菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法

菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法

GB/T28063一2011 菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了菜豆荚斑驳病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法 本标准适用于可能携带该病毒的豆科作物的种子、苗木等植物繁殖材料的检测鉴定,也适用于传播 该病毒介体昆虫的检测鉴定 菜豆荚斑驳病毒基本信息 中文名:菜豆荚斑驳病毒 英文名;beanpodmotlevirus 异名:beanpodmottlecomovirus(菜豆荚斑驳病毒),podmotlevirus(荚斑驳病毒),desmodium virus(金钱草病毒》 英文缩写;BPMV 属豇豆花叶病毒科Comoviridae,豇豆花叶病毒属Con ooUrs 菜豆夹斑驳病毒的其他信息参见附录A 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAsELISA),反转录和体外DNA扩增技 术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定 主要仪器设备 本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备 微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001g),PCR仪,荧光PCR仪、电泳仪,水平电泳 槽、凝胶成像仪,高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计和各种量程的可调移液器(1000l、,200aL 100al30l.2Al) 检测样品的制备 5.1DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测样品的制备 对每批送检样品进行症状检蠢,优先选取具有褐色或黑色斑驳症状的种子(从种胳开始),或肯选取 具有斑驳,皱缩、褪绿等症状的叶片 种子样品;称取0.5g~1.0g的种皮作为检测样品,在液氮中充分研磨,回温后按110比例加人 样品提取缓冲液继续研磨 叶片样品称取0.5g~1.0g的叶片作为检测样品,在研钵中研磨或在液氮中研磨,按1;10比例 加人样品提取缓冲液继续研膀 把研磨后的样品转移到5ml离心管中.8000r/min离心5min.上清液作为DAs-ELISA(见附 录B)和IC-RT-PCR(见附录C)检测提取液 注;提取液在3h内使用,否则保存在4C中
GB/28063一2011 2 5 RI-CR检测样品的制备 称取表现症状的0.1g叶片、种子等样品在液氮中充分研磨后,利用TRIzol方法提取RNA 见 附录D中的D.3) 检测与鉴定 检测鉴定流程 通常,初筛时采用DAS-ELISA检测方法 当DAs-ELISA产生阳性结果时,再采用ICRT-PCR 或RT-PCR等方法进行验证 当首先采用1cRT-PCR或RT-PCR方法检测时,如果产生阳性结果,则通过实时荧光RT-PCR方 法或序列测定等方法验证 6 2 DAs-ELISA检测 把制备的样品上清液加人已包被BPMV抗体的在96微孔板中,进行DASELISA检测,每个样品 平行加到两个孔中 用健康的植物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用样品提 取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如,种子或叶片)应该尽量与所检测样品相一 -致 具体操作过程见附录B 6.3Rr-CR检测 分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后,进行PCR扩增 用健康的植物组织作阴性 对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照 具体操作过程见附录D 6.4IC-RF-rCR检测 把制备的样品上清液加人已包被BPMV抗体的离心管中,然后进行RT-PCR扩增 用健康的植 物组织作阴性对照,用感染BPMV的植物组织作阳性对照,用超纯水作空白对照 具体操作过程见附录C 6.5序列测定 将PCR产物回收后,进行克隆、,测序,或者直接测序,测序可由生物公司完成 把测序所得到的核 苷酸序列翻译成氨基酸后与已知的BPMV相应序列进行比对,如果与已知的BPMV相应序列同源性 大于75%则判定为BPMV序列,同源性小于75%则判定为非BPMV序列 注:序列比对可利用NCB网站上的BLAST软件进行,网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 结果判定与报告 7.1结果判定 当产生以下检测结果时,则判定为检出BPMV 当DAs-ELIsA检测,IC-RT-PCR(或RT-PCR)检测、其中两种方法的检测结果呈阳性时,则 判定为检出BPMV;
GB/T28063一2011 当IC-RT-PCR或RT-PCR检测结果呈阳性,测定的序列为BPMV序列时,则判定为检出 BPMV 7.2结果记录与保存 记录各项实验数据,包括样品种类,来源,检测时间,地点、方法和结果等 DAsELISA检测结果 保存吸光值的数据报告,ICRT-PCR或RT-PCR检测结果保存电泳照片,序列测定结果保存测序报 告图
GB/28063一2011 附 录A 资料性附录 菜豆荚斑驳病毒简介 A.1分布地区 北美洲:美国,加拿大 南美洲,巴西,厄瓜多尔、秘鲁 亚洲;伊朗 A.2形态特征 病毒粒子形态为等轴对称二十面体,无包膜,直径为28 nm A.3寄主范围及症状 BPMV的寄主局限于豆科植物.主要是大豆(Glycinema.r和菜豆(Phaseolusspp.).山蚂蟆 (Desmdiumaniculatum)是其多年生寄主 在鉴别寄主植物上的症状: 大豆(G/ycinema.r);表现为严重的系统症状,叶片斑驳,皱缩、荚和种子斑驳,甚至坏死,植株死 该病毒还能延迟大豆茎杆成熟.引起“绿茎”现象 在种子上产生褐色、黑色的斑驳症状,症状从种 脐开始,因而称为“种胳渗色” 菜豆(Pha aseolasuulgarisTender ergreen品种:起初出现褪绿斑,后发展为严重的系统褪绿,叶片畸 形,豆荚严重斑驳、深绿色、豆荚变短,畸形、扭曲,变得粗糙有疣状突起 菜豆(P.uulgaris)Pinto品种;无系统症状,接种后约3d一4d出现散生的红色局部枯斑,接种叶 有时叶脉坏死 uwl 菜豆(P. aris)Bountiful品种:无系统症状,接种后约3d4d出现大的淡黄色局部病斑 lgar A.4传播途径 BPMV可以通过昆虫介体传播,主要是大豆叶甲(Cerotomatri/urcata),而玉米根叶甲(Diabrotica uirgifera),带斑黄瓜叶甲(D.balleala),点斑黄瓜叶甲(D.undecimpunctatahowardi)、葡萄甲虫(Co aspisMwowida),甲虫(C.laa),曲条豆光菁(Epia autaittata)、墨西哥叶甲(Epilachaariestis和大 豆潜叶虫(Gdontoahorni[Xeochalepushorni门)也是该病毒的传播介体 该病毒另外还可以机械传播,嫁接传播,以及通过种子进行远距离传播 从感染BPMV植株上收 获的种子,其种传率为0.10%,种传率相对较低 与大豆花叶病毒(Soybean mosaievirus,SMV)一起 感染,种传率可以达到39% A.5血清学特性 BPMV具有很强的免疫原性,制备的多克隆抗体可以检测大豆叶片、种子,草本寄主植物和介体昆 虫中的病毒
GB/T28063一2011 A.6分子生物学特性 BPMV是正链RNA病毒,其基因组由两条正链RNA-1(约3.6kb)和RNA-2(约6.0kb)组成,分 别包裹在两个直径为28nm的等轴多面体粒体中 RNA-1编码5个复制所需的蛋白,RRNA2编码一 个推导的细胞间运动蛋白和两个外壳蛋白 A.7豇豆花叶病毒属种间区分依据 A.7.1大外壳蛋白(LargecoatproteinICP)的氨基酸序列同源性小于75% 聚合蛋白酶的氨基酸序列同源性小于75% 在可能的成分间没有假重组 抗原反应有差异
GB/28063一2011 附 录 B 规范性附录 DAS-ELIsA检测操作步骤 B.1DAS-ELISA所采用的试剂 B.1.1包被缓冲液(pH9.6) 碳酸钠(Na.co. 1.59g 碳肢氢纳(NhlHco) 2.93g 叠氮化钠(NaN,) 0.20g 加人900mL蒸僧水溶解,用Hcl调节pH值到9.6,然后加水至1L B.1.2磷酸盐缓冲液(PBSs,pH7.4) 氯化钠NaCI 8.0g 磷酸二氢钾(KHPO. 0.2g .15g 磷酸氢二钠(NaeHPO 氯化钾(KcD) 0.2g 叠氮化钠NaN, 0.2g 加人900mL蒸水溶解,用NaOH或HCl调节pH值到7.4,然后加水至1L B.1.3PBs1 每升PBs中加人0.5mL的Tween-20 B.1.4样品提取缓冲液(pl7.4) PBST十2%PVP(PVP-40聚乙烯基毗咯烧酬 B.1.5酶标抗体稀释缓冲液 PEBST2%PVP+0.2%卵白蛋白 B.1.6底物缓冲液 97mL 二乙醇胺 蒸僧水 600mlL 叠氮化钠NaN,0.2g 用HCl调整pH至9.8,然后加H.0到1L 注:缓冲液可以储存在4C一10C中至少2个月,使用前回温至室温 B.1.7抗体 BPMV包被抗体、碱性磷酸酶标记的BPMV抗体
GB/T28063一2011 B.2操作步骤 B.2.1包被 根据检测试剂盒说明,用包被缓冲液稀释BPMV抗体(如1;200),在微孔板中每孔加人l00Al包 被抗体溶液 在室温下孵育2h4h或4下包被过夜 B.2.2捕获抗原 倒去孔中的抗体包被溶液,用PBST洗4次一5次孔(可在洗板机上完成) 加人100L检测样品 提取液到酶标板的孔中,每个样品至少两个孔 并设置阳性和阴性对照 在室温下孵育2h或4C下 过夜 B.2.3加入酶标抗体 根据试剂盒说明,用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体(如1;200) 倒去孔中的检测样品提取 液用PIST洗4次一5次孔(可在洗板机上完成) 每孔加人100L酶标抗体溶液 在室温下孵育 2h B.2.4加底物 用底物缓冲液把对硝基苯磷酸二钠盐(p-NitrophenylPhosphate,pNPP)配制成1mg/mlL的底物 溶液 倒去酶标抗体溶液,用PBST洗4次5次孔(可在洗板机上完成) 每孔加人100aL新鲜配制 的底物溶液 室温下避光放置(约30min一60min),至阳性对照孔明显显色 B.2.5吸光值的测定 用酶标仪在405nm处读取吸光值 B.2.6结果判定 通过酶标仪上405nm的OD值来判定 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即;缓冲液孔和阴 性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0,05计算 阳性对照有明显的颜色 反应;孔的重复性基本一致 在满足了该要求后,结果原则上可判断如下: -样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性 -样品OD值/阴性对照OD值在阀值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加 以验证
GB/28063一2011 附 录 c 规范性附录 c-RRT-PCR检测操作步骤 C.1主要试剂 BPMV抗体,包被缓冲液和PBST试剂见B.1;RT-PCR试剂见D.1 C.2包被抗体 根据检测试剂说明,将包被抗体用包被缓冲液稀释(如1:200),取50AL~100L稀释好的包被 溶液于0.6mL的离心管中 25C中放置3h或4C冰箱中过夜,然后用PBST缓冲液洗涤3次一5次， 去除残留溶液 C.3抗原捕捉 向每个已包被抗体的离心管中加人检测样品上清液100AL,25下放置2h3h或4C冰箱中 放置过夜;加人PBST缓冲液洗涤3次5次,双蒸水洗涤1次,去除残留溶液 注;如果是用于验证DAs-ELISA的检测结果,可直接使用血清学检测样品的剩余提取液 eDNA合成 在上述离心管巾加人1L的BPNM4引物(10Hmol/L)>.37.5L的ddH.0(经DEPC处理),于 95C的水浴中处理7min,然后迅速冰浴5min;继续加人5×RT缓冲液10AL,10mmol/1的dNTP 混合物0.5AlL.MMLV反转录酶0.5L,RNaseInhibitor0.5AL;然后37C水浴1h,95C水浴 10min,冷却后作为PCR扩增模板 C.5CR扩增 在25Al的反应体系中;2.5Al的10×PCRbuffer(含20mmol/I 的Mg+).dNTP(每种各 0mmol/L)0.丁LTuqDNA聚合酶(2.5U/L)0.5L.BPNM3和BPNM引物(10pmol/L)各 1.0aL(引物见表D.1),加人上述DNA模板10l,ddH.0补足体积 与D.5反应程序相同,反应完成后,取5L扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳,然后用 EB染色,在凝胶成像系统上观察 C.6结果判定 阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下: 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性; 如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性
GB/T28063一2011 附录D 规范性附录 RT-CR检测操作步骤 D.1主要试剂 D.1.1RNA提取试剂 TRIzolreagent、三氯甲炕、异丙醇、,70%乙醇 D.1.2反转录试剂 MEMIV反转录酶(200U/AL)5×反应缓冲液(250mnmol/儿Tis-HClpH8.325C.375nmnol/L KCl,15mmol/LMgCl,50mmol/LDTT),dNTP混合液(各10mmol/L),RNaselnhibitor(40U/AL. D.1.3PCR试剂 10×PCR缓冲液(含15mmol/儿的Mg+、TaoDNA聚合酶,dNTP混合液(各10mnmol/L) D.2引物序列 本方法的特异性引物序列见表D.1 其中BPM3为正向引物,BPM4为反向引物,扩增区域在大外 壳蛋白基因上,扩增大小为228bp 引物由生物公司合成与纯化 表D.1所使用的引物序列 引物名称 引物序列 在Nc_003495'上的位置 BPM3 5'-CATAGCATTTGGAAATTTGGCTG3’ 2587一2609 BPM4 5'-TCACCTGGTATTGTRGACAC3'" 27952814 注:也可以采用根据BPMV基因组序列合成的其他特异性引物 在GenBank上的基因序列登录号 序列中的R=G或A D.3总RNA的提取 取0.0Gg一0.1&样品,加人lmLTRtege充分研磨.室温放置5mim120o《离心5minm 取上清液到另一离心管中;加人三氯甲烧200AL,充分振荡15s,室温放置3 min;12000g,4C离心 15min;取上层水相加人另一离心管中,加人0.5ml.异丙醉;12000g,4C,离心10min,弃去上清液; 加人1mL70%乙醇洗涤;RNA沉淀干燥后,加经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH,O40L溶解 即可 注;本方法是根据TRlolreagent方法提取总RNA,在保证总RNA质量的情况下,也可以采用其他总RNA提 取方法
GB/28063一2011 D.4eDNA合成 在3AlL的总RNA中加人1AL的BPM4引物(10mol/L),于95C的水浴中7min,然后迅速冰 浴5nmin 继续加人5X反应缓冲液2.5l.dNTP混合物(10mmol/L0.5L.MML反转录槲 200U/AL)0.5L、RNaseInhibitor0.5AL、经DEPC处理的ddH.O4.5aL 然后37水浴1h. 95笔水浴101 ,自然冷却至室温，-20C冰箱中保存 min， D.5PCR扩增 以上述合成的cDNA为模板,进行PCR扩增 在PcR的薄壁管中分别加人以下试剂(235lL体 系)10×rR缓冲液(含20mmol/几的Me+)2.5L.TuqDNA聚合酶(2.5U/aL)0.百L.dNTP 混合物(每种各含10 mmol/L)0.5L、BPM3引物(10Amol/L)1.0 丛l、BPM4引物(10丛mol/I 1.0l,cDNA3.0ML,ddHl,O16.5AL 反应条件;94C预变性3min，然后94C变性50s,60退火50s、72丫延伸30s,进行35个循 环,最后一个循环结束后72C继续延伸7min D.6琼脂糖凝胶电泳 RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析 每个样品取5L的RTPCR产物与1L的6×上 样缓冲液混合均匀,并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中,然后在120V下电泳 电 泳结束后,放人装有0.5g/AL的澳化乙能(EB)游液的容器中染色,然后在清水中请洗后,在凝胶成像 系统中观察,拍照,并保存照片 D.7结果判定 在阴性对照和空白对照没有产生条带、阳性对照产生预期大小(约228bp)的条带情况下 如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性; 如果检测样品未出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性 10o