金鱼造血器官坏死病毒检测方法

金鱼造血器官坏死病毒检测方法

国家标准 GB/T36194一2018 金鱼造血器官坏死病毒检测方法 Deteetionmethodofgolafishhaematopoietieneerosisvirus 2018-05-14发布 2018-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36194一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TcC156)归口 本标准起草单位:全国水产技术推广总站、检验检疫科学研究院、北京出人境检验检疫局 本标准主要起草人:李清、王娜、谷强、张昱、景宏丽,吴绍强、张利峰、江育林、陈浩楠
GB/36194一2018 金鱼造血器官坏死病毒检测方法 范围 本标准规定了金鱼造血器官坏死病毒(鲤瘤疹病毒2型)的PCR检测、荧光PCR检测和综合判定 方法 本标准适用于金鱼造血器官坏死病毒的鉴定,用于金鱼造血器官坏死病毒引起的相关疾病的流行 病学调查、诊断、检疫和监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CyHV;鲤瘤疹病毒(cyprinidhe erpesV1ruS herpesvirus2) cyHv2;鲤瓶疹病毒2型(eyprimidl GFHNV金鱼造血器官坏死病毒(godfhsh haematopoieticnecroS1SV1rus dNTP:脱氧核糖核昔三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate bp:碱基对(basepair Ct;循环闵值(cyclethreshold) CTAB:十六炕基三甲基澳化铵(cetyltrimethylammoniumbromide EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid lroxymethylaminomethane Tris;三(胫甲基)氨基甲婉[trishydr 试剂和材料 除非另有说明,仅使用分析纯试剂 4.1水;应符合GB/T6682中一级水的规格 4.2TaqDNA聚合酶:5U/L 一20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.3dNTP;含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10 mmoL/L,-20C保存 4.4引物浓度为104moL/L，-20C保存 CyHV引物 a 1CyHVpol-F:5'-ccCAGCAACATGTGCGACGG3 22 CyHVpol-R:5'-CCGTARTGAG.AGTTGGCGCA-3
GB/T36194一2018 33 扩增CyHv(1型、2型和3型)DNA聚合酶基因中362bp的片段 b) CyHHV-2引物 CyHV-2Hel-F;5'-GGACTTGcGAAGAGTTTGATTTCTAC-3 1) 2) CyHV-2Hel-R:5'-cCATAGTcACCATcGTcCTcATC3 33) 扩增CyHV-2解旋酶基因中366bp的片段 荧光PCR用引物和探针 正向引物;5'-TcGGTTGGACTcGGTTTGTG3' 1) 3) 反向引物5'-CTcGG;TcTTGATGcGTTTcTTG-3' 3) 探针:5'-FAM-ccGcTTcCAGTcTGGGcCAcTAcc-BHQ1-3' 4.5无水乙醇;使用前预冷到一20C 4.6琼脂糖;电泳纯 4.710×PCR缓冲液(含Mg,25mmoL/L);随TaqDNA聚合酶提供，-20丫保存 4.8荧光PCR2×预混合液(2×supermix):20C保存 5 器材和设备 5.1生物安全柜 5.2超低温冰箱及普通冰箱 5.3离心机及离心管 5.4高压灭菌锅 5.5组织研磨器 5.6PCR仪 5.7电泳仪 5.8荧光PCR仪 5.9凝胶成像仪 临床症状 参见附录A 采样 7.1采样部位 采集待测鱼的鲍、脾、肾等 7.2采样数量 采样数量应符合sc/T7103的要求 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行,且体长<4cm的鱼苗取整条,若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊;4cm 体长<6cem的鱼苗取所有内脏;体长>6em的鱼则取腮、脾、肾 成熟雌鱼还需取卵巢液;鱼卵则取 卵膜
GB/36194一2018 病毒的检测 8.1设立对照 从提取样品DNA起,均需设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照 取已知阳性样品的组织 作为阳性对照,取GFHNV检测阴性的组织作为阴性对照,取等体积的无菌去离子水作为空白对照 8.2DNA抽提 取25 mg~100mg样品,加人150LCTAB溶液(见B.1),将样品匀浆,转人1.5mL的离心管中 再加CTAB溶液至900ML 25C作用2h一2.5h. 在含有样品的离心管中加人600L抽提液I见B.2),充分混合不少于30s 12000r/min,4C 离心51 ,取上层水相(约800AL),再加人700L抽提液(见B3),充分混合至少30s 12000r/min min， 4C,离心5min.取上层水相(约600AL),再加人-20C预冷的1.5倍体积的无水乙醉(约900pL),顾 倒数次混匀后，-20C8h以上沉淀核酸 12000r/min,4 笔,离心301 ,小心弃去上清 干燥后加 min， 20L.水溶解,用作PCR模板 也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其他方法抽提病毒DNA 8.3PCR检测 8.3.1反应体系 在PCR管中依次加人:10×PCR缓冲液(含Mg+)5ML、dNTP1AL、正向和反向引物各1AL、 TDNA聚合酶0.5L.模板2.5L,加水至总体积为50L 瞬时离心.,将反应管置于PCR仪 8.3.2 反应条件 94C预变性5min;94C1min,55c(CyHV引物)或G0c(CcyHV-2引物)nmin、,72c1min,扩 增35个循环;72C延伸10min,最后4C保温 8.3.3琼脂糖电泳 用1×电泳缓冲液(见B.5)配制2%的琼脂糖凝胶(含0.5g/mlEB,见B.6,或其他等效商品化试 剂) 将5L样品和1"lL.6×上样缓冲液(见B.7)混匀后加人样品孔,在电泳时设立DNA标准分子量 作对照 5V/em电泳约0.5h,当嗅酚蓝到达底部时停止,将凝胶置于凝胶成像仪上观察 8.3.4测序 取PCR产物进行基因序列测定,将测序结果与DNA序列数据库(GenBank)中参考序列参见附录 )进行同源性比对 8.3.5结果判定 利用CyHHV引物进行PCR扩增后,阳性对照会出现362bp的特异性条带,阴性对照和空白对照均 没有该条带 待测样品扩增出362bp的条带,且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上者， 可判定待测样品PCR检测结果为阳性;未扩增出条带或条带大小不是362bp均判定为PCR检测结果 阴性 利用CyHV-2引物进行PCR扩增后,阳性对照会出现366bp的特异性条带,阴性对照和空白对照 均没有该条带 待测样品扩增出366bp的条带,且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上
GB/T36194一2018 者,可判定待测样品PCR检测结果为阳性;未扩增出条带或条带大小不是366bp均判定为PCR检测 结果阴性 8.4荧光PCR检测 8.4.1 反应体系 在PCR管中依次加人:2×预混合液(2×supermix)6.25L、正向和反向引物各0.5AlL探针 0.5"L模板2.5L、加水至12.5L 瞬时离心,将反应管置于荧光PCR仪 8.4.2反应条件 95C2min;95C30s,58C45s、72C45s,共40个循环;72C延伸2" min 8.4.3结果判定 阴性对照和空白对照应无Ct值,阳性对照Ct值<35,且出现S型典型扩增曲线,否则此次检测视 为无效,应重新检测 待测样品c值二35且出现典型扩增曲线,可判定为荧光RcR用性;若待测样品无扩增曲线,或 Ct值>40,可判定为荧光PCR阴性 对于35GB/36194一2018 附 录 A 资料性附录 金鱼造血器官坏死病 A.1疾病描述 由金鱼造血器官坏死病毒(goldfishhaematopoieticnecrosisvirus,GFHNV)引起金鱼、鲫等鱼类死 亡的一种病毒性传染病,在全球多个国家和地区均有流行 1992年秋季和1993年春季,在日本西部养 殖的金鱼发生金鱼造血器官坏死病大流行,死亡率达100% 此后,其他国家或地区相继出现有关该病 的报道,包括美国、英国、澳大利亚和捷克共和国等 在江苏等地也发生了该病,造成严重死亡 A.2宿主 金鱼、异育银卿及卿的其他变种 对鱼卵,鱼苗、鱼种和亲鱼均可感染,危害严重 A.3水温 该病发生的最适水温为20C左右 A.4临床症状 患病鱼主要表现为食欲不佳或厌食,活动减弱,昏睡,停留在池塘或水族箱底部 病鱼体表、下颌充 血,尤其是腮部严重充血,在下颁等体表处分布大量点状出血点 将病鱼解剖后可见其肝脏、脾脏和肾 脏肿大,有出血点,严重时鱼缥分布大量出血点,部分病例可见病鱼体表有白色斑点 A.5病原 金鱼造血器官坏死病毒(goldfishhaematopoieticneerosisvirus,GFIHNV),因该病毒是第二个分离 自鲤科鱼类的疹病毒,国际病毒系统分类与命名委员会第九次报告将其命名为鲤瘪疹病毒2型 Cyprinidherpesvirus2.,CyHV-2) 该病毒是一种大小为290304bp、二十面体、病毒粒子直径为 120nm、有囊膜的双链DNA病毒,其分类地位隶属于庖疹病毒目(Her pesvirales)、异庖疹病毒科 peinidao),鲤脆修狗毒属(cywim). Alloherpe
GB/T36194一2018 附 录 B 规范性附录) 试剂及其配制 B.1CIAB溶液 先将8.19g氯化钠,EDTA0.744g、Tris1.21g,水60ml充分混匀后,用浓HCl(约0.25ml~ 0.3mL)调节pH值至7.58.0,加人2gCTAB,完全溶解后定容至100mL 使用前加疏基乙醇至终 浓度为0.25% B.2抽提液1 lmoL/LTris饱和酚:三氯甲烧:异戊醇=25:24:1混合,密闭避光保存 B.3抽提液I 将三氧甲婉与异戊醉按24:1的比例混合,密闭避光保存 B.450×电泳缓冲液 先分别加人Tris242g,NaEDTA2H.O37.2g,再加人800ml水,充分搅拌溶解,接着加人冰乙 酸57.1mL,加水定容至1000mL,室温贮存 B.51×电泳缓冲液 加人50×电泳缓冲液20ml并加水定容至1000ml室温贮存 B.6澳化乙键(EB) 用水配制成10mg/ml的浓缩液 用时每10mlL电泳液或琼脂中加1AL B.76×上样缓冲液 取蔗糖40g,加水溶解,定容至100mL,再加人溴酚蓝0.25g溶解后,4C保存
GB/36194一2018 录 附 资料性附录 PCR扩增的序列 c.1CyHV引物CR扩增的序列 CyHV引物PCR扩增的DNA聚合酶基因的一段序列(片段大小362bp,参照GenBankAccession AFJ20509)如下,下划线处为引物 CCCAGCAACATGTGCGACGGAGGCATCANGCCCAGAGTCCATAGITGTCT\GGAGCGACCG 6 TTCTIGTCTCGAG:TNTGTCAGAAACTGCGTGCTGCTCGATGGAAAAAGATANCCGGCGCC 121AGTAAC:ATGGAAGAG;ATCAAGGAATACcCGCACAGCG;AAGACCTGTACAcG;ATCCTGTGc 8ITACAAGAACcGAGAGGTCGGTTGGACTCCGGTTTGTGACCTACACCGCTTCCAGTICTGGGc 24CACIACCTCTCTATGAGATCTCAGTACAAGAAACGCATC'AAGACCGAGAAAG,ACGCGAGT 01CTCAAGGGTACTATGANTCAGATGCAGGGTGAGATGAAAGTATGCcCCAACTCTCACTAC 361GG C.2CyHv-2引物CR扩增的序列 CyHV-2引物PCR扩增的解旋酶基因的一段序列片段大小366bp,参照GenBank ccession AFJ20501)如下,下划线处为引物 GGACTTCGAAGAGTTTGATTTCTACACGCCTCGCATCATGCATCAGGACAACCGGICA 6 GACAACTCAACGAGTCTTGTATGAAAAAGACTGTGCGCGCCGAACGGATCTTCAAGCCCA 121AGATCAATCACAATAACGTGCAGAACCCGACGAGCGTAGAAAGTTTGCAGCCGTGGTCC 181GTCAACGGTTCAAGCACATTGACTTCTTTCAAGGCGTCCGAATCAAGGTCGGATCTCTGG 24TGTGCGTACTAAAATATCAAACTCAAGTGTTTGAAGGCTGTCTGGGAATAGTGGAATCAG 301TACAACCCGTCATGGTACGCCTTTTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTGATGAGACGATGGTGA 361CTATGG

金鱼造血器官坏死病毒检测方法GB/T36194-2018解析

一、前言

金鱼造血器官坏死病毒是一种常见的病毒，对金鱼产生严重的危害。为了提高金鱼生产和养殖的质量，保护金鱼健康，国家制定了相应的检测标准。

二、检测方法

1. 酶联免疫吸附试验法：通过检测金鱼血清中的抗体来判断金鱼是否感染造血器官坏死病毒。

2. 荧光PCR法：通过检测金鱼血液或组织中的病毒核酸来判断金鱼是否感染造血器官坏死病毒。

3. 细胞培养法：将金鱼的脾脏等组织制成细胞悬液，通过观察细胞形态来判断是否感染造血器官坏死病毒。

三、标准实施意义

GB/T36194-2018的实施，可以规范金鱼造血器官坏死病毒的检测方法，保证金鱼生产和养殖的质量和安全。同时，该标准还可以促进金鱼养殖业的健康发展，提高产业竞争力。

四、结论

金鱼造血器官坏死病毒是金鱼养殖过程中不可避免的风险之一，及时发现和防控该病毒对于保护金鱼的生命和健康至关重要。GB/T36194-2018的发布和实施，将为金鱼生产和养殖行业带来积极的影响。

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