GB/T39602-2020
牛结节性皮肤病诊断技术
DiagnostictechniquesforLumpyskindisease
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2020-12-14
- 文件格式PDF
- 文本页数19页
- 文件大小1.43M
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牛结节性皮肤病诊断技术
国家标准 GB/T39602一2020 牛结节性皮肤病诊断技术 skindisease DiugostietechmiquesforLumpy 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/39602一2020 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 2 缩略语 3 临床诊断 4.1易感动物 4.2临床症状 4.3病理变化 4.4结果判定 实验室诊断样品采集 5.1器材 5.2试剂 5.3样品采集 5.4样品的送检与保存 5.5样品处理 6 电镜观察 6.1器材 6.2试剂 6.3操作步骤 6.4结果判定 病毒分离与鉴定 7.1器材 7.2细胞与试剂 7.3病毒分离 7.4病毒鉴定 实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR 8.1器材 8.2试剂 8.3引物及探针 8.4标准毒株和细胞 8.5样品的处理 8.6病毒DNA的提取和纯化 8.7实时荧光PCR检测 8.8结果判定 聚合酶链式反应(普通PCR方法)
GB/T39602一2020 9.1器材 9.2试剂 9.3引物 9.4样本的制备 9.5PCR检测 9.6结果判定 10微量中和试验(VN) 0.1器材 0.2细胞株 0.3标准毒株 0.4操作步骤 10.5阴阳性对照 0.6结果判定 结果解释 10,7 11 综合判定 1l.1疑似 1.2确诊 附录A(规范性附录 试剂的配制 附录B(资料性附录)引物扩增序列
GB/39602一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准对应于OIE最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册(2018版)的3.4.12牛结节性皮肤 病(L.SsD)有关内容,且与该条标准的一致性程度为非等效 本标准由农业农村部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位:重庆海关、动物卫生与流行病学中心、上海 海关、重庆澳龙生物制品有限公司
本标准主要起草人:聂福平、李林、李应国、吴晓东、王昱、杨俊、樊晓旭、王国民、李贤良、南文龙、 史梅梅、张雷、邹艳丽、王志亮、李键、冉智光
GB/T39602一2020 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到8.3引物及探针中引物对2和探针2 与《牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物,试剂盒及检测方法》相 关的专利的使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场
该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判
该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案
相关信息可以通过以下 联系方式获得 专利持有人姓名:聂福平、王昱、杨俊、李贤良、王国民、李应国
地址:重庆市江北区红黄路8号
请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任
IN
GB/39602一2020 牛结节性皮肤病诊断技术 范围 本标准规定了牛结节性皮肤病(L.SsD)的临床诊断,实验室诊断技术和程序
本标准适用于牛结节性皮肤病的诊断
病毒分离与鉴定适用于个体动物移动前的无感染证明或临 床病例确诊;电镜观察适用于临床病例确诊;实时荧光PCR与普通PCR适用于个体动物移动前的无感 染证明、临床病例确诊和监测感染流行率;血清中和试验适用于个体动物移动前的无感染证明、确诊临 床病例、监测感染流行率和免疫效果评估
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 兽医诊断样品采集.保存与运输技术规范 NY/T541 缩略语 下列缩略语适用于本文件
CPE,细胞病变(Cytopathicefect) DNA;脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAeid) GMEM:生长营养需要培养基(Glasgow'sModifiedEagle'sMedium) ISD;牛结节性皮肤病(1 Lumpyskindisease I.SDV;牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus) LTe;羔羊睾丸细胞(Lambtestiscel) ORF;开放阅读框(Openreadingframe) PBS;磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsaline' PCR;聚合酶链式反应(Polymeraseehainreaction) TCIDn;半数组织培养感染量Mediantissuecultureinfeetivedose) Vero;非洲绿猴肾细胞Afrieangreenmonkeykidneycell) VN;病毒中和试验(Virusneutralisationtest) 临床诊断 4.1易感动物 各种品种的牛,包括黄牛、奶牛,亚洲水牛、瘤牛、托牛均易感,绵羊,山羊及野生动物长颈鹿、黑斑 羚、长角羚羊可人工感染
GB/T39602一2020 4.2临床症状 4.2.1易感动物体温升高达41C,持续1周2周;鼻炎、结膜炎和唾液过度分泌;厌食,精神委顿,不 愿行走,泌乳奶牛产奶量显著减少
4.2.2易感动物全身皮肤、黏膜出现结节,以头,颈、乳房腿部、背部、胸部、阴囊、外阴、会阴、眼脸、耳 梢、口鼻黏膜及尾部尤为突出,结节大小不等,可聚成不规则的肿块,可波及全身皮肤、皮下组织,肌肉 组织
易感动物口腔和消化道黏膜表面形成丘疹;全身体表淋巴结肿大;眼、鼻,口、直肠、乳房和生殖 4.2.3 器黏膜表面形成结节,并迅速溃烂
4.2.4母牛流产与暂时性不孕;公牛罹患睾丸炎和附睾炎,暂时性或终生不育
4.3病理变化 4.3.1患病动物皮肤表面可见直径0.5em一5cm、深度1emm一2cm的皮肤结节,累及所有皮肤层、皮 下组织以及相邻的肌肉,并伴有充血、出血、水肿、血管炎和坏死;口腔、气管、生殖道和消化道黏膜(特别 是皱胃)可能存在结节
4.3.2皮肤、肌肉等结节附近发生炎症反应，结节下,黏膜下,结缔组织或周围组织有浆液性渗出,皮下 组织水肿;咽,呼吸道、消化道,包皮,阴道、子宫壁的病变也有此特点 43.3咽、舌和会厌以及整个消化道黏膜出现痘样病变
鼻腔、气管和肺等黏膜出现痘样病变;睾丸和 膀胱出现痘样病变
4.3.4结节切面为乳白色或白色,初期可渗出血清,2周内结节内可能出现锥形中央核或坏死组织/坏 死灶
4.4结果判定 4.4.1易感动物出现上述临床症状和病理变化,可判为疑似牛结节性皮肤病
4.4.2确诊应采集有临床症状动物的结节、抗凝血进行实验室诊断,或采集未见明显临床症状易感动 物的抗凝血、唾液、鼻眼分泌物进行实验室诊断
5 实验室诊断样品采集 5.1器材 5.1.1手术剪刀和子
5.1.2灭菌样品保存管(15ml或50ml). 5.1.3离心管(2mL,l0mL) 5.1.410ml一20mL灭菌注射器
5.1.5防水标签
5.1.6医用防护服
5.1.7组织匀浆器
5.1.8高速组织匀浆机
5.2试剂 5.2.10.1nmol/LPBs(pH7.4),按照附录A的A.1配制
5.2.210%甘油-PBS保存液,按照A.2配制
5.2.3青霉素,终浓度为1000IU/mL
GB/39602一2020 5.2.4硫酸链霉素,终浓度为1mg/mL 5.2.5制霉菌素,终浓度为100IU/ml 5.2.6两性霉素B,终浓度为25E/mL. 5.2.7新霉素,终浓度为200IU/mL
5.2.8GMEM培养基
5.3样品采集 5.3.1皮肤结节采集 用0.1lmol/LPBs(pH7.4)清洗皮肤结节表面,然后用灭菌手术剪刀剪取结节,2g5g为宜
采 集到的皮肤结节装人样品保存管,加10%甘油-PIs保存液,使保存液液面没过样品,加盖封口,冷冻 保存
5.3.2组织样品采集 除皮肤结节外,在活体检查或死后剖检时,可采集淋巴结、病变肺部组织、脾、脏器上的病变结节及 病灶周围组织2g一5g,装人样品保存管,加10%甘油-PBS保存液,使保存液液面没过样品,加盖封口， 冷冻保存
临床表现健康,但需要做牛结节性皮肤病病原学监测的动物,可在屠宰时采集EDTA抗凝 全血、淋巴结
对肉品进行牛结节性皮肤病病原检测时,可采集肌肉组织样品不少于2g,装人样品保存 管中,密封、冷冻保存
5.3.3其他类型样品采集 活体检查,可采集病牛的皮肤结节或结痂周围组织病料,唾液、口腔/鼻腔拭子、牛奶,精液、抗凝血 含EDTA或肝索钠)等
采集动物血液,每头应不少于2mL
用于血清分离的血液样品,每头应不少 于5mL
采集的唾液、口腔/鼻腔拭子应立即装人样品保存管,加人0.5mL的10%甘油-PEBS保存液 加盖封口,冷冻保存
5.4样品的送检与保存 样品的运送与保存应满足NY/T541的相关要求
从抗凝血中分离血浆即棕黄层)样品需立即 置于冰上,尽快处理
样品可在4c一8C保存艺d
用于病毒分离和抗原检测的组织样品需置于 4c一8c,冰封或-20笔保存
长距离运输样品(无冷链)样品保存液中需含10%甘油,且样品体积 需足够大(按每克样品添加10mL10%甘油-PBS保存液),避免运输介质渗透到组织样品中
5.5样品处理 5.5.1生物安全措施 样品制备的生物安全措施应满足GB19489的规定
5.5.2组织病料的处理 用于病毒分离和抗原检测的病灶样品,无菌剪碎后,加人等体积的无菌PBS或含抗生素含 1000IU/mlL的青霉索、lmg/ml的硫酸链霉素和100IU/ml的制霉菌索或2.5"g/mL的两性霉素B 和200IU/mL的新霉素)的无血清GMEM培养基,无菌研磨,制成10%的组织悬液,制成的悬液反复 冻融3次后,以800终离心10min
上清液用0.22丝m的滤器过滤,可用于病毒培养等
5.5.3 血液样品的处理 采集的抗凝血,800尽离心15min,小心吸取上清液中含病毒的棕黄层血浆,将其转移至5ml
预
GB/T39602一2020 冷去离子水中,30s后,加人5mL预冷的双倍浓度的GMEM培养基,混匀
混合液以800离心 5min,弃去上清,用5mL.GMEM培养基悬浮细胞沉淀,再以800g离心15min,最后用5ml新鲜的 GMEM培养基悬浮沉淀,用于病毒分离培养
6 电镜观察 6.1器材 6.1.1透射电子显微镜
6.1.2台式冷冻离心机
6.1.3微型振荡器
6.1.4石蜡膜或蜡板
6.1.5微量移液器
6.2试剂 6.2.1Tris-EDTA缓冲液(pH7.8),按照A.3配制
6.2.22%磷钨酸溶液(pH7.2),按照A.4配制
6.3操作步骤 取患病动物新鲜的皮肤结节或其他活体组织,制备组织悬液,采用透射电子显微镜观察
取一滴制 备的悬液于石蜡膜或蜡板或载玻片上,将约384m(即400目)碳网膜漂覆于悬滴液上1min,再将碳网 膜转移到一滴Tris-EDTA缓冲液(pH7.8)中20s,接着转到一滴2%的磷钨酸溶液(pH7.2)中染色 0s
取出碳网膜,用滤纸吸去膜上液体,自然干燥后,置于电子显微镜下观察
6.4结果判定 牛结节性皮肤病病毒粒子如砖状,周围覆盖有短管状结构,大小约为290nm×270nm,部分病毒粒 子周围有宿主细胞膜包围
病毒分离与鉴定 7.1器材 7.1.14C一8C冰箱 7.1.2超低温冰箱 713台式冷陈离心机.
入1. 生物型安全柜
7.15二氧化碳培养箱
71
倒贝慧微她 力17 微量移液器(AL一20AL.20L一200AL100AL~1000L等不同规格). 7.1.8细胞培养板,或25em”细胞培养瓶
7.2细胞与试剂 7.2.1山羊或绵羊原代(或次代LTe. 7.2.2GMEM培养液
GB/39602一2020 7.2.3胎牛血清
7.2.4苏木精-伊红染色液,按照A.5配制
7.3病毒分离 取5.5.2或5.5.3中处理后的病料上清液或棕黄层液体1ml,接种25cm培养瓶中的单层1Te. 37C吸附1h,补加10mL含有2%胎牛血清的GMEM培养液,或用含有LT细胞和爬片的组织培养 逐日观察CPE情况持续观察7d14d 液
出现绸胞膜皱缩至绸胞圆缩、核染色体边缘化等cPE 感染初期可见小面积的CPE,4d6d后波及整个细胞层,14d后如未发现CPE,应将培养物反复冻融 3次,取上清液再接种单层LT细胞,进行二次培养
细胞出现CPE或感染爬片出现CPE,则进行病毒 特异性鉴定 7.4病毒鉴定 7.4.1典型细胞病变如7.3所述
若培养液中含有特异性牛结节性皮肤病抗体,CPE可能被阻止或 推迟
.4.2取7.3中细胞培养物,用丙酮固定,进行苏木精-伊红染色(即H&.E染色)观察
当观察到直径 相当于细胞核一半,大小不一,且周边有清晰的亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体,即可诊断为痘病毒感染
7.4.3或取7.3所述细胞培养物提取DNA,采用聚合酶链式反应,扩增、测序分析,可鉴别诊断牛结节 性皮肤病病毒;或采用实时荧光聚合酶链式反应进行牛结节性皮肤病病毒核酸检测
实时荧光聚合酶链式反应(实时荧光PCR 8.1器材 8.1.1微量高速离心机
8.1.2生物型安全柜
8.1.3微型震荡器 8.1.4恒温水浴锅 8.1.5高压灭菌锅 8.1.6低温冰箱
8.1.7实时荧光PCR仪
8.1.8微量可调移液器(0.5L10AL5l20AL20Al200L100L~1000L)及配套吸头 8.2试剂 以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂,水应符合GB/T6682中规定的三级水的规格 8.2.1PrenmixExTag(ProbeqPCR)荧光PCR缓冲液
8.2.2营养液,按照A.7配制
8.2.3维持液,按照A.8配制
8.2.4细胞分散液,按照A.9配制
8.2.5商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒
8.3引物及探针 根据牛结节性皮肤病病毒的标准株Neethling株基因序列ORF101和ORF126基因,Genbank登 录号:AF409137.1),在其保守区域分别设计引物和探针,引物及探针序列见B.1
引物对1(F1和R1
GB/T39602一2020 与探针1用于通用型LSDV核酸检测,引物对2(F2和R2)和探针2用于野生型和疫苗型LSDV核酸 的鉴别
具体扩增基因信息见附录B中B.1
引物与探针均用无菌去离子水配制成10Mmol/L -20C保存 8.4标准毒株和细胞 8.4.1标准毒株;以L.SDvV国际标准毒株Nethling株为试验参照毒株
8.4.2细胞;无菌取健康羔羊睾丸,制备原代睾丸细胞
8.4.3阳性对照样品;由指定单位提供或按照下列方法制备,将牛结节性皮肤病病毒国际标准毒株按 10%体积分数)接种原代睾丸细胞,37C吸附1h后补加人细胞维持液,37、5%CO培养,待CPE 达到70%以上收获病毒悬液;反复冻融3次~4次,12000离心10min,取上清液备用
8.4.4阴性对照样品:由指定单位提供或按照下列方法制备将正常的原代睾丸细胞,反复冻融3次 4次,12000离心10min,取上清液备用
8.5样品的处理 取5.3采集的临床样品,包括皮肤、肺、,脾脏、淋巴结、肌肉等,取2g~5g组织样品切成小块,加人 5mL10mL预冷的PBS缓冲液匀浆2nmin,制成悬液,反复冻融3次,4c12000只离心10min,取 200lL上清液进行核酸提取
液体样品(包括抗凝血、精液、细胞培养液等);直接取200L进行核酸提取
8.6病毒DNA的提取和纯化 核酸提取应在生物安全柜中进行,取阴性、阳性对照和8.5中前处理的样品各200L,按照传统盼 三氯甲婉(氧仿)抽提法提取核酸,或采用等效的DNA提取试剂盒及其方法进行病毒核酸提取
8.7实时荧光PCR检测 8.7.1实时荧光CR反应体系 检测牛结节性皮肤病病毒实时荧光PCR体系见表1
以牛结节性皮肤病病毒DNA作为阳性对 照,以不含LSDV的牛肉组织原代睾丸细胞DNA作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照
表 实时荧光PCR反应体系" 名称 贮备液浓度 体系工作液浓度 加样体积/l PremixExTaq缓冲液 1l.2 15 正向引物 10mol/1 0.44mol/L 反向引物 10mol/几 0.44mol/1 0.5 MGB探针 10Amol/L 0,2Amol/L 模板DNA 2.5 灭菌去离子水 反应体系总体积 25 实时荧光PCR反应体系可根据实际情况进行相应比例的调整
8.7.2实时荧光CR反应参数 实时荧光PCR反应参数:95预变性3min, ,95C10s,58C34s,共45个循环,5834s收集
GB/39602一2020 FAM荧光信号
8.8结果判定 8.8.1结果分析 读取检测结果,闵值设定原则以阀值线超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准
不同仪器可根 据仪器噪声进行调整
8.8.2质控标准 阴性对照的检测结果应无特异性扩增,阳性对照的Ct值应一28.0.
8.8.3结果描述及判定 8.8.3.1阳性 Ct值<40,且出现明显的s扩增曲线,表明样品中存在牛结节性皮肤病病毒核酸
8.8.3.2阴性 无特异性扩增曲线或Ct值>45,表明样品中无牛结节性皮肤病病毒核酸
8.8.3.3有效原则 0.0
GB/T39602一2020 9.2.31×TAE电泳缓冲液
g.2.4琼脂糖
9.2.5电泳加样缓冲液
9.2.6DNA2000Marker(标准分子量. 9.3引物 上游引物F;5'-cCTcCTTTTAAGCTACTTTTTCTTA-3' 下游引物R:5'-GATACATGTAGGAAcATTGTTAccTA-3'
具体扩增基因信息参见B.2
用灭菌去离子水配制成10mol/几使用工作液,一20保存
g.4样本的制备 阴性对照、阳性对照、样本的处理、核酸提取均同8.4一8.6
9.5PCR检测 g.5.1CR反应体系 检测牛结节性皮肤病病毒普通PCR反应体系见表2
以牛结节性皮肤病病毒DNA作为阳性对 照,以不含L.SDV的牛肉组织,原代睾丸细胞DNA作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照
表2普通CR反应体系" 名称 贮备液浓度 体系工作液浓度 加样体积/L 2×PremixExTa缓冲液 12.5 10Hmol/1 正向引物 0,04Mmol/L 反向引物 10mol/门1 0,04Mmol/L 模板DNA 灭菌去离子水 8.5 反应体系总体积 25 "PCR反应体系可根据实际情况进行相应比例的调整
9.5.2PCR反应条件 PCR检测的循环参数:95C预变性5nmin,95C30s,52C30s、72C30s,共35个循环,72C延 伸5min
g.5.3扩增产物电泳检测 9.5.3.11.5%琼脂糖凝胶的制备;称取1.5g琼脂糖,加人100mL1×TAE缓冲液中
加热融化后加 5Al(10mg/mL)GoodViewrM,混匀后倒人凝胶盘中,胶厚5mm左右
依据样品数选用适宜的梳子 待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液淹没胶面
9.5.3.2加样;取5lPCR扩增产物与1l加样缓冲液混匀后加人一个加样孔
每次电泳时加标准 DNAMarker、阴性对照、阳性对照
40 9.5.3.3电泳:电压80V100V,或电流40mA50mA
电泳30min~ min
GB/39602一2020 g.6结果判定 g.6.1试验成立条件 电泳结束,取其凝胶置凝胶成像仪的紫外灯下观察
阳性样品电泳结果应有一条大小为376bp的 条带
阴性对照无扩增条带;反之,此次实验视为无效
9.6.2阴阳性结果判定 符合9.6.1的条件,被检测样品若出现376bp大小条带则为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性;被检测 样品无特异性扩增条带,判为牛结节性皮肤病病毒核酸阴性
检测为核酸阳性的样品,其PCR产物应 送测序公司进行测序分析,将测序结果与NCB登录序列信息进行比较,序列一致性达97%以上,则判 定为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性
0微量中和试验(VN 0.1器材 10.1.1二氧化碳培养箱
10.1.2倒置显微镜
10.1.396孔细胞培养板
0.1.4微量可调移液器及配套吸头
10.2细胞株 Vero细胞或LT细胞
10.3标准毒株 山羊痘病毒标准株:0240KsGP疫苗株,滴度大于6lgTCID/mL
10.4操作步骤 10.4.1待测血清包括阳性、阴性对照)按1;5的比例用Eagle'、/HEPES营养液稀释,56C灭活 30 min
10.4.250"L已灭活的血清按照如下顺序加样第1份灭活待测血清加人到96孔细胞培养板A行~ H行的纵向1列和2列中,第2份灭活待测血清加人到A行H行的3列、4列;第3份灭活待测血清 加人到A行H行的5列和6列;阳性血清加人到A行H行的7列和8列,阴性血清加人A行H 行的9列和10列,50"L无血清的Eagle's/HEPES营养液加人到A行~H行的11列、12列
,用Eagle':/HEPEs营养液稀释,梯 10.43取山羊痘病毒标准参考毒株滴度大于6lgTCI D-/ml 度依次为5.0lgTCID TCIDm/ml,3.5lgTCID/ml,3.0lg TCID/ml2.5gTCID,m/ /ml /ml、4.0lg 2.0lgTCD,n/ml、1.5g /ml(相当于每50AL的病毒含量为3.7gTCIDa、2.7lgTCID ,.a7gTcD.,021 TCID. 2.2gTCIDm,1.7gTCDm、1.2lgTCIDm W 0.4.4从稀释度最高的G行开始,每孔加人不同稀释度的50AL病毒液
每个稀释度病毒均重复操 作直至病毒浓度最高的A行 0.4.5将96孔细胞培养板置5%的二氧化碳培养箱37C孵育1h
10.4.6将预先培养好的LT单层细胞用Eagle's培养液(含有抗生素和2%胎牛血清)制备成细胞数为 10'个/mL的细胞悬液
除H行的11孔和12孔作为培养液对照外,每孔加人100L
细胞悬液
GB/T39602一2020 H行剩余其他各孔即H行的1孔~10孔)作为细胞和血清对照孔
10.4.7将制备好的96孔细胞培养板放置于5%的二氧化碳培养箱37C培养9d,从第4天起,逐日观 察CPE情况
H行的细胞孔应不出现CPE
第9天进行结果判读,按照SpearmanKarber方法计算 每个重复滴度的病毒滴度
10.4.8同时做山羊痘病毒回归试验以测定病毒实际TCIDn
10.5阴阳性对照 0.5.1阳性血清和阴性血清均按被检测血清进行测定
10.5.2病毒回归试验,即重新测定病毒的TCID,将病毒培养液做10倍系列稀释至10-,每个稀释 度加4孔,每孔加50L,补加50L培养液,再加入细胞悬液100L,计算试验所用50AL病毒液含有 实际的TCID
0.6结果判定 0.6.1用倒置显微镜从第4天起每天观察CPE变化,当病毒培养物对照、阴性血清对照均出现CPE,阳 性血清对照无CPE,待检血清对细胞无毒性,对照细胞生长正常,病毒实际用量在50TCID,n/50Al 150ICID,n/50AL范围内方能判定结果,第9天终判,抗体效价滴定判读标准是以待检血清最高稀释度 50%保护为该待检血清的中和效价,以能保护细胞免于破坏的血清最高稀释度为该血清滴度
0.6.2中和指数以阴性对照血清与试验血清的病毒滴度的对数差(log)来表示,中和指数大于或等于 ！:5为阳性,小于1:5为阴性
0.6.3每次试验，阳性对照血清滴度不应比其已知效价差1个滴度以上，回归滴度变化应在 50TCIDm150TCID之间
10.7结果解释 0.7.1血清中和试验是羊痘病毒属病毒最特异的血清学试验方法,但LSD感染后主要是细胞免疫,动 物感染LSD病毒后仅产生低水平的中和抗体,因此在采用中和试验结果的同时,需结合临床症状等指 标做最终判定
0.7.2但若是检查同一动物感染前和感染后的血清,则以微量血清中和试验更敏感
临床症状出现 后第2天则可检测到羊痘病毒抗体,持续约7个月,均可检出抗体,但在第21天第42天抗体滴度明 显升高
综合判定 11.1疑似 凡符合I.SD流行病学特点,具有第4章临床诊断特点的病例,可判为牛结节性皮肤病疑似病例
1.2确诊 1.2.1临床判定为疑似的易感动物，经电镜观察(见第6章)发现牛结节性皮肤病病毒,或经病毒分离 见第7章)分离出牛结节性皮肤病病毒,或经实时荧光PCR(见第8章),普通PCR(见第9章)任一项 检测出牛结节性皮肤病病毒核酸的,可判为牛结节性皮肤病发病
11.2.2临床无明显特异症状的非免疫动物经病毒中和试验(见第10章)检测出抗体阳性,可判为该动 物曾经疑似感染过牛结节性皮肤病病毒,需结合其他方法进行综合确诊 11.2.3临床无明显特异症状的易感动物,经第6章,第7章第8章,第9章中任一项检测出阳性的,可 判为牛结节性皮肤病带毒(潜伏感染或持续感染).
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GB/39602?2020 ? A 淶?? ? A.1pH7.0PBS A?;?(NaCl) 8.0g" 0.2 (KC) g ?(CaCl2H.o) 0.132 g ??(MgCl2H,O) 0.1 00ml ?? 1.15g B?:(NaHPO (KHPO 0,2g" 200 ?? nml γ?????С0.104MPa~0.112MPal5min?A?B ??,B?A?н??500mL1000mL?С?1mL 5mL?(NB)н?顣4C? A.210%? Hank's?10?? ?(NaCI 80g ?(KCI 4.0g ?(MgSO7H.O) 1.0g ??(MgClg6H.O) 1.0g ?(CaCI 1.4g 10g ?? 800ml ?;???,???,1000 . ,?,? n1 ?4C ?;ù1000IU/mL.,ù1nmg/mL.,ù100IU/ml,ù 2.54g/mLù200IU/mL ??,?Hank'?10??,???1?,??10% ,?10%? A.3IrisEDTA?(pH7.8) A.3.10.05mol/1Iris?(pH7.8) 50mL0.1mol/LTris?34.5mL0.1mol/,??100mL A.3.2Iris-EDIA?(p7.8) 0.01mol/LTris?(pH7.8)0.001mol/L.EDTA(pH8.0)? 1
GB/T39602一2020 A.42%磷钨酸溶液(plH7.2 取20ml磷鹤酸加人800ml去离子水中,调节pH值至7.2备用
A.5苏木精-伊红染色液 苏木精 1g 氧化永 0.5g 10nmL 乙醇 硫酸铝钾(或硫酸铝铵》 20g 200 去离子水 ml 配制:在乙醉内溶解苏木精,在水内溶解硫酸铝钾,加热助溶;混合苏木精和硫酸铝钾溶液,尽快煮 沸;加人氧化汞,此时溶液变成深紫色;在自来水中迅速冷却;滤纸过滤,装人瓶中,盖紧,室温保存
使用方法;制备涂片在空气中干燥,用磷酸缓冲液洗3次,以去除蛋白;在Zenker's液配方见 A.6)中固定12h36h;自来水中洗30min;80%乙醉中脱水;转到0.5%碘液(95%乙醉配制)5min;转 到0.5%硫代硫酸钠水溶液中5min;在自来水中洗5min,用苏木精染色10min,在稀释的氨水中分化 直到呈蓝色(约10min);用0.5%伊红复染2s5s;在三缸95%乙醇中脱水(即3次),然后快速转到两 缸纯乙醉(即2次);在二甲苯中脱脂2次,每次2min~5min;用中性香胶固封
A.6Zemker's液 氯化汞 70g 硫酸钠 0g 次氯酸钾 25g 去离子水 1000mL 配制方法;将上述盐类溶于水中(加温),室温保存
使用前加冰乙酸使其最终浓度为5%
使用方法;切组织块(厚3mm一4mm),根据组织块大小固定6h~8h,用自来水冲洗过夜或每 h~2h换水一次,共2次一3次,组织保存于70%乙醇中 营养液 GMEM培养基添加10%无LSDV抗体的胎牛血清,内含青霉素200IU/mL,链霉素200IU/ml 过滤除菌
A.8维持液 GMEM培养基添加2%无LSDV抗体胎牛血清.内含青霉素200IU/mL.链霉素200IU/mL.过 滤除菌
此法用于观察细胞在体外感染后的一般形态,显示细胞的变化,融合细胞形成及细胞内包涵体,嗜酸性包涵体 1 染成亮红色
此液固定的组织,细胞核与细胞质的染色较清晰,也较稳定 2 12
GB/39602?2020 A.9??? 2.50 ? g 0.20 (EDTA) g l000mL ??PEBS 0.22m???20C汸á
GB/T39602一2020 附 录 B 资料性附录) 引物扩增序列 B.1牛结节性皮肤病病毒特异性片段序列(实时荧光PCR 引物F1:5'-TGAATTAGTGTTGTTTcCTTC-38',引物R1:5'-GGGAATcCTcAAGATAGTTCG- 3',探针1;5'-FAM-TGccGCAAAATGTcGA-MGB3';引物F2;5'-ATTTAATTTGGGAcGATAA CAACG-3',引物R2;5'-GTTGTTACAACTCAAATCGTTAGG-3',探针2;5'FAM-ACCACCTA ATGATAG-MGB3' 引物对1(F1和R1)扩增序列 TGAATTAGTGTTGTTTCTTCATcGACATTGcGGCAACGAACTATCTTGAGGATTCCC 引物对2(F2和R2)扩增序列 ATTTAATTTGGGACGATAACAACGTTTATGATTTAcCAcCIAAIGATAGTGTTTATGAT TTACCACCTAACGATTTGAGTTGTAACAAC 注:下划线为引物匹配位置,下划线黑体为探针匹配位置
B.2牛结节性皮肤病病毒特异性片段序列(普通PCR) CcTccTTTTAAGcTAcT" AAATCTGAC TATAAcTATTAATGTATAAGATAAAT AAGTAcTATCAAGTG CTATCATAATAATGATATTA" ACTCTACATAN TTAA TAATACAACTGTTTTAAACA4 TACATTGTGTGATGT ATcTAAAGAAGTACAAN TGGTcTATTTTTAACTTT TTTATGCAATAATAACGATAGTTA TAGAAAATGGAATAGGTA ACAATGTTcCTACATGTATc
牛结节性皮肤病诊断技术GB/T39602-2020解析
牛结节性皮肤病，又称“瘤胃蚤草病”，是由食用寄生在牛瘤胃中的瘤胃蚤草（Epichloë coenophiala）所产生的毒素引起的一种慢性、复发性、局部性皮肤病。其主要特征是在牛的头、颈、肩以及背部等处出现许多大小不等的结节，严重影响到牛只的正常生活和生产能力。
GB/T39602-2020是我国针对牛结节性皮肤病制定的诊断技术标准，该标准包括了对牛结节性皮肤病的定义、临床表现、病理变化、实验室检查等方面的详细描述，并规定了诊断所需的样品类型、实验方法、结果判定标准等。此标准的制定为牛结节性皮肤病的诊断提供了科学依据，也为防控该疾病提供了有力保障。
根据GB/T39602-2020标准，牛结节性皮肤病的诊断通常需要通过以下步骤进行：
- 对患牛的临床表现进行仔细观察，包括皮疹的部位、大小、形态、颜色等；
- 对临床表现不明显或病程较长的疑难病例，应采用病理组织学检查进行确诊；
- 采集血清样品，通过ELISA等免疫学检测方法检测与该病相关的抗体水平，以协助诊断；
- 利用PCR等分子生物学检测技术，直接检测牛瘤胃中的瘤胃蚤草（Epichloë coenophiala）或其DNA，为病原学诊断提供重要依据。
总之，GB/T39602-2020标准的制定使得牛结节性皮肤病的诊断更加科学、规范和准确。在防治该疾病的过程中，需要专业人士遵循诊断标准，采用多种诊断技术相结合的方式进行诊断，并根据诊断结果制定合理的治疗方案，以期达到更好的预防和控制效果。
