GB/T28103-2011
小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofWheatStreakMosaicvirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2012-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小379.04KB
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小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T28103一2011 小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法 Deteetionandidentificationofwheatstreakm0saicvirus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28103一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标雅起草单位;天津出人境检验检疫局 本标准主要起草人:郭京泽、廖芳、刘跃庭、张裕君、刘勇、崔铁军、王金成
GB/T28103一2011 小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了小麦线条花叶病毒(wheatstrealkmosaicevirus)检疫鉴定方法 本标准适用于禾本科植物种子和苗木中的小麦线条花叶病毒检疫鉴定
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SN/T1840 植物病毒免疲电镜检测方达 s/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 小麦线条花叶病毒基本信息 小麦线条花叶病毒wheatstreakmosaicvirus,属于马铃薯Y病毒科Potyviridae,小麦花叶病毒属 Tritimowuirus
缩写;wsMV 小麦线条花叶病毒传播途径有:汁液摩擦传播;种传;介体传播
该病毒容易通过汁液摩擦方式近距离扩散
该病毒能通过带病小麦种子的调运远距离传播
该病 毒的传毒介体为小麦卷叶Aceriaosichella,成虫和若虫均可带毒传染,卵不传病毒
小麦线条花叶病毒其他信息参见附录A
方法原理 小麦线条花叶病毒的形态学特征,分子生物学特性和血清学特性是该病毒检疫鉴定方法的主要依 据
采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法、植物病毒免疫电镜检测方法、反转录聚合酶链式反应检测 方法,确定样品中带有的小麦线条花叶病毒
仪器设备、用具及试剂 5.1仪器设备 酶标仪、洗板机,恒温水浴锅、普通冰箱(0C4C)、一20C低温冰箱、一80C超低温冰箱、植物 光照培养箱温度可调范围为0C50C),超净工作台,电子天平(1/10000g),微量榨汁机,透射电子 显微镜、低速离心机(转速为3000r/min" 5000r/min)、PCR仪、纯水仪、电泳仪、凝胶成像系统
5.2用具 可调微量移液器(2.5AL,10AL、100L、1000AL、5000AlL)和相应的吸头,酶联板,封口膜,pH 计或pH试纸条(广泛试纸和精密试纸),1.5mL
离心管、PCR反应管、容量瓶(500ml、l000mL)、解 剖刀片,慑子,剪刀、吸水纸、白瓷盘、记号笔、标签、一次性手套
GB/r28103一2011 3 5. 试剂 双抗体夹心酶联免疫吸附测定的检测试剂见附录B). 反转录聚合酶链式反应检测试剂见附录C 植物病毒免疫电镜检测试剂见SN/T1840)
现场检测 按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取种子和种苗样品
实验室检测 对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA),检验程序见附录B 对样品进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定,检验程序见附录c 对样品进行植物病毒免疫电镜(IEM)测定,检验程序见SN/T1840
在电镜下观察到弯曲线状病 毒粒子,测定其大小为15nm×700nm,病毒粒子周围有抗体晕圈,则IEM测定结果为阳性
否则IEM 测定结果为阴性
结果判定 样品经过DAs-ELISA,RT-PCR测定或IEM测定,其两种或两种以上测定结果均为阳性,则判定 该样品带有小麦线条花叶病毒
否则判定样品不带有小麦线条花叶病毒
样品保存与结果记录 9.1样品保存 在适宜环境中保存已鉴定带有小麦线条花叶病毒的样品
如叶片应在超低温冰箱中单独保存或冻 干保存;生长的苗木应在植物光照培养箱中单独培育;种子应在干燥条件下保存
9.2结果记录与资料保存 记录各项数据,包括样品的种类,来源和样品状况,检测的时间、地点、方法和结果,测定人员的签 字
DASELISA的测定结果应保存吸光值数据报告,RT-PCR测定结果应保存电泳照片,IEM测定结 果应保存病毒粒体照片
GB/T28103一2011 附 录A 资料性附录 小麦线条花叶病毒其他信息 A.1形态学特征 病毒粒子形态为弯曲线状,无包膜,长690nm一700nm,直径11nm~15nm
A.2地理分布 最初报道于美国,目前在美洲、北非、中东、中亚、东亚、东南亚以及欧洲、澳大利亚均有发生
在我 国西北的甘肃、陕西等地区曾有发生
A.3寄主范围及症状 小麦线条花叶病毒侵染许多小麦品种以及燕麦,大麦、黑麦、一些玉米品种和泰,还侵染多种单子叶 杂草,但不侵染双子叶植物
小麦线条花叶病毒引起小麦严重花叶和矮化症状
在小麦苗期,植株叶色变淡,叶片变窄,叶上出 现细小褪绿条点及黄色小点,与叶脉平行,并逐渐发展成苍白色断续条纹,部分组织坏死
苍白条纹不 规则愈合,在苍白背景的叶片上有残余绿色条纹,叶片是一侧向内纵向卷曲
新叶片上也有褪色条纹， 叶脉浊化稍暗
小麦拔节后,节间向下成弧状弯拐,节外复又向上,各节的向地一侧异常膨大造成全茎 呈拐节状,此症状在基部1节一3节最为明显
病情严重的植株,全株分冀向四周彻匈,穗鞘扭卷,不易 抽穗或穗而不实
整个病田表现植株松散,外型异常
小麦线条花叶病毒对小麦产量影响大,轻者减产 一0%,重者颗粒无收 30% 诊断寄主:小麦、大麦、燕麦的所有品种和部分玉米品种表现系统花叶症状并且矮化
该病毒的某 些分离物侵染高粱(Swrghunbicolo)偶然出现坏死斑症状 繁殖寄主:冬小麦任何品种都适于做该病毒的繁殖寄主
测定寄主;没有合适的局部斑测定寄主
分子生物学特性 A
4 小麦线条花叶病毒的核酸为单分子正义ssRNA,长为8.5kb,相对分子量为2.8×10,核酸占病毒 粒子质量约为5% 小麦线条花叶病毒的基因组为单分体基因组,RNA的5'端为VPg.3'端为Poly(A)
基因组编码 一个344kDa的多聚蛋白,然后切割成10个产物,分别为40kDa的P蛋白、44kDa的HCPo蛋白 32kDa的P3蛋白,6kDa的6K1蛋白、73kDa的柱状内含体解旋酶,6kDa的6K2蛋白、23kDa的VPg 26kDa的Nla蛋白,64kDa的Nb蛋白及30kDa的外壳蛋白
GB/r28103一2011 附 录 B 规范性附录 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs-ELISA)方法检测 B.1试剂 B.1.1包被缓冲液(pl19.6) 碳酸钠(Na.cO.)1.59g,碳酸氢钠(NaHcCO.)2.93g,叠氮化钠(NaN,)0.20g,溶解于900ml燕 僧水中,用盐酸调节pH至9.6,用蒸馏水定容至1000ml B.1.2PBST缓冲液(pH7.4) 氨化销(NaC)8.0g,磷酸二氢销(KHPO.)0.2g,磷酸氢二纳(NaHPO)1.15g,氧化钾(Kcl) 0.2g,0.5mLTween-20,叠氮钠(NaN,0.2g,溶解于900mL蒸溜水中,用盐酸调节pH至7.4,燕懈 水定容至1000mL B.1.3样品抽提缓冲液 亚硫酸钠(Na,SO.)20g,2.0gPVP(Mw244000),加PBST缓冲液1000ml B.1.4酶标抗体缓冲液 20gPVP(Mw24一4000),BSA2.0g,加PBST缓冲液1000ml B.1.5底物缓冲液 二乙醇胺97mL,燕憎水600mL,用盐酸调pH至9.8,然后用蒸馏水定容至1000ml B.1.6底物pNPP(对-硝基苯磷酸钠 B.1.7种子表面消毒液 将30%次氯酸钠(NaCIO)100nml溶于900ml蒸水中,制成3%种子表面消毒液
B.1.8生物制剂 小麦线条花叶病毒检测试剂盒(wSMV特异性抗体和酶标记抗体). 小麦线条花叶病毒阳性质控 小麦线条花叶病毒阴性质控
B.2DAS-ELISA检测 B.2.1样品制备 B.2.1.1种子类 随机抽取或针对性挑选100粒种子,浸人种子表面消毒液中消毒10nmin,用灭菌蒸榴水洗涤种子 三次
将种子摆放于铺有湿润吸水纸的白瓷盘内
在植物光照培养箱中,使种子在适宜的发芽温度 (20C28)下催芽长出叶片
GB/T28103一2011 用微量榨汁机研磨叶片并加人抽提缓冲液,样品质量与抽提缓冲液体积之比为1:10
研磨的植 物汁液盛于离心管中,低速离心2min,上清液为待检样品液
B.2.1.2种苗类 随机抽取至少20株种苗的叶片0.2g,或针对性采集表现症状的病叶
用微量榨汁机研磨叶片并 加人抽提缓冲液,样品质量与抽提缓冲液体积之比为1:10
研磨的植物汁液盛于离心管中,低速离心 2min.上清液为待检样品液 B.2.2检测步骤 B.2.2.1在酶联板上设定待检样品孔和对照孔孔位
对照孔包括2个阳性质控孔、2个阴性质控孔、 2个空白对照孔
每个待检样品设定两个孔位
B.2.2.2按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释wSMV包被抗体,每孔加人100Al抗体溶 液
用封口膜包好酶联板,水浴锅中37C孵育2h或4C冰箱过夜
B.2.2.3洗板机洗板3次,洗涤液为PBST缓冲液
B.2.2.4每个待检样品孔加人100 待检样品液
相应的对照孔中加人100AL阳性质控,100 L L 阴性质控和100l样品抽提缓冲液
用封口膜包好酶联板,水浴锅中37C孵育4h或4C冰箱过夜
B.2.2.5洗板机洗板4次一6次,洗涤液为PBST缓冲液 按要求的浓度和需要的体积用膊标抗体缓冲被稀释wsMV酵标抗体,每孔加人100L槲 B.2.2.6 标抗体溶液,用封口膜包好酶联板,水浴锅中37C孵育2h一4h B.2.2.7同步骤B.2.2.3洗板
B.2.2.8按1mg/nL的浓度将NPP(对-硝基苯磷酸钠)溶于底物缓冲液中(现用现配) 每孔加人 100a底物溶液
室温下避光环境中放置30min一60min
B.2.2.9用酶联仪在405nm波长下测定各孔的吸光值(OD. B.3质量控制要求和结果判定 B.3.1质量控制要求 满足以下条件时,检测结果有效: 空白对照和阴性质控的OD值小于0.15 阳性质控ODs/阴性质控OD在310之间: 重复检测样品oD值平行允许率(P)小于20%
如阴性质控的OD值小于0.05时,按0.05计算
平均允许率按式(B.1)计算: OD一OD. P= B.1 ;×100% -OO万 式中: -平行允许率; OD -重复样品1; 重复样品2
OD. B.3.2结果判定 在满足B.3.1的质量要求后,按如下原则作出判定 样品oD/阴性质控oD值大于2,DAsELISA结果判定为阳性 -样品OD/阴性质控OD值等于2,判定为可疑,需重做一次或者用其他方法进行验证; 样品oD/圆性质控oD值小手2.,DASELIsA结果判定为朗性
GB/r28103一2011 附 录 c 规范性附录 反转录聚合酶链式反应RT-CR)方法检测 C.1试剂 C.1.1饱和酚、三氯甲婉、异戊醇,MgCl、3mol/L.醋酸钠(pH5.2),无水乙醉、,DEPC、澳化乙锭、琼脂 糖,dNTPs,Taq酶,MMLV反转录酶、RNaseinhibitor,M-MV反转录缓冲液、TrizolRNA抽提缓冲 液,10×PCR缓冲液、TAE电泳缓冲液、TE缓冲液、溴酚蓝载样缓冲液
C.1.2RNA抽提试剂盒,RT-PCR试剂盒
C.1.3小麦线条花叶病毒阳性对照、阴性对照、DNAladdermarker
C.2实验步骤 C.2.1RNA提取 将250mg植物材料置于离心管中,液氮冷冻,研碎
悬浮于750L抽提缓冲液中,继续研磨
再 加人等体积的饱和酚:三氯甲婉:异戊醇(25:24:1),混匀
13000r/min离心5min,取上清液
加 人1/10体积的3mol/儿醋酸钠(pH5.2),2.5倍体积的无水乙醇，-80C30min以上(或一20C过 夜)
13000 r/min离心15min,留沉淀
加人300L的75%乙醇洗涤
13000r/min离心2min,弃 上清液,重复离心一次,风干
将RNA溶于50AL经DEPC处理的蒸僧水中,作为待检测核酸
分别 从wSMV阳性对照、阴性对照中提取RNA
可使用RNA提取试剂盒并按照说明书进行操作
C.2.2引物合成 依据文献(DebM&.Anderson」M,2008)所设计的引物序列: wSMVL2:5'-CGACAATCAGCAAGAGACCA-3’ WSMVR2:5’-TGAGGATCGCTGTGTTTCAG3’ 扩增产物大小约为190bp C.2.3RT-PCR检测 C.2.3.1eDNA的合成 反应体系为20L,包括20 Amol/L引物1AL,RNase-freeH.O8.5AL,待检测核酸2AL,空白对 照用RNase-freeH,O
88C水浴10min后,置于冰上,加人10mmol/儿的dNTP1AL,40U/AL的 RNascimhihior0.了AL.5倍MMLV反转录缓冲液4ALl00mmol/儿DTT2AL..,5U/ALMENLV反 转录酶1AL,混匀,42C水浴1h,合成cDNA
同样处理阳性对照、阴性对照和水空白对照
C.2.3.2PCR扩增 反应体系0,al.,包括10mml儿的dNTPll.,20pml/儿引物wsMv12/wsM2各 Al.倍民R缓冲液了AL.DNA2al.sU/L.ruq解1L,双寨水30l..进行如下热解环,的 ,然后95c30s,55c1min,7230s,35个循环,最后72c10min,4c保存PCR产物
同 3 mln
GB/T28103一2011 样处理阳性对照、阴性对照和水空白对照
C.2.4琼脂糖电泳和凝胶成像 制备2%的琼脂糖凝胶
取上述PCR产物5L,加人1L载样缓冲液,混匀后移人胶孔
样品孔 两侧分别加人DNAladder”marker r,100V电压下电泳
电泳后的凝胶在0.1%澳化乙锭溶液中染色 30min
在凝胶成像仪下进行分析并拍照,记录实验结果
C.3结果判断 阴性对照和空白对照均无扩增条带,待测样品与用性对照在10p处均有单一条扩增条惜,则判 定结果为用性
阴性对照和空白对照均无扩增条带,阳性对照在190p处有单一条扩增条惜,待测样品无扩增条 带,则判定结果为阴性
小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法GB/T28103-2011详解
小麦线条花叶病毒是一种RNA病毒，可以通过昆虫传播或者种子传播等多种方式引起小麦的感染。由于线条花叶病毒具有高度的传染性和侵袭性，因此对其检测和鉴定显得尤为重要。
GB/T28103-2011标准是小麦线条花叶病毒检疫鉴定方法的规范，其包括了以下步骤：
样品采集与处理
首先，需要在发病期或病叶中采集病原体样本。可以使用无菌剪刀或无菌手套进行采样，并将其放入无菌离心管中保存。如果需要长时间保存，则应在-80℃低温下保存。
核酸提取和PCR扩增
将样品取出后，使用核酸提取试剂盒对其中的核酸进行提取。然后，使用PCR扩增技术对其进行检测。
序列比对和鉴定
通过将PCR扩增所得到的基因序列与数据库中的已知序列进行比对，从而确定其物种分类和亲缘关系。同时，还需进行生物学特性观察和传播宿主鉴定等实验。
综上所述，GB/T28103-2011标准为小麦线条花叶病毒的检测和鉴定提供了一系列规范化的操作流程和标准，其操作步骤严谨、科学，可有效地检测和鉴定小麦线条花叶病毒。
