国家标准 GB/T38577一2020 植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法 Determinationofthebiologiealactivityforplanthormone-relatedsecondary metabolites一Indicatorplantmethod 2020-03-31发布 2020-03-31实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38577一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由标准化研究院提出并归口本标准起草单位:计量大学、标准化研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院本标准主要起草人:张雅芬、叶子弘、黄超群、马爱进、俞晓平、申屠旭萍、许益鹏、崔海峰、李翼、陈丽、吴娟
GB/38577一2020 植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法范围本标准规定了用指示植物法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法本标准适用于植物激索类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语、定义和缩略语 3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 植物激素类次生代谢产物planthrmnerelaesedarymeabolites 来自植物自身合成的以及通过微生物发酵或化学合成获得的调控植物生长、发育与休眠的活性物质 3.1.2 生物活性boogiealactivity 等浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值 3.2缩略语下列缩略语适用于本文件 GA:赤霉酸(gibberellicacid NAA:茶乙酸(1-naphthylaceticacid ZT:玉米素(zeatin 原理 -定浓度范围内,植物激素类活性物质的浓度与其促进相应指示植物的特定组织生长或特定物质合成的能力成正比以标准物NAA为参照,根据小麦胚芽鞘相对伸长量和NAA浓度对数的线性回归关系得到标准曲线,计算在线性范围内使胚芽鞘的相对伸长程度相当的NAA浓度与试样浓度的比值，表示1mg/ml试样所具有的生长素活性;以标准物ZT为参照,根据尾穗范子叶中范红素合成量和ZT
GB/T38577一2020 浓度对数的线性回归关系得到标准曲线,计算在线性范围内使苑红素合成量相当的ZT浓度与试样浓度的比值,表示1mg/mL试样所具有的细胞分裂素活性;以标准物GA，为参照,根据大麦种子糊粉层中a-淀粉酶活性和GA浓度对数的线性回归关系得到标准曲线,计算在线性范围内使诱导产生的c-淀粉酶活性相当的GA浓度与试样浓度的比值,表示1mg/ml试样所具有的赤霉素活性试剂或材料 S 除非另有规定,仅使用分析纯试剂,水为GB/T6682规定的一级水 5.1小麦种子小麦(TrilicumaesivumL.),长麦6135 当年采收,颗粒饱满,发芽率>90% 5.2尾穗苑种子尾穗楚(Amaroanhas.caudaiasL),红色品种当年采收,颗粒饱满,发芽率>90% 5.3大麦种子大麦(H0o lordewmvulgareL),二棱大麦当年采收,颗粒饱满,发芽率>90% 5.41%次氯酸钠溶液量取100ml.10%次氯酸钠,用水定容至1000mL,临用前配制 5.50.1%(W/)淀粉溶液称取可溶性淀粉1.00g,加水至50ml,加热至完全溶解后,再加人磷酸二氢钾8.16g,待其溶解后用水定容至1000ml 临用前配制 5.6I-KI溶液称取碘化钾0.60g,碘0.06g,用0.05mol/L的盐酸溶解并定容至1000mL,临用前配制 5.71×10-月mo/I乙酸缓冲液称取三水合乙酸钠0.136g,用水溶解后定容至1000ml,配制成1×10-mol/1的乙酸钠溶液;用移液枪吸取57AL乙酸溶液,用水定容至1000ml,配制成1×10-mol/L的乙酸溶液分别量取 590mL1×10-mol/儿L的乙酸钠溶液与410mL.1×10-”mol/儿L乙酸溶液,混合后,加人1g链霉素，摇匀 5.8含L-酪氨酸的磷酸缓冲液称取L-酪氨酸0.20g,用5.5mL0.5mol/L的盐酸溶解;称取十二水合磷酸氢二钠2.39g,磷酸二氢钾0.1g,用水容解后定容至100ml.,配制成1/15nmol/几的磷酸缓冲液(pH7.0) 将两者混匀后定容至500nmL .4C保存备用 5.9磷酸-柠檬酸缓冲液,pH5.0 称取磷酸氢二钾1.80g,柠檬酸1.02g,蔗糖20g,加人900ml水溶解后用pH计测量并调整pH 至5.0,用水定容至1000ml,充分混匀后,4C保存备用
GB/38577一2020 5.10NAA 纯度>98% 5.11GA，纯度>98% 5.12T 纯度>98% 5.131mg/mlNAA标准贮备液称取10,0mgNAA标准品,用0.5ml无水乙醉溶解,用水定容至10ml,充分混匀后,4C冰箱冷藏,保存期1个月 5.141mg/mLGA，标准贮备液称取10.0nmgGA标准品用0.5mL无水乙醇溶解,用水定容至10mL,充分混匀后,4C冰箱冷藏，保存期1个月 5.151mg/mLZI标准贮备液称取10.0mgZT标准品,用0.5ml无水乙醇溶解,用水定容至10mL,充分混匀后,4C冰箱冷藏,保存期1个月 5.16NAA标准工作液吸取1mL1mg/nLNAA标准贮备液,加人至9mL磷酸-柠檬酸缓冲液中,混匀,得1x×10-mg/ml NAA溶液依次10倍稀释得1.00×10-'mg/ml1.00×X10-mg/mL,1.00×10-mg/mlNAA标准工作液吸取316AL1mg/mLNAA标准贮备液,684AL磷酸-柠檬酸缓冲液,混匀,得3.16×10-'mg/ml NAA溶液依次10倍稀释得3.16×10-mg/mL,3.16×10-mg/mLNAA标准工作液临用前配制 5.17GA，标准工作液吸取1mL1mg/mLGA标准贮备液,加人至9ml乙酸缓冲液中,混匀,得1×10-'mg/m溶液依次10倍稀释得1.00×10'mg/mL、l.00X10'nmg/mlLl.00×10mg/mLG.A，标准工作液吸取316nl1mg/ml.GA，标准贮备液,684alL乙酸缓冲液,混匀,得3.16×10-'mg/mLGA，溶液依次10倍稀释得3.16×10-mg/mlL3.16×10-》mg/mlL3.16×10-”mg/mLGA，标准工作液临用前配制 5.18ZT标准工作液吸取1mL1 mg/mlZT标准贮备液,加人至9ml含L酪氨酸的磷酸缓冲液中,混匀,得1×10-" mg/mL.Z溶液依次10倍稀释得l.00×10-nmg/ml、1.00×10-mg/mL,1.00×10-mg/ml.Z标准工作液吸取316lL1mg/ml.ZT标准贮备液,684AL含L酪氨酸的磷酸缓冲液,混匀,得3.16×10 mg/mLZT溶液依次10倍稀释得3.16×10-‘mg/mL、3.16×10-》mg/mLZT标准工作液临用前配制
GB/T38577一2020 6 仪器设备 6.1离心机:10000×g 6.2紫外分光光度计 6.3pH计:精度0.01 l迟.0.001 6.4电子分析天平;精度1g,0.01 生化培养箱.25C士1C,遮光处理 6.5 6. 摇床:25亿士1它,遮光处理体式显微镜;带图像处理系统 6.7 6.8绿光暗室;波长492nm455nm. 6.9研磨珠;直径1mm2mm 6.10恒温水浴锅:30C士1C 6.11高速震荡研磨仪样品 7.1样品采集保存用电子分析天平称量大于10mg从植物、微生物发酵液中提取纯化或化学合成的待测物质纯品用10mL乙醇溶解,记录待测物质浓度cmg/mL) 然后进行分装,4C低温避光保存,至少分装 3份,其中分装后每小份不少于1 ml 用电子分析天平称量约1000mg供试固态产品,用10ml产品说明书规定的试剂溶解,或用量筒量取10ml液态产品,按产品说明书中说明的待测物质的含量计算待测物质浓度,记为c,(mg/ml. 然后进行分装,按产品说明书要求保存,至少分装3份,其中分装后每小份不少于1ml 7.2试样制备试验时按不同检测对象选择相应的缓冲液(参见附录A),在1×10-“mg/mL1×10-mg/mL范围内将样品进行5倍或10倍梯度稀释,稀释后浓度记为c.(mg/mL) 试样至少制备3个浓度梯度,每个浓度样品至少重复测量3次试验步骤 8 8.1生长素测定 8.1.1小麦胚芽鞘切段获取小麦种子用现配1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min,燕憎水洗净,重复一次然后在无光照的 25C生化培养箱中培养至幼苗长约25mm~35mm时,选取长度为25mm30mm的幼苗株,从基部取下芽鞘,在绿光暗室中切去3n 3mm~5mm顶端,切取接下来的约6mm切段,放人磷酸-柠檬酸缓冲液中,在25C摇床中摇1.5h(<80 r/min),每0.5h换一次溶液 8.1.2胚芽鞘长度测量将获取的胚芽鞘切段置于体式显微镜下测量后记录长度(L),一对一做好标记后,分别置于等量的磷酸-柠檬酸缓冲液,不同浓度的NAA标准品工作液以及不同浓度的试样溶液中,生化培养箱25C
GB/38577一2020 培养24h 然后将处理后的胚芽鞘置于体式显微镜下测量并记录长度(L) 计算每个胚芽鞘实际伸长长度AL.,取重复测试结果绝对差值不超过算术平均值的20%的5组数据以磷酸-柠檬酸缓冲液处理后胚芽鞘实际伸长长度的平均值L 为对照 8.1.3标准曲线绘制参照附录A中表A.1进行数据测量记录及计算以L /AL 计算标准品工作液处理后胚芽鞘的相对伸长程度,以10为底取标准品工作液浓度的对数值为自变量,以处理后胚芽鞘切断的相对伸长程度为因变量y,绘制标准曲线 8.1.4测量参照表A.l测量并计算试样处理后胚芽鞘的相对伸长程度(AL./AL)yy值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验,记录试样浓度c.,无效试验所获得的数据舍去然后依据有效y值从标准曲线中计算r,按式(1)计算试样中生长素类物质的生物活性,若有多个有效y值,则按式(1)计算后取其平均值 10" C0 EAaa 式中生长素的生物活性,单位为E; EAm C 待测试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/ml); 标准工作液浓度的对数值; -稀释后试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL) 以3次以上独立实验结果的平均值为试样的生长素活性定值,计算结果保留三位有效数字 8.2细胞分裂素测定 8.2.1尾穗苑幼苗的获取将2g左右的尾穗览种子用现配的1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min,蒸僧水洗净,重复一次然后置于25C生化培养箱吸胀5h,然后平铺在培养皿中用9mL蒸僧水湿润的两层18cm定性滤纸上覆膜加盖,25C黑暗培养72h后选取子叶大小均一的黄化幼苗 8.2.2苑红素浓度测量随机选取30株黄化幼苗作为一个试验单元,分别用等量的含L-酪氨酸的磷酸缓冲液、不同浓度标准品工作液和不同浓度的试样溶液在25C生化培养箱中诱导培养48h,然后选取大小,颜色相对均一的子叶40个转人盛有1mL蒸水的2mL离心管中,加人适量研磨珠,用高速震荡研磨仪在50Hz频率下震荡研磨5min破碎细胞用离心机10000离心5nmin后,取0.8mL上清液加人事先加好 4.2ml蒸馏水的离心管,以含1-酪氨酸的磷酸缓冲液调零,用紫外分光光度计测量,在波长为534nm 和650nm处分别读取光密度值ODa和OD.计算相碱的差数(oDa-OD)记为D.,指示览红素浓度计算含L-酪氨酸的磷酸缓冲液处理后的光密度值的平均值作为对照D 8.2.3标准曲线绘制参照表A.2进行数据测量记录并计算,以D 一D 指示标准品工作液处理后览红素浓度的增加值以10为底取标准品工作液浓度的对数值为自变量,以览红素浓度的增加值为因变量y,绘制标准曲线
GB/T38577一2020 8.2.4测量参照表A.2测量并计算试样处理后范红素浓度的增加值y,y值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验,记录试样浓度c,,无效试验所获得的数据舍去然后依据有效y值从标准曲线中计算.x,按式(2)计算试样中细胞分裂素类物质的生物活性,若有多个有效》值,则按式(2)计算后取其平均值 c ×10 EcTK (2 式中: Ee 细胞分裂素的生物活性,单位为E; cTK 待测试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/ml) Co 标准工作液浓度的对数值; 稀释后试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL C 以3次以上独立实验结果的平均值为试样的细胞分裂素活性定值,计算结果保留三位有效数字 8.3赤霉素测定 8.3.1大麦无胚半粒种子的获取将大麦种子横切两半,选择无胚的一半,用现配的1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min,蒸馏水洗净重复1次然后于湿润消毒滤纸上25C吸胀48h,然后在乙酸缓冲液中,以50r/min~ 100r/min摇 1.5h,每0.,5h换1次水,取出后轻轻吸干备用 8.3.2u-淀粉酶活性测量将已吸胀的10个大麦无胚半粒种子作为一个试验单元分别用1ml的乙酸缓冲液、不同浓度 GA，标准品工作液以及不同浓度的试样溶液诱导处理,在25C摇床中60r/min100r/min震荡培养将种子研醉混句后在离心机中1 100r/min离心5mmn,使种子碎屑沉淀，然后吸取上清液 24h 0.4ml至新的10mL离心管中,加人1.6mL0.1%淀粉溶液,混匀,30C水浴10min 再加人!-kKI浴液2mL,燕俪水定容至5ml,充分摇匀至溶液呈蓝色,以乙酸缓冲液调零,用紫外分光光度计测量,读取每管中溶液的OD值,指示a-淀粉酶活性计算乙酸缓冲液处理后的光密度值的平均值D，作为对照 8.3.3标准曲线绘制参照表A.3进行数据测量记录并计算,以D,一D，指示标准品工作液处理后a-淀粉酶活性的增加值以10为底取标准品工作液浓度的对数值为自变量,以-淀粉酶活性的增加值为因变量y,绘制标准曲线 8.3.4测量参照表A.3测量并计算试样处理后Q-淀粉酶活性的增加值(D,一D,)y,y值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验,记录试样浓度c.,无效试验所获得的数据舍去然后依据有效y值从标准曲线中计算r,按式(3)计算试样中赤霉素类物质的生物活性,若有多个有效y值,则按式(3)计算后取其平均值 c ×10 EA 式中赤霉素的生物活性,单位为E; E
GB/38577一2020 -稀释后试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); -标准工作液浓度的对数值; -待测试样的浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL C 以3次以上独立实验结果的平均值为试样的赤霉素活性定值,计算结果保留三位有效数字重复性在重复性条件下获得的3次独立测定结果的绝对值差值不得超过算术平均值的20%
GB/T38577一2020 附录 A 资料性附录) 检测数据记录表 A.1生长素活性检测数据记录见表A.1 表A.1生长素活性检测数据记录表对照组 NAA标准品溶液浓度/mg/mL 试样溶液浓度/mg/mL 测量指标磷酸-柠檬 1.00×10'3.l6×10-1.,00×10-]3.16×10-"1.00×10" 酸溶液 L1/4nm -- Lnn/4m L1/4m L./m L/丝m -*++++ L./m AL1/AL0 AL/AL 标准曲线 EA A.2细胞分裂素活性检测数据记录见表A.2 表A.2细胞分裂素活性检测数据记录表对照组 ZT标准品溶液浓度/(mg/ml 试样溶液浓度/(mg/'ml 1l 含l-酪氨酸测量指标 1.00×10-3.16×10-1.00×10-l3.16×10-1.00×10” 的磷酸缓冲液 oD )l OD3 OD1 ------
GB/38577一2020 表A.2(续》对照组 ZT标准品溶液浓度/mg/ml 试样溶液浓度/mg/ml 含L-酪氨酸测量指标的磷酸.00×10-3.16×10-1.00×10-'l3.16×10-.00×10 缓冲液 OD60" D D D D. ---- D D 标准曲线 EcTKk 赤霉素活性检测数据记录见表A.3 表A.3赤霉素活性检测数据记录表试样溶液浓度对照组 GA标准品溶液浓度/ mg/ml mg/ml 测量指标乙酸 l,00×101,00×10-3.16×10-1.00×10-3.16×101.00×10 缓冲液 D ###+ D O D 标准曲线

植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法GB/T38577-2020

植物激素是一类存在于植物中起调节作用的内源性化合物。除了具有传统的植物生长和发育调控作用外，研究表明，植物激素还具有多种生物活性，如抗菌、抗病毒、促进伤口愈合等。

而这些植物激素的生物活性与其次生代谢产物密切相关，因此，对次生代谢产物的生物活性测定具有重要意义。GB/T38577-2020《植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法》规定了一套完整的测定方法。

生物活性测定指标

GB/T38577-2020规定了五种生物活性指标，分别为抗菌活性、抗病毒活性、促进伤口愈合活性、降血糖活性和调节免疫功能活性。

其中，抗菌活性是指生物样品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制作用；抗病毒活性是指生物样品对病毒的抑制作用；促进伤口愈合活性是指生物样品对伤口愈合的促进作用；降血糖活性是指生物样品对血糖水平的调节作用；调节免疫功能活性是指生物样品对机体免疫系统的调节作用。

生物活性测定方法

GB/T38577-2020规定了三种生物活性测定方法，分别为纸片扩散法、细胞培养法和小鼠模型法。

纸片扩散法适用于抗菌活性和抗病毒活性测定；细胞培养法适用于促进伤口愈合活性、降血糖活性和调节免疫功能活性测定；小鼠模型法则适用于生物样品的毒性、免疫抑制等方面的研究。

结语

GB/T38577-2020《植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法》的发布，为研究植物激素次生代谢产物的生物活性提供了标准化、规范化的方法。通过对植物次生代谢产物的生物活性研究，可以更好地探索其在医药、农业、食品等领域的应用前景，为人类健康和经济发展做出贡献。

当然，这项工作也需要专业人士的支持和参与。希望越来越多的科研人员能够关注植物激素次生代谢产物的生物活性研究，并通过合理的方法和手段为其开发利用提供更多可能性。