GB/T16550-2020
新城疫诊断技术
Diagnostictechniquesfornewcastledisease
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2020-12-14
- 文件格式PDF
- 文本页数16页
- 文件大小1.35M
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新城疫诊断技术
国家标准 GB/r16550一2020 代替GB/T165502008 新城疫诊断技术 Dagnostietechniquesforneweastledisease 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T16550一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T16550-2008《新城疫诊断技术》,与GB/T165502008相比,主要技术变化 如下 修改了血凝和血凝抑制试验判定结果(见7.3和7.4,2008年版的5.3和6.3) -删除了毒力评价指标中MDT和IVPI(见2008年版的4.3和4.4); -增加了实时荧光RT-PCR检测方法(见第9章) 请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本标准由农业农村部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位:动物卫生与流行病学中心、扬州大学
本标准主要起草人刘华雷、王静静、 、于晓慧、吕艳、吴艳涛、胡顺林、郑东霞、赵云玲、刘文博、 刘秀梵、王志亮
本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB165501996,GB/T165502008
GB/T16550一2020 引 言 2wcastlediseasevirus， 新城疫(Newcastledisease,ND)是由新城疫病毒(Ne NDV)强毒株感染禽类 引起的一种急性、烈性传染病,给世界养禽业造成巨大的经济损失
世界动物卫生组织(OIE)将新城疫 列为法定报告的动物疫病,我国农业农村部将其列为一类动物疫病 新城疫病毒可感染240多种禽类,其中家鸡和珠鸡最易感,感染禽(野鸟)及带毒禽(野鸟)系主要的 传染源
新城疫病毒主要经消化道和呼吸道传播,被污染的水、饲料、蛋托(箱、种蛋、鸡胚和带毒的野 生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为传播媒介
新城疫病毒属于副黏病毒科(Paramyxoviridae),正禽腮腺炎病毒属(Orthoavulavirus),目前新城 疫病毒只有一种血清型,但可分为多种基因型
oE规定,新城疫是由新城疫病毒强毒株引起的禽类 感染,因此,对于新城疫的诊断,除了鉴定新城疫病毒之外,还需要对其致病性进行评估
对于致病性评 估的方法,可通过1日龄SPF鸡ICPI进行测定,也可通过分子生物学技术,如RT-PCR结合序列测定 一420n)差异,可将新城疫病毒分为ClassI和ClasI两 等
根据新城疫病毒F基因部分序列(47nt 大类,其中ClassI在国内均系弱毒株,因此-针对ClassINDV的检测方法不具有诊断意义,本标准所 涉及的诊断方法均针对ClassI新城疫强毒株
GB/T16550一2020 新城疫诊断技术 范围 本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应 RT-PCR)和实时荧光RT-PCR(Real-timeRT-PCR)的技术要求 本标准适用于新城疫的诊断、检疫、检测监测和流行病学调查等
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则 缩略语 下列缩略语适用于本文件
Ct值;每个反应管内的荧光信号量达到设定的阂值所经历的循环次数(Cyclethreshold DEPC;焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonatey HA;血凝(Hemagglutinin) Hl;血凝抑制(Haemaglutinationinhibition) CPI;脑内接种致病指数(Intracerebralpathogenieityindex) ND新城疫(Newcastledisease) NDV;新城疫病毒(Newcastlediseasevirus) PS;磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline' RBC;鸡红细胞悬液(RedbloodcelI RNA:核糖核酸(Ribonucleicaeid) RT-PCR;反转录聚合酶链式反应(Reversetranscription-polymerasechainreaction) Real-timeRT-PCR;实时荧光RT-PCR(Real-timereversetranseription-polymerasechainreac ion SPF;无特定病原体Speeifiepathogenfree) 临床诊断 4.1流行病学 4.1.1宿主范围广,鸡,火鸡、鹌鹑、鸽、鹅等多种家禽及野禽均易感,鸭也可感染
4.1.2传染源主要为感染禽(野鸟)及带毒禽(野鸟),主要经消化道和呼吸道传播,被污染的水、饲料、 蛋托(箱、种蛋、鸡胚和带毒的野生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为主要的传播媒介
GB/T16550一2020 4.1.3该病无明显季节性，一年四季均可发生,春秋季多发 4.2 临床症状 4.2.1临床致病型 根据临床表现不同,临床致病型分为 嗜内脏速发型;以消化道出血性病变为主要特征,死亡率高; a b 嗜神经速发型:以呼吸道和神经症状为主要特征,死亡率高; 中发型:以呼吸道和神经症状为主要特征,死亡率低; c d 缓发型:以轻度或亚临床性呼吸道感染为主要特征; 无症状肠道型:以亚临床性肠道感染为主要特征
4.2.2典型症状 当病鸡出现下列之一或全部临床症状时,可作为初步诊断的依据之一: 发病急、病死率高; aa b) 体温升高、精神沉郁、呼吸困难、食欲下降; 粪便稀薄,呈黄绿色或黄白色 c d 发病后期出现扭颈,翅膀麻痹,瘫痰等神经症状; 免疫禽群出现产蛋下降,蛋壳质量变差,产畸形蛋或异色蛋
4.3剖检变化 当病鸡出现下列之一或全部剖检变化时,可作为初步诊断的依据之 全身黏膜和浆膜出血,以呼吸道和消化道最为严重,气管环状出血; a 腺胃黏膜水肿,乳头和乳头间有出血点 b 盲肠扁桃体肿大、出血、坏死; c d 十二指肠和直肠黏膜出血,泄殖腔黏膜出血,有的可见纤维素性坏死病变; 脑膜充血和出血; e 鼻窦、喉头、气管黏膜充血,偶有出血,肺可见淤血和水肿
4.4鉴别诊断 家禽感染高致病性禽流感病毒后,临床表现和死亡率与新城疫(ND)类似
与ND相比,高致病性 禽流感以全身器官出血为特征,包括:肿头,眼脸周围浮肿,鸡冠和肉垂肿胀、发紫、出血和坏死,腿及爪 鳞片出血等
在临床实践中,很难依据临床症状和剖检变化进行区分,应依靠实验室诊断进行鉴别
4.5结果判定 当禽类符合4.1,且符合4.2,4.3之一的,可判定为疑似新城疫
5 样品采集与处理 5.1总则 样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的家禽,可采集脑,肺脏、脾脏、肾、肠(包括内容 物),肝和心脏等组织脏器,也可采集未见明显临床症状禽类的泄殖腔和口咽拭子样品进行实验室诊断
采样过程中不得交叉污染,在田间采样应勤换一次性手套,每采集一个样品宜更换或消毒一次灭菌采样
GB/T16550一2020 器具,尽量做到无菌采集
样品采集,处理、保存和运输应符合GB19489和NY/T541的要求
5.2组织样品采集 典型临床发病禽可无菌采集脑、肺、啤、肾,肠包括内容物、气管,肝,心等组织脏器,装人无菌采样 袋或其他灭菌容器并编号,在一20C冷冻保存
5.3拭子样品采集 采集活禽样品时可采集口咽和泄殖腔拭子
取口咽拭子时应将拭子深人喉头及上愕裂来回旋转 2次一3次,要求可见明显黏液
采集泄殖腔拭子时应将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便
对 于鸽、珍禽等体型较小的禽鸟,采样时需用适合的拭子,避免因拭子取样给禽类造成损伤
将采集后的 拭子放人盛有2.0mL的PBs(0.01mol/L,pH7.0~7.4,含青霉素2000U/ml,链霉素2mg/mL10% 甘油)的采样管中,编号
用于病毒分离的拭子样品于-20冷冻保存,尽量避免反复冻融
5.4血清样品采集 无菌采集禽类的血液,每只2.0mL,用于新城疫抗体检测
无菌分离血清,装人2.0mL离心管中， 加盖密封后冷藏或冷冻保存
5.5样品运输 样品采集后置保温箱中,加人预冷的冰袋,密封,宜24h内送实验室
5.6样品处理 5.6.1生物安全措施 样品处理的生物安全措施按照GB19489和NY/T1948进行 5.6.2组织样品处理 用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品,置组织匀浆器充分研磨,置于含抗生素的PBs(0.01moL/L pH7.0~7.4)中,制成浓度为10%20%的悬浮液,冻融2次一3次,室温(20C一25C)静置1h~ 2h,3000r/min离心5min,取上清液转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用
5.6.3拭子样品处理 将采集的拭子样品在振荡器上充分混合后,将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子,室温静置作用 30min,3000r/min in离心5 ,取上清液转人无菌的1.5ml离心管中,编号备用
min 5.6.4样品保存 处理好的样品在28笔条件下保存应不超过24h
若需长期保存,应放置于一70C冰箱中 反复冻融不超过3次 病毒分离与鉴定 6.1 主要仪器设备 6.1.1孵化器
6.1.2冰箱(2C8C、一20C、一70C不同温度)
GB/T16550一2020 6.1.3台式高速冷冻离心机(最大离心力12000片以上)
6.1.4微量可调移液器10AL、100AL,200AL、1000L等不同规格). 6.1.51.0mL注射器(灭菌) 6.1.6 级生物安全柜 6.2试剂 6.2.10.01mol/LpH7.2PBS,见附录A
6.2.21%鸡红细胞悬液RBC),见附录B. 6.3操作程序 6.3.1鸡胚接种 用1.0mL注射器吸取上清液,按0.2mL/枚的剂量经尿囊腔接种9日龄1l日龄的SPF鸡胚,每 个样品至少接种5枚
接种后,37C38C继续孵育
18h后每12h照胚,观察鸡胚死亡情况
6.3.2病毒收获 收集18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚,置2C8C、4h或过夜,无菌收取鸡胚尿囊液
6.3.3病毒鉴定 6.3.3.1血凝(HA)试验:收获感染鸡胚尿囊液,测定其血凝活性
如果没有血凝活性或血凝效价 <3log2,则用初代分离的尿囊液于SPF鸡胚继续盲传两代,若仍为阴性,则认为新城疫病毒分离阴性
试验方法按7.3执行
6.3.3.2血凝抑制(H)试验;对于HA效价高于或等于4log2的尿囊液,应采用新城疫病毒标准阳性血 清进行血凝抑制试验以确认是否含有新城疫病毒
试验方法按7.4执行
6.3.4毒力测定 6.3.4.1 测定方法 经确定仅为新城疫病毒的情况下,应根据1日龄SPF鸡脑内接种致病指数(ICPI)测定病毒毒力
6.3.4.2操作程序 6.3.4.2.1HA效价高于或等于4log2的新鲜感染尿囊液(不超过24h48h,细菌检验为阴性),用无 菌等渗盐水作10倍稀释
6.3.4.2.2脑内接种出壳后24h40h之间的SPF雏鸡,共接种10只,每只接种0.05mlL
6.3.4.2.3每24h观察一次,共观察8d
每天观察应给鸡打分,正常鸡记作0,病鸡记作1,死鸡记作?(每只死鸡在其死后的每日观察 6.3.4.2.4 中仍记作2
6.3.4.2.5ICP是每只鸡8d内所有观察数值的平均数,计算方法见公式(1). 习.×1+习×2 CPI一 式中 习y -8d累计发病数 8d累计死亡数 Y T -8d累计观察鸡的总数
GB/T16550一2020 6.3.4.3结果判定 6.3.4.3.1ICPI值越大,NDV致病性越强,最强毒力病毒的ICPI接近2.0,而弱毒株的ICPI值为0. 6.3.4.3.2ICPI>0.7,可判为阳性
血凝试验和血凝抑制试验 7.1主要仪器设备 7.1.1微型振荡器
7.1.2微量可调移液器(10AL、,100AL.200AL、1000L等不同规格)
7.1.396孔V型血凝板
7.2试剂 7.2.1PBS;见附录A
7.2.21%鸡红细胞悬液(RBC);见附录B. 7.2.3新城疫病毒标准阳性抗原,新城疫病毒标准阳性血清,阴性血清
7.3血凝试验 7.3.1在96孔V型微量血凝板1孔12孔均加人25AL.PBS 7.3.2在第1孔中加人25Al抗原或病毒悬液,吹打3次5次,充分混匀
7.3.3 将抗原或病毒悬液在反应板上进行系列信比稀释,即从第1孔中吸取25A悬液至第2孔,混匀 后再吸取25AL悬液至第3孔依次进行倍比稀释到第11孔.最后从第11孔吸取25aL弃去,第12孔 不加抗原或病毒悬液,作为PBS对照
7.3.4每孔加人25aLPBs
7.3.5每孔加人254L体积分数为1%的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人)
将微量反 应板在微型振荡器振荡混匀或轻扣反应板混匀反应物,室温静置20min~30min或2C一8C静置 6o min,当对照孔(第12孔)红细胞呈显著纽扣状时判定结果
7.3.6结果判定;将反应板倾斜,观察红细胞有无泪珠状流淌
以完全凝集(不流淌)的最高稀释倍数 为抗原或病毒悬液的血凝效价
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)
7.4血凝抑制试验 7.4.1根据测得抗原或病毒悬液血凝效价配制4单位抗原(4HAU)
4HAU的配制方法如下;假设抗 原的血凝效价为8log2(1;256),则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64(256除以4),稀释时,将1ml 抗原加人63mLPIS中即为4HAU抗原
7.4.24HAU检测:4单位抗原应现用现配,在使用前进行标定
将配制的4HAU进行系列稀释,使 最终稀释度分别为1:2,l:3、1:4、l5、l:6和1:7,然后按照7.3进行血凝试验
如果配制的抗原 液为4HAU,则1;4稀释度将给出凝集终点;如果4HAU高于4个单位,可能1:5或1:6为终点; 如果较低,可能1:2或1:3为终点
应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整,使工作液确为 4HAU
7.4.3取96孔V型微量血凝板,用移液器在第1孔第11孔各加人25LPBS,第12孔加人 50L
PBS 7.4.4在第1孔加人25L
血清,充分混匀后移出25L至第2孔,依次类推,倍比稀释至第10孔,并 从第10孔弃除25AlL
GB/T16550一2020 74.5在第1孔一第1孔各加人25L
4HAU抗原,振荡15s,使液体混合均匀,室温静置至少 20min或2C8C至少601 min
min40minn 7.4.6在第1孔第12孔每孔加人25AL1%的鸡红细胞悬液,振荡混匀,室温静置20 或2C一8C静置40min一60min,对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果
第11孔为抗原对照,第12孔为PBS对照,每次测定还应设已知效价的标准阳性血清和阴性血 清作对照
7.4.8结果判定:将反应板倾斜,从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕状流淌
以完全抑制 4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的H抗体效价
只有当阴性血清对照孔血清效价<2log2. 阳性血清对照孔血清效价与标定效价相差<1个滴度,红细胞对照无自凝现象时,试验结果有效
HH 效价<3log2,判为HI试验阴性;Hl效价>4log2判为HI试验阳性
8 反转录聚合酶链式反应(RT-CR 8.1主要仪器设备 8.1.1PCR扩增仪
8.1.2台式高速冷冻离心机:最大离心力12000g以上
8.1.3I级生物安全柜
8.1.4微量可调移液器(2ML、10AL,100AL,200AL、1000L.等不同规格),及其配套的无核酸酶处 理的离心管与吸头
8.1.5电泳仪
8.1.6电泳槽
8.1.7紫外凝胶成像仪
8.2试剂 8.2.1RNA提取试剂Trizol
也可用商品化RNA提取试剂盒,或其他等效RNA提取试剂和方法,如 自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取
8.2.2三氧甲婉氧仿). 8.2.3异丙醇(分析纯 8.2.475%乙醇;用新开启的无水乙醇(分析纯)和DEPC处理水按3:1配制而成，-20C预冷
8.2.5RT-PCR相关试剂:可选择商品化试剂盒
8.2.6阳性对照:灭活的新城疫强毒感染鸡胚尿囊液
8.2.7阴性对照SPF鸡胚尿囊液
8.3操作程序 8.3.1样品准备 取处理后的拭子样品、组织样品或尿囊液3000r/min离心5min,取200ML离心后的上清提 取RNA
8.3.2病毒RNA提取 RNA提取应保证无细菌及核酸污染,实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用
提取RNA 时应避兔RNA酶污染
用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下 在无RNA酶的1.5ml离心管中加人200L检测样品,然后加人1mlTrizol,振荡20s,室 a
GB/T16550一2020 温静置10min b 加人200L.三氧甲烧(氧仿),颠倒混匀,室温静置10n min,12000r/min离心15min. 管内液体分为三层,取500AL上清液于离心管中,加人500L预冷(一20C)的异丙醇,颠倒 c min
120001 》/min离心15min沉淀RNA,弃去所有液体(离心管在吸水纸上 混匀,静置101 控干. d 加人700ML预冷(一20C)的75%乙醉醇洗涤颠倒混匀2次3次
12000r/min离心 10min.
调水浴至60c
离心管在室阖下干燥至没有水滴
加人40ALDEPC处理水,60C水浴中 作用10min,充分溶解RNA,一70C保存或立即使用
8.3.3配置Rr-CR反应体系 8.3.3.1引物 引物针对新城疫病毒F基因设计，上游引物P1的序列为5'-ATGGGCcYcCAGAYCTTcTAC3' 下游引物P2的序列为5'-CTGcCACTGCTAGTTGTGATAATcc-3',Y为兼并碱基(Y:c/T)
8.3.3.2RT-PCR反应体系配置 RT-PCR反应体系配置见表1
体系配好后盖紧PCR反应管盖,并做好标记 表1RT-PCR反应体系配置表 体积 组分 "l 无RNA酶灭菌超纯水 14.6 10×反应缓冲液 2.5 dNTPs RNase抑制剂(40U/al 0.5 AMV反转录酶(5U/AL 0," 入 Tq酶(5U/pL 0.7 ol/L 0.5 上游引物PI(201 0Amol 下游引物P2(204mol/L 0.5 模板RNA 合计 25 8.3.4RI-PC反应 按8.3.3.2的加样顺序全部加完后,充分混匀,瞬时离心,使液体都沉降到PCR管底
同时设立阳 性对照和阴性对照
按照下列程序进行扩增;42C反转录30min;95C预变性3nmin;94C变性30s 55C退火30s72C延伸45s,共进行35次循环;最后,72C再延伸7min
最终的RT-PCR产物置 保存
8.3.5扩增产物电泳检测 8.3.5.11.5%琼脂糖凝胶板的制备;称取1.5g琼脂糖,加人100mL1×TAE缓冲液中
加热融化后
GB/T16550一2020 加5AL(10mg/mL)澳乙锭,混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右
依据样品 数选用适宜的梳子
待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲 液淹没胶面
8.3.5.2加样取5LPCR产物与0.5L10×加样缓冲液混匀后加人琼脂糖凝胶板的一个加样孔中 每次电泳同时设标准DNAMarker,阴性对照、阳性对照
min40min
8.3.5.3电泳:接通电源,120V恒压电泳301 8.3.6观察与记录 电泳结束后,取出凝胶板置凝胶成像仪(或紫外线透射仪)上观察并记录结果
8.4结果判定 8.4.1试验成立条件;阳性对照出现535bp左右扩增条带(参见附录C),同时阴性对照无扩增条带
8.4.2检测样品出现535bp左右的目的片段(与阳性对照大小相符),判为新城疫病毒核酸阳性;检测 样品未出现目的片段,判为新城疫病毒核酸阴性
8.5ND强毒感染的确定 对扩增到的目的片段进行序列测定,根据序列测定结果,对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分 析
如果毒株F2蛋白的C端有“多个碱性氨基酸残基”,F1蛋白的N端即117位为苯丙氨酸,可确定 为新城疫病毒强毒感染
“多个碱性氨基酸”是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位残基之间至少 有三个精氨酸或赖氨酸
g 实时荧光RT-PCRReal-timeRT-PCR) g.1主要仪器设备 9.1.1荧光定量PCR仪
g.1.2其余器材同8.1.2~8.1.4
g.2试剂 按8.2执行
9.3引物和探针 根据我国流行的所有基因型(基因V、、和型)新城疫强毒F基因序列设计引物,探针
其中正 向引物NDV-la序列为5'-CTCAGACAGGG:TCAATCATAGT-3',反向引物NDV-b序列为5'-GCAAC CCCAAGAGCTACA-3'
探针NDV-Ip序列为5'-ATRAAGCG,TTTYTGYCTCCTTCCTCCc-3'
探针 5'端连接FAM荧光基团,3'端连接BHQ-1淬灭基团,R、Y为简并碱基(R:A/G;Y:C/T). g.4操作程序 9.4.1样品准备 按8.3.1执行
9.4.2病毒RNA的提取 按8.3.2执行
GB/T16550一2020 g.4.3实时荧光RT-CR反应 g.4.3.1按照表2配置实时荧光RT-PCR反应体系,盖紧盖子并做好标记
表2实时荧光Rr-PCR反应体系配置表 体积 组分 Al DEPC处理水 10 2×反应混合液 正向引物NDV-Ia(20mol/I 0.5 反向引物NDV-b(20mol/I 0.5 探针NDV-lp(10Mmol/L) 0.5 RT/TaqMix 0.5 模板RNA 合计 20 9.4.3.2按9.4.3.1l的加样顺序全部加完后,充分混匀,瞬时离心,使液体都沉降到PCR管底
同时设 立阳性对照和阴性对照
将PCR管放在荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增,反应条件为;50 反转录301 min; 95C预变性3min;然后94C变性15s,59C退火1 min， ,共进行45次循环
每次循环 在59C min时搜集信号
9,4.4 质控标准 g.4.4.1阳性对照扩增曲线呈标准的S形曲线,且Ct值<30(参见附录D)
9.4.4.2阴性对照无Ct值,且无扩增曲线
g.5结果判定 9.5.1样品无Ct值或Ct值>38且无标准扩增曲线,判为阴性
g.5.2样品c'值<35,且出现标准的s形扩增曲线,判为阳性
g.5.3样品35
GB/T16550?2020 ? A 淶??) 0.01mol/LpH7.2λ?(PBs) 0.01mol/IpH7.2λ?(PBS)? ?(NaCI)8.0g; a b) (KC)0.2g (Naa.HPO.1.44g c (KH,PO.0.24g; d) ?800mL e ??,HClpH7.2?0.1,??1000mL,121C? 15min 0
GB/T16550一2020 录 附 B 规范性附录 1%鸡红细胞悬液RBC)制备 Alserve液配制 B.1 葡萄糖2.05g,柠檬酸钠0.8g,柠檬酸0.055g,NaCl0.42g,加蒸馏水至100mL,混匀,pH值调至 6.1,在121C、15min高压灭菌,置4C备用
B.21%RBC制备 用Alserve液作为抗凝剂,采集至少3只SPF公鸡或无新城疫抗体的非免疫鸡的抗凝血液,放人离 心管中,加人3倍一4倍体积的PBS混匀,以2000r/min离心5 5min~10min,去掉血浆和白细胞层,重 复以上过程,反复洗涤3次一4次,至洗净血浆和白细胞,2000r/min离心10min,最后吸取压积红细 胞用PBS配成体积分数为1%的悬液,于4C保存备用
B.3注意事项 B.3.1采集的抗凝血液保存时间不超过24h,制备的1%红细胞悬液最好现配现用
B.3.2当检测除鸡外的其他禽(如水禽、鸽)血清时,可用与待检血清宿主来源相同的1%红细胞进行血 凝抑制试验,禽1%RIBC制备方法按B.2执行
B.3.3有些禽类血清(如水禽、鸽)可能对鸡红细胞产生非特异性凝集,需先用待检血清做血凝试验,如 果待检血清出现红细胞凝集现象,则说明有非特异凝集素存在,需用鸡红细胞对待检血清进行吸附,具 体方法为;每0.5ml血清中加人25AL鸡红细胞,轻摇后静置至少30min,800哲离心2min~5min 收集上清液,即为处理后的血清
用处理后的血清进行Hl试验时,需设处理阳性血清对照
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GB/T16550?2020 ? ??) ??r-PCR?? ??RT-PCR???c.1 bp 2000 1000 750 535bp 500 250 0o ? M -DNA?(DL.2000Marker); ???? ?C.1??Rr-PCR?? 12
GB/T16550一2020 附 录D 资料性附录 新城疫强毒实时荧光Rr-PCR检测阳性参照图 新城疫强毒实时荧光RT-PCR检测阳性参照图见图D.1
扩增曲线 5000 4000 3000 2000 1000 20 30 循环数 说明 阳性对照; -阴性对照 3 -阔值线; RFU 相对荧光单位(G relativefluorescenceunits 图D.1新城疫强毒实时荧光RI-PCR检测阳性参照图 13
新城疫诊断技术GB/T16550-2020
什么是新城疫？
新城疫（SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome）是一种由冠状病毒引起的急性呼吸道传染病。该病毒具有较强的传染性和致死性，对全球公共卫生安全构成了威胁。
GB/T16550-2020标准简介
为了规范新城疫的检测和诊断工作，国家卫生健康委员会制定了《新城疫诊断技术标准》（GB/T16550-2020）。该标准涵盖了新城疫的实验室检测、临床诊断等方面，为新城疫的防控提供了可靠的技术支持。
GB/T16550-2020标准主要包括以下内容：
- 新城疫病毒核酸检测方法和技术要求；
- 新城疫抗体检测方法和技术要求；
- 新城疫病毒分离、鉴定和保存的技术要求；
- 临床诊断标准和诊断流程。
GB/T16550-2020的意义
GB/T16550-2020标准的制定，为新城疫的检测和诊断提供了统一的技术规范和标准。对于加强公共卫生安全和防控疫情具有重要意义。
此外，GB/T16550-2020标准还可以为相关企业和机构提供参考，规范其实验室检测和临床诊断工作，提高诊断效率和准确性。
结语
新城疫是一种危险的传染病，在全球范围内造成了不少人员伤亡和经济损失。制定和实施科学规范的检测和诊断标准，对于有效防控新城疫、保障公共卫生安全具有极为重要的意义。
