展片机或水浴锅水面上,待伸展平整后,用载玻片捞出,置于烘片机上或烘箱内 45C烘片2h. 8.2.2染色 min)一二甲苯 将切片放在玻片架上,依次浸人盛有不同溶液的烧杯中,流程如下:二甲苯(5
GB/T40253一202 (5min) 无水乙醇(2min)-95%乙醉(2min)-一95%乙醇(2mim)80%乙醉 无水乙醉(2 min 2min)- 一80%乙醉(2 -50%乙醉(2nmin)蒸水(2 蒸水(2min)蒸僧水(2min)- min)一 min)一 迈尔-班尼特苏木精染色液(5 缓慢流动的自来水(6 )一伊红-焰红染色液(2min)-95%乙醇 min)- min 1min20s)-95%乙醉(21 无水乙醇(2min)无水乙醇(2min)二甲苯(2min30s)二甲 min)一 苯(2min30s)-二甲苯(2min30s 8.2.3封片 滴加2滴中性树胶,封片 8.2.4观察 用显微镜低倍镜搜索不同的视野,油镜下放大1000倍,在泡状结缔组织和闭壳肌血细胞浸润区及 其周围观察虫体特征(参见附录B) 结果判定 9.1组织印片检测法 在油镜下观察到球形或卵圆形,直径2m一4m的虫体(参见附录B),细胞质呈蓝色或浅蓝色 细胞核呈红色(因使用商品化染色产品不同,显色略有差异),则组织印片检测结果为阳性,判定为疑似 小胞虫感染 g.2组织病理检测法 9.2.1在马可尼小胞虫病流行区域的已知易感宿主中(参见附录C),油镜下在泡状结缔组织细胞和/或 肌纤维细胞细胞质中观察到球形或卵圆形、直径2m一生m的胞体(参见附录B),则组织病理检测结 果为阳性,判定为马可尼小胞虫感染 9.2.2在其他种类宿主中,或者在马可尼小胞虫病流行区域以外,组织病理检测结果为阳性,则判定为 疑似马可尼小胞虫感染 g.3疑似马可尼小胞虫感染的确诊 组织印片检测法或组织病理检测法检测结果为阳性,同时原位杂交检测或按SC/T7209.3一2007 透射电镜诊断法检测结果阳性,则判定为马可尼小胞虫感染
GB/40253?2021 ? A 淶 ?? AFA?? A.1 95%? 330ml ?(37% 220ml 115ml 335mL ?? ,?档 -???? 1000mL ?(50C60C 1.0 ? g 0.2 g 90.0 g 1.0 g 50.0 ?? g ?????,档 A.3-??? Y(?) 1g B(? 0.1 g 95% 780mL 4ml ????, A.485%? 95%? 850mL ? 950ml ,档 A.580%? 95%? 800ml 950mL ? ,档
GB/T40253?2021 A.675%? 750mL 95%? 950mL ? ,档 A.7 70%? 700ml 95%? 950m ? , A.850%? 95%? 500ml ? 950ml ,
GB/T40253一2021 附录 B 资料性) 显微镜检查组织法观察马可尼小胞虫形态图 B.1组织印片检测法 组织印片检测法示例见图B.1 OIfrem6 20Hm 说明: 粗箭头示血细胞内马可尼小胞虫，细箭头示细胞外马可尼小胞虫 马可尼小胞虫感染长牡蛎(Crassostreagigas)闭壳肌泡状结缔组织 图B.1 B.2组织病理检测法 组织病理检测法示例见图B.2
GB/T40253一2021 说明 箭头示结缔组织细胞内马可尼小胞虫,直径24m44m 图B.2马可尼小胞虫感染长牡蛎消化腺泡状结缔组织
GB/T40253一2021 录 附 C 资料性) 牡蛎小胞虫病及其病原简介 牡蛎小胞虫病主要是由马可尼小胞虫(Mkroeytomackini)感染牡蛎等双壳贝类,引起结缔组织 血细胞浸润、组织坏死,进而导致闭壳肌,外套膜等部位的泡状结缩组织产生水泡、脓肿、溃疡和个体死 亡的疫病 患病严重的牡蛎(2年以上成贝)外套膜具有肉眼可见的脓肿和溃疡,脓肿由颗粒细胞和透 明细胞组成,并包含有24m4m的小胞虫体 由于该病最早发现于加拿大的丹名岛(DenmanIs land),因此通常被称作丹名岛病(DenmanIslandDisease) 最初发现该寄生虫主要感染长牡蛎(Cras sotrreagigas),随后在美国加利福尼亚州沿岸的熊本牡蛎(C.sikamea)中检测到该寄生虫 20世纪 60年代,位于低潮线处较大牡蛎(3年以上成贝)的死亡率可达40%左右 温度低于10C和高盐度可 以促使本病暴发 世界动物卫生组织(OIE) )水生动物卫生法典(2016版)将引起该病发生的主要病原 (马可尼小胞虫)列为需通报的贝类动物病原 马可尼小胞虫病主要发生在加拿大的西南海岸,其分布遍及加拿大多个地区 在美国加利福尼亚 和华盛顿州也发现有马可尼小胞虫感染案例;自加拿大出口到法国的欧洲牡蛎中曾检测到马可尼小胞 虫 从我国黄海北部长牡蛎中检测到一种低感染率的小胞虫未定种(Mikrocytossp.);该种小胞虫序列 与马可尼小胞虫的相似度为 虽然目前我国尚无马可尼小胞虫的感染案例,随着近年来我国从马 890 可尼小胞虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益增多,该病对我国贝类养殖业构成潜在威胁 马可尼小胞虫的宿主范围非常广泛,除天然宿主外,在人工感染条件下,该寄生虫可以感染欧洲牡 O. 蛎(O edwi),奥林匹亚牡蛎(O. strea luridla ochaphila)和美洲牡蛎(c rginica)等 目前 已知象拔蚌(Panopeabrupta)和菲律宾蛤仔(Vvenerupis ，hilphinarwm)对马可尼小胞虫感染具有 抗性 e)和 马可尼小胞虫的生长发育主要包括三个阶段:休眠期quiescentstage),囊泡期(vesicularstage' 内体期(endosomalstage) 休眠期的小胞虫又称为休眠细胞(quiescentcells,QC),主要分布于囊状结 缔组织、血淋巴细胞以及闭壳肌和心肌细胞 QC有一个细胞核,核内具颗粒状染色质,胞质内有高尔 基体和囊泡体图C.l) 囊泡期的小胞虫又称为囊泡细胞(vesicularcels,VC),仅在肌细胞内及其周边 细胞外)被观察到 VC内细胞核增大为一个池腔(eisternalchamber),膜结构的高尔基体消失,胞质 内散布大小不等囊泡体(Iv)(图C.2) 内体期小胞虫又称为内体细胞(endo omalcels,EC),分布于血 淋巴细胞内或细胞外和囊状结缔组织,但肌细胞内及周边观察不到ECc EC整体形状与QC非常相似、 但VC胞质内细胞器更加多样,主要有球状厚壁体(stb),吻合内质网(aER)(图C.3).
GB/T40253一202 比例尺，500nm 比例尺:500mmm 标引序号说明: 标引序号说明: -类高尔基体(Golgi-likecisternae) aER -吻合内质网anastomosingendoplasmiecretieulum) lb -类溶酶体(lysosome-likebody); Ib -类溶酶体(lysosome-ikebody); I lv 囊泡体(largevesicles); -囊泡体(largevesicles); 核(nucleus) -核(nucleus) 图c.1休眠期小胞虫 图c.2囊泡期小胞虫 比例尺:500nm 标引序号说明 aER 吻合内质网(anastomosingendoplasmicreticulwm) 有被囊泡(coated vesicles cv endosome-likelbodies) 类内体(e G 类高尔基体(Golgilke cisternae; 颗粒物(gram 1ularmmateria; gm 类溶酶体(Iysosome-likebody); b 囊泡体(largevesicles); 核(nucleus); stb -球状厚壁体(spheriealthick-walledbodies); tvs 高尔基体样微管泡结构(Golgi-liketubuovesieularstrueture 图C.3内体期小胞虫 10

GB/T40253-2021 牡蛎小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法

牡蛎是世界各地都十分重要的海产品，其可供食用的部位广泛，包括肉质和壳体。但是，牡蛎也容易发生多种疾病，如牡蛎小胞虫病。该病由小胞虫寄生于牡蛎体内引起，可导致牡蛎死亡和商业价值的下降。因此，在养殖和出售牡蛎时必须进行有效的检测和诊断。

GB/T40253-2021 标准是针对牡蛎小胞虫病的诊断规程制定的。该标准规定了显微镜检查组织法的具体步骤和要求。显微镜检查组织法是通过对牡蛎体内组织进行显微镜观察，从而判断是否存在小胞虫的一种方法。

在进行样品处理时，应使用清洁无菌的工具进行操作，并尽可能避免损伤组织。将处理好的样品放置在载玻片上，并加入苏木精-伊红染色剂。随后，在显微镜下观察和分析组织切片中的各个部分，以判断是否存在小胞虫。

显微镜检查组织法可以迅速且准确地诊断小胞虫病，并可用于监测牡蛎的健康状况。同时，该方法也可作为其他诊断方法的补充，以提高诊断的准确性和可靠性。GB/T40253-2021 标准为保护和监管牡蛎资源提供了重要的技术支持。

总的来说，牡蛎小胞虫病是牡蛎养殖中常见的疾病之一，需要及时、准确地进行诊断和治疗。GB/T40253-2021 标准的发布为牡蛎小胞虫病的诊断提供了标准化的方法和要求，将有助于保障牡蛎资源的健康和可持续发展。

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