番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法

番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T35331一2017 番茄亚隔孜壳茎腐病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentificationofDidymelalycopersieiKIebahn 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35331一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:天津出人境检验检疫局、中山出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:崔铁军,罗加凤、陈定虎、刘跃庭、黄国明、杨韶勇
GB/35331?2017 ??? Χ ?涨????? ???????,?з?? ? ???? :??? ?;DidymellalycopersiciKebahnm ?;PhonalycopersiciCooke ;BoeremiayoersiciCooke)Aveskamp.Gruyter&.Verkley. Ascochyaycoersici(Plowr.Brunaud. DiplodlinalycopersiciHollos. ?;ascochytablightfruitrotoftomatoleafspotoftomatostemcankeroftomatostem rotoftomato λ;???(Fungi),?(Ascomycota),?(Pezizo7 mycotina),?(Dothideomy ),???(Pleosporomycetidae),???Pleosporales,С yceteS ??(D)idymela)PhomalycoersiciCooke,?(Coelomycetes),?? (sphaeropsidales),ù(Phomna) ?;??? ???μ?A ? ????.?.????лAnilbioicE"??? ???? ???? 4.1? 4.1.1 ???,??(?20C). 4.1.2? (?90mm)????????(1mL),? ?,???(2mL
GB/T35331一2017 4.2主要试剂 葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、燕麦片、麦芽膏、无水乙醇、1.0%次氯酸钠NaCIO)、0.1%氢氧化 钠(NaOH 马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA,麦芽提取物培养基MEA、燕麦培养基OA,培养基制备方法参 见附录B 病菌的鉴定 5 5.1疑似材料挑选 5.1.1种子中疑似材料挑选 将待检样品倒人洁净白瓷盘内,挑选干瘪、弱小,畸形的可疑病种子和植株残体作为实验材料,植株 残体包括枝、叶、叶柄等 5.1.2植株疑似材料挑选 取待检植株,仔细观察植株枝、叶,果实上病菌为害症状(参见A.4、图A.l),枝条基部是否有黑褐 色病斑,枝条上部是否有溃疡病斑,叶片上是否有同心轮纹状病斑,果实是否有腐烂,枝、叶,果实上是否 有病菌的子实体(分生袍子器),发现病菌子实体的,直接用灭菌的挑针或牙签挑取,制片镜检,显微镜下 观察分生袍子器,分生袍子的形态特征 可疑的枝、叶,果实材料立即进行病菌分离培养 5.2分离培养 5.2.1实验材料前处理 疑似材料为植株的枝、叶,用自来水充分冲洗,取病健交界组织,剪成约0.4cm×0.4cm小块,用 0.5%的次氯酸钠溶液消毒5min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分后培养;疑似材料为果实,果实病 健交界处组织用75%乙醇擦拭表面消毒,再用灭菌针挑取小块组织进行培养 种子中挑选出的植株残体和可疑种子分别用纱布包好,放人0.5%的次氯酸钠溶液中,消毒5min 灭菌水冲洗3次,种子于无菌条件下22C保湿24h,再置于一20C下冰冻24h后培养，经表面消毒后 的植株残体,用灭菌滤纸吸干水分后直接培养 5.2.2病菌分离培养 前处理后的实验材料置马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA平板上,每皿放置4粒5粒或4块 5块，18C20C,12h光照黑暗交替培养 培养8d后开始观察,发现乳白色或白色可疑菌落,立即 用PDA、MEA,OA培养基分离纯化,7d后记录菌落培养性状,包括菌落生长速度、颜色,形状等,体视 显微镜下观测分生弛子器产生情况,生物学显微镜下测定分生袍子器,分生弛子形态特征及大小,对菌 落性状及病菌形态特征拍照留存 5.3致病性测定 灭菌土中种植番茄,幼苗高15em,约6片8片叶时接种 待测菌株PDA上培养10d后,取菌落 中分生袍子黏液制成抱子悬浮液(弛子适宜浓度为1×10'CFU/mL),选用健壮番茄幼苗,茎杆用75% 乙醇表面消毒,无菌水冲洗3次,吸干水分,分生抱子悬浮液针刺接种,用湿润脱脂棉覆盖接种部位,以 无菌水接种为对照,接种后放人18C20C培养箱内保湿黑暗培养,2d后移去脱脂棉,12h光照黑略 交替继续保湿培养
GB/35331一2017 接种5d后观察发病情况，如出现可疑病斑,取病健交界处组织用75%乙醉表面消毒后,置马铃薯 葡萄糖选择性培养基PDA上培养并进行病菌再分离 5.4 Antibiotie“E”NaOH颜色反应 番茄亚隔抱壳茎腐病菌的近似种培养过程中产生代谢产物Antibiotic“E”,在碱性条件下 Antibiotie“E”发生氧化反应,随着酸碱度的改变其颜色也发生一系列的变化,由紫红色变为深蓝绿色 再转变为红色,培养基变为黄色 在麦芽提取物培养基MEA上培养7d后新鲜菌落的边缘附近滴人1滴0.1%NaOH溶液,观测液 滴边缘、中心部位及培养基颜色变化情况 鉴定特征 6.1培养性状 番茄亚隔抱壳茎腐病菌菌落生长较快,生长速度(直径);PDA上4mm/d7mm/d.OA上 n/d81 7mm/d9mm/d、MEA上5.5mm/ 8mm/d,菌落平铺不隆起,边缘规则,PDA上气生菌丝发达 紧密,毡状,菌落初为乳白色,老熟后菌落中部通常为灰色或暗橄榄绿色,培养基底部为深橄榄绿色至黑 色,菌落边缘为白色的环带;MEA和OA上菌落较PDA上稀疏,菌丝短絮状或毡状,MEA上菌落通常 为暗绿色,OA上菌落为白色、灰白色或灰褐色,有不明显的环痕(参见图C.1) 番茄亚隔抱壳茎腐病菌 菌落中常产生致密的气生菌丝簇,培养7d~10d后,培养基质中产生大量分生袍子器,菌落中或菌落 表层也有分生抱子器产生,但数量少于培养基质中,分生抱子器初期为黄色,很快变为暗黄色或黑色,孔 口处溢出淡粉色或肉色的分生抱子黏液(参见图C.,2) 6.2形态特征 无性态形态特征:分生袍子器黑褐色至黑色,多埋生于培养基质内,球形至不规则形,散生,单孔口. 分生抱子器壁为拟薄壁组织,极薄易破裂,培养基上大小为120m一210m,寄主上为180m 504m，分生袍子器常释放出淡粉色或肉色的分生抱子黏液 分生抱子器内同时存在单胞和双胞两 种分生抱子,单胞的分生抱子较多,无色透明,卵圆形、椭圆形或肾形,具0个2个明显或不明显油球 大小为(2.0m4.04m)×(4.04m~8.04m),双胞分生袍子较少,无色,透明,长椭圆形、肾形,分隔处 一4.5 ×7.0 10.0 稍有缢缩,具0个~4个明显或不明显油球,大小为(3.0Am~ Am)(参见 Am Am 图C.2 有性态形态特征子囊壳具近球形,浅棕色，具突起的喙，培养条件下子囊壳直径120pm 200 m，寄主上直径130Mm~2501 Mm;子囊椭圆柱形或棍棒形,无柄或具短柄,子囊壁双层,培养基上 0m95m)×6 大小为(504m" 70m)×(8m~9m),寄主上大小为(701 -104m);子囊含子 m 囊袍子8个,子囊抱子无色,梭形、椭圆形,两端稍钝,双胞,隔膜处稍缢缩,各具1油球,大小为(124m 18Am)×(5um一6um)(参见图c.2) 有性阶段子囊壳很少产生,需经过越冬阶段在落人土壤中的病 残体上产生,培养基上也难产生,且培养时间长 番茄亚隔抱壳紫腐病菌与番茄上近似种的区别参见附录D. 6.3致病性测定的症状表现 接种7d后,接种部位出现黑褐色梭形病斑,病斑进一步扩展环绕茎杆,茎出现枯萎坏死(参见 图C.3) 发病植株茎部病健交界处组织消毒后分离培养,一周后长出6.1及6.2所述典型菌落和分生抱子 器,可证明分离菌是番茄亚隔袍壳茎腐病菌
GB/T35331一2017 6.4NaOH颜色反应结果 番茄亚隔抱壳茎腐病菌的近似种茎点枯萎病菌Pho honaeriguavar.erigaDesm.培养过程中产生 代谢产物Antibiotie“E”,在碱性条件下发生氧化反应,随着酸碱度的改变其颜色也发生一系列的变化 颜色的变化首先从液滴边缘开始逐步到中心,变化过程为无色一紫红色一深蓝绿色一红色,而培养基变 为黄色 番茄亚隔袍壳茎腐病菌不产生Antibiotie“E”这种代谢产物,滴人菌落中的NaOH液滴不产生上 述颜色变化,始终为无色透明液体 结果判定 病原菌培养性状和形态特征符合6.1及6.2中描述致病性测定结果符合6.3描述、NaOH颜色反 应结果符合6.4描述可鉴定为番茄亚隔泡壳茎瘠病菌 8 样品保存与结果记录 8.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出香茄亚隔抱壳茎腐病菌的样品应保存于4C冰箱中 保存6个月,以备复核 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 8.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为番茄亚隔抱壳茎腐病菌的菌株,应妥善保存 将菌株接种于PDA培 养基斜面上,存活后置于4C一8C黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保存 6个月，必要时用病菌分生抱子作冻干菌种保存 保存期满后进行高压灭活处理 8.3结果记录与资料保存 实验记录包括样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法、图片和结果等,并有实验人员和审 核人员签字
GB/35331一2017 附 录 A 资料性附录 番茄亚隔抱壳茎腐病菌其他信息 寄主范围 A.1 主要寄主:番茄Solanum4ycoersicum;次要寄主:辣椒Capsicumspp.、马铃薯Solanumn tuberosum、茄子Solanummelongena、野生龙葵Solanumnigrum,次要寄主很少报道 A.2地理分布 亚洲印度、以色列、日本,马来西亚、,亚美尼业、文莱、四川 非洲科特迪瓦摩洛哥、尼日尼亚、多哥、乌干达 欧洲;阿尔巴利亚、奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、丹麦、德国,芬兰、法国,荷兰、立陶宛、 挪威、罗马尼亚、瑞典、希腊、西班牙,意大利,英国、乌克兰 大洋祥洲;澳大利亚、新西兰 北美洲:加拿大、美国、墨西哥 中北美洲古巴、多米尼加,巴拿马、波多黎各、特里尼达和多巴哥 南美洲;巴西、委内瑞拉 传播途径 近距离传播:植株茎杆、叶片及果实上病菌的分生抱子借风雨近距离传播 远距离传播:带菌种子及病残体进行远距离传播 A.4症状特征 番茄亚隔袍壳茎腐病菌引起植株茎腐、果腐和叶斑病,植株所有地上部分组织都会被感染 受侵染 的番茄植株初期症状不明显,持续一段时间后,地上部分茎基部产生黑褐色略凹陷病斑,向上下及四周 扩展,当扩至绕茎一周时,出现枯萎状,病菌向上发展或分生袍子再次侵染植株，上部茎杆出现溃疡病 斑;叶片受侵染后产生黑褐色同心轮纹病斑,病斑中央区域变薄,颜色较周围浅;果实一般从果柄处发 病,受侵染后出现黑色水浸状凹陷病斑,呈同心轮纹状 病情进一步发展,茎、,叶片、果实病斑处产生黑 色小颗粒,为病菌分生袍子器,潮湿情况下溢出粉红色袍子黏液使病变组织出现软腐,病情严重时植株 死亡 雨水多、潮湿气候利于病害发生扩散 番茄亚隔抱壳茎腐病菌在番茄植株不同部位上的症状表 现参见图A.1
GB/T35331一2017 说明: 茎基部环绕茎杆的黑色病斑; 上部枝条上溃扬病斑 -叶片上褐色轮纹状坏死病斑; 果尊处黑色凹陷病斑 病斑上黑色的分生抱子器 注:a、b.c、e ,e引自cAH2013.d引自德国巴伐利亚州农业研究中心资料 图A.1番茄亚隔抱壳茎腐病菌在番茄植株不同部位上的症状表现
GB/35331一2017 录 附 B 资料性附录 培养基配制方法 马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA B.1 马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,蒸憎水中煮30min,用4层纱布过滤,加人20g蔗糖、 8只琼脂,加热使之完全溶解,蒸馏水定容至1000nmL,分装于三角瓶中,121C高压灭菌15min,冷却 至45C50C时,倒平板,制成马铃薯葡萄糖培养基PDA 高压灭菌后的PDA冷却至45C50时,无菌操作下1000mL培养基中分别加人0.3g链霉素 和0.3g青霉素,混匀,倒平板,静置备用,即为马铃薯葡萄糖选择性培养基PDA B.2麦芽提取物培养基MIEA 称取麦芽膏或麦芽汁粉25g,加热溶解于蒸水中,加18g琼脂熔化,燕馏水定容至1000mL,分 装于三角瓶中,121C高压灭菌15min,冷却至45C50C时,倒平板备用,即为麦芽提取物培养 基MEA B.3燕麦培养基oA 称取燕麦片30g,蒸僧水中煮沸1h,用4层纱布过滤,加18g琼脂加热熔化,燕僧水定容至 000mL，分装于三角瓶中,121C高压灭菌15min,冷却至4550C时,倒平板备用,即为燕麦培 养基OA
GB/T35331一2017 录 附 C 资料性附录) 番茄亚隔抱壳茎腐病菌培养性状,形态特征及茎部接种后症状 番茄亚隔袍壳茎腐病菌培养性状、形态特征及茎部接种后症状见图C.1一图C.3 说明: 马铃薯培养基PDA 燕麦培养基oA 麦芽提取物培养基MEA 图c.1不同培养基上菌落性状
GB/35331一2017 00m 说明: -分生袍子器及孔口处溢出的浅粉色分生袍子黏液; 单孔口薄壁的分生抱子器; -单胞和双胞的分生抱子; 子囊壳、子囊及双胞子囊抱子 图C.2病菌形态特征
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GB/35331一2017 录 附 D 资料性附录 番茄亚隔抱壳茎腐病菌与近似种的区别 番茄亚隔抱壳茎病菌与近似种的区别见表D.1 表D.1番茄亚隔袍壳茎腐病菌与近似种的区别 病原菌 分生袍子特征 培养性状 Na(OH颜色反应 分生袍子单胞和双胞，稍宽oA上菌落白色、灰白色或 Phwmalxsopersi" 2.04m4.54m)×(3,.0m~ 灰褐色直径6em/7d DidyellaycopersiciD 无变化 10.0m)，多数(2.0m~ 7cm/7d，菌落中常产生致 番茄亚隔泡壳茎腐病菌 3.54m×(4.0m8.04m 密的气生菌丝簇 分生袍子单胞,较小(1.5m oA上菌落灰绿色至深蓝绿 Phoadesruetia 2.54m)×2.5m7.5Am). 色,生长缓慢,直径3cm/7d一 无变化 2.5umx 毁灭茎点霉 多数(2.0m n/7d,分生抱子黏液色 5cm/ 3.5Mm~7.0m) 深,藏红花色 分生抱子单胞和双胞,较细长，菌落颜色变化较大,OA上 单胞分生抱子较多,(1.5m~灰白色至黑色,有时暗绿色，有变化,液滴颜色转变过 Phomaeriguavar. 3.5Am)×3.0m10Am),生长较快,直径3cm/7d程;无色一紫红色一深蓝 e.ig In MEA上菌落常绿色一红包 茎点枯萎病菌 多数 d， 2.04m3m 8.5em/ 4.0Mm8.5m) 有不规则齿痕或扇形裂纹
GB/T35331一2017 参 考 文 献 andCrous，P.W [1]Av uyter，H.，wodenberg，J.，Verkley，G. Yeskamp，M.M.，DeGr tocharacterisePhoaandrelated 2010.HighlightsoftheDidymellaceae Apolyphasicapproach pleosporaleangenera.Stud.Mycol.65:1-64. deseribedby [2] Boeremma，GH，DorenboschMM，1973，ThePhomaandAscochytaspecies StudiesinMycol 3:;1-50. wolenweberandHochapfelintheirstudyoffruit-roting logy， [31 Boerema，G.H.，DeGruyter， Noordeloos，M.E.，andHamers，M.E.C.2004.Phoa dentificationmanual:differentiationofspeciicandinfra-specifictaxainculture CAB1Publishing 470 pages.Internationalwallingford.Oxfordshire，UK Kubota，M.，Kishi，K.，andAbiko，K 2000Phomaleafspot，stemmandfruitrotof [4打 tomatocausedbyPhomlycoersieiCookeinJapan.Jap Phytopathol.66:12-17. [[5]Mahendra，R，PrajaktaD，Aniket,G，etal.2009.PhomaSaccardlo:Distribution，secondary metabolieproduetionandbioteehmologicealaplieations.CriaalReoewsinMrbiology，35(3). 182-196. Morgan-Jones， andBurch，K.B.1988.StudiesinthegenusPhoma.XI.Concerning [6 Phomnalycopersiei，theanamorphofDiymellalycopersiei，causalorganismofstemcankerandfruit rotoftomatoMycotaxon32:133-142. Paul，Y.S.，Bhardwaj，L.N.，andParmar，Y.S.1987 Anewleafspotdiseaseoftomato. IndianJ.Mycol.Pl.Pathol.17:235. [[8]SteekelenburgNAMvan，1981.InoculationoftomatowithDiaymellaycopersici.ln:Phi louzeJ，ed.GeneticsandBreedingofTomatoProceedingsofthemeetingoftheEucarpiatommata workinggroup.Avignon，France:INRA，277-284. [9 SteekelenburgNAMvan，1988Factorsinfluenecingtheoccurrenceofstemlesionson tomatocausedbyDiaymellalycopersieiandchemicalcontrolofthediseaseMededelingenvande FaculteitL.andbouwwetenschappen，RiksuniversiteitGent，53(2b);651-656. [[10]CABlnternational,2013.CropProtectionCompendium,.wallingford,UK [11]http;//www.blumen-klefer.de/index php?id 87 KrankheitenundSchadlingeanm TomatenBayerischeLandesanstaltfirLandwirtschaftzurickzurAuswahl德国巴伐利亚州农业研究 中心 [12]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979

番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法GB/T35331-2017解析

番茄亚隔孢壳茎腐病菌是一种危害严重的植物病原菌，对番茄生产造成了很大的损失。为了有效预防和控制该病害的传播，国家颁布了《番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法GB/T35331-2017》标准，规定了该病菌的检测方法和评价标准。

该标准主要包括：样品采集、处理、分离纯化、鉴定等步骤。其中，样品采集应在发病高峰期进行，采用无菌工具采取植株上的病部组织；样品处理则要求将采集的植物材料进行分离，去除无关组织后制备成适宜的悬浮液。

在分离纯化步骤中，GB/T35331-2017标准要求使用玻璃棉过滤法或负压吸附法来提取番茄亚隔孢壳茎腐病菌的孢子。而鉴定步骤则要求通过孢子形态观察和生理生化特征分析等手段，对该病原菌进行鉴定。

值得注意的是，检测时需要配合一些实验室设备和试剂，如显微镜、培养基、抗生素等。此外，在检测过程中也需要严格遵守操作规范和安全防护措施，以确保检测结果的准确性和人员的安全健康。

总之，《番茄亚隔孢壳茎腐病菌检疫鉴定方法GB/T35331-2017》标准的实施，是为了更好地维护农业生产与贸易的有序发展，确保番茄生产的质量和安全，也为防止病害的扩散提供了有力支持。

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2022/8/24 3:13:38 现行