芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36779一2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofF4sariunoxysporumf.sp.api 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36779一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:珠海出人境检验检疫局,浙江大学、烟台出人境 检验检疫局 本标准主要起草人:张卫东、黄永辉、权永兵、宋凤鸣、迟远丽,徐森锋、廖力、林伟、李金庆、于金迪
GB/T36779一2018 芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了芹菜枯萎病菌检疫鉴定的方法 本标准适用于可能携带芹菜枯萎病菌的种子、种苗、植物残体及土壤中芹菜枯萎病菌的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 S/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589植物病原真菌检测规范 芹菜枯萎病菌基本信息 中文名:芹菜枯萎病菌 学名:Fusariumo.rysporumSchlecht.f.sp.apiiSnyderetHansen.1940 异名.Fuariwm.bulhigenwCookeetMasee.1887.、F4ariwmrhwerasAppeletwolenw.1910o Fusariumang4stumSherb.1915、F4sariumorthocerasvar.apii(NelsonetSherb.WollenwetRein- king.1935、FusariumapiNelsonetSherb.1937、Fusariumaivar.alidwmNelsonetSherb.1937 1940 Fasarium.oryspwrunfapi(Nelsoncshetb.)snyderetHansen" 0、Fusariumbulbigemvar. bii(Nelson&.Sherb.Raillo.1950 4i 分类地位;真菌界(KingdomFungi)半知菌门(Deuteromycota),丝袍纲(Hyphomyetes),瘤座抱 目(Tuberculariales)、瘤座抱科(Tuberculariaceae)、镰刀菌属(F4sariwm 芹菜枯萎病菌的其他信息参见附录A 原理 芹菜枯萎病菌的危害症状、菌落的培养性状、寄主范围、分子生物学特性、致病性测定结果等特征是 其鉴定的主要依据 仪器设备、用具和主要试剂 5.1仪器 RCR仪.光照培养箱,生物显微镜(100x一1000x),体视显微镜、组织研磨仪.生物安全柜,高迷冷 冻离心机、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平(感量0.0001g),pH计、高压灭菌锅 5.2用具 酒精灯、纱布烧杯,接种针、接种环,培养皿、锥形瓶、棉花塞、载玻片,盖玻片,铝铂纸,解剖刀,解剖
GB/T36779一2018 剪,锻子,记号笔、移液器(1000AlL、200L、100L,20AL、10ML2.5ML)和离心管 5.3主要试剂 无水乙醉醇,氯化钠饱和酚、氯仿、次氯酸钠(NaCIO),异丙醇,异戊醇、五氯硝基苯(PCNB),冰醋 酸,流基乙醇、Tris-盐酸、,NaEDTA、十二炕基硫酸钠(SDs),十六烧基三甲基嗅化胺(CTAB),聚乙烯 毗咯烧酮(PVP),澳化乙锭,DNA分子量标准,马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 6 现场检疫 取样时应针对性检查,注意检查有无可疑病株,若有可疑病株应将其挑出来,并送实验室进一步检 验鉴定 在以上针对性检查基础上,再按照SN/T2122的规定执行 检疫鉴定方法 7.1症状检查 7.1.1种子症状检查 在解剖境下挑选皱缩、干瘪,变色、残缺的或有霉变的种子,分成2份,每份种子样品不少于500粒， 其中一份用于PCR初筛,另一份用于病原菌的分离鉴定 7.1.2植株症状检查 取待检植株,观察植株是否存在生长不良、矮小衰弱、叶柄褪色、叶片变黄等外观变化，纵切叶柄检 查维管束是否变褐褪色(参见附录B),检查植株有无附着土壤 7.2PCR初筛 7.2.1样品DNA提取 取挑选的种子、植株可疑病变组织或土壤提取DNA(见附录C). 7.2.2PCR检测 PCR检测方法见附录D,PCR初筛检测结果阳性进行7.3病菌分离培养;PCR初筛检测结果阴性， 则可报告未检出芹菜枯萎病菌 7.3病菌分离培养 7.3.1种子 将种子用有效成分为1.25%的次氯酸钠(NaCIO)溶液表面灭菌3m nmin4min,无菌水洗涤2次,放 在垫有3层无菌湿滤纸的培养皿中,每皿10粒,在20C一22C下放置24h后，一20C冷冻24h,转至 25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物,挑取边缘菌丝移 置PDA培养基平板上纯化 包衣种子可用双蒸水洗去表面的种衣剂 7.3.2植物组织 取待检样品的组织切成1cm长的小段,冲洗掉表面的泥土杂物后,在75%乙醉中浸泡1 ,经无 min，
GB/36779一2018 菌水洗涤后,用灭菌解剖刀横切成长度为2mm4mm的小方块,放置在垫有3层无菌湿滤纸的培养 皿中,每皿5片10片,转至25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察植物残体表面是否出现 白色菌丝或霉状物,挑取边缘菌丝移置PDA培养基平板上纯化 7.3.3土壤 取2只土壤放人200mL无菌水中,混匀30min,悬浮液稀释10倍,取1mL土壤稀释液涂抹于含 五氯硝基苯(PCNB)的PDA平板上,5个重复,转至25C光照培养箱里黑暗12h光照12h培养,观察 菌落的产生情况,将可疑菌落转移至PDA培养基平板上纯化 7.4分离物的纯化 分离物的纯化采用琼胶平板表面单袍子挑取法进行纯化 将分离物上产生的抱子用茵水洗下 稀释到每个培养皿中30个左右的袍子,取一定量的袍子悬浮液加到洁净的硬琼胶培养基平板上,25C 条件下过夜放置 在生物显微镜下检查,用消毒的解剖刀或接种针将初萌发单个袍子的小菌块转移到 PDA培养基上 7.5形态学观察 纯化后的分离物转到PDA上培养,观察记录菌落形态,颜色,大型分生抱子、小型分生袍子和厚垣 袍子的形态特征;测量菌丝生长速率及分生袍子厚垣袍子的大小 7.6病菌分离物的CR检测 采用cTAB法(见附录C)提取疑似分离物DNA,PCR检测见附录D 7.7测序 PCR扩增结果为阳性,需将PCR扩增产物进行测序比对,以进一步确证是否为尖抱镰刀菌 7.8致病性试验 将在PDA上培养10d的分离物用100ml.无菌水冲洗分生抱子,制成1.0×10个/ml分生袍子 悬浮液,与商业栽培土充分混匀,装人塑料盆中,对照采用清水代替抱子悬浮液接种 将4叶一5叶期 苗龄的健康芹菜苗移植盆中,置于温室(25C28C),每天14h~16h光照,正常淋水管理,接种5周 后检查芹菜植株有无发病,并再次从发病部分离病原菌,观察其形态 鉴定特征 8 8.1培养性状 该病菌在PDA平板上,生长迅速,培养5d后,菌落直径通常4cmm一5em,菌落突起絮状,菌丝由 白色变为淡紫色、淡橙色或米黄色,基物表面淡紫色(参见附录B) 8.2病原特征 菌丝无色透明,具隔膜,气生菌丝有隔,直经1wm~3"m 小型分生抱子单胞;.无色透明,椭圆形 或卵形,大小4.7Mm~7.4Mm×1.5m~3.7m;大型分生袍子镰刀形,较稀少,多数为3个隔膜,顶细 4.8" 胞较尖细,底部具足细胞,大小18.7m~29.6"m×3.7 pm 厚垣袍子间生或顶生,球形,单 Am 个或成对
GB/T36779一2018 8.3致病性试验 接种5周,受侵染的芹菜植株表现生长缓慢,叶片无光泽,变暗淡,叶片失绿或脉间叶肉出现黄绿相 间斑驳,维管束变为褐色至黑褐色,根、根颈部、叶柄变为红色,根部和根茎部腐烂 从发病植株上进行 病菌再分离培养,分离物的培养性状和形态特征与芹菜枯萎病菌相符合 结果判定 若7.2PCR初筛试验结果为阴性,可报告未检出芹菜枯萎病菌;若7.2PCR初筛结果和7.6病菌分 离物的P(CR检测结果为阳性，且获得的分离物在形态学,致病性两个方面符合芹菜枯萎病菌特征,则鉴 定为芹菜枯萎病菌 10样品保存和复核 10.1样品的保存 若鉴定为芹菜枯姜病菌.将获得的分离物转按种于PDA斜面培养基置4笔一8笔保存 标签上应 注明样品编号种名、寄主、产地、制作人和制作时间等 有条件可进行冷冻干燥保存 对已鉴定出带有芹菜枯萎病菌的植物材料,经登记后,要保存在5C一10C及干燥、防鼠防虫处 并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具名称、来源国等,样品需至少保存6个月,以备 复验、谈判和仲裁 保存期满灭活处理 10.2复核 检验结果的复核由国家质量监督检验检疫局指定的单位或人员负责,主要考察实验记录、照片等资 料的完整性和真实性,必要时进行复核实验
GB/T36779一2018 附 录 A 资料性附录 芹菜枯萎病菌基本资料 A.1寄主范围 芹菜枯萎病菌的自然寄主为芹菜(Aiwgrawolensl.). A.2分布地区 北美洲:美国、加拿大 南美洲;阿根廷 亚洲:日本、(广东) 传播方式 A.3 病菌主要通过芹菜苗及其粘附的土壤进行远距离传播 病菌以厚垣袍子在土壤或植株病残体中越 冬,病株根或叶柄的腐烂处在潮湿环境中产生子实体,抱子借气流、雨水、灌溉水的泼溅传播,通过幼根 和叶柄基部或托插苗的伤口侵人为害 A.4危害 芹菜枯萎病菌自然条件下只能侵染芹菜,可引起多种症状 受侵染的芹菜植株表现生长缓慢,叶片 无光泽,叶色变暗淡,严重时叶片失绿或脉间叶肉出现黄绿相间斑驳,脱落,病菌多寄生在根或根颈及叶 柄维管束中,由于菌丝大量繁殖,引起植株营养物质或水分向上运输受到妨碍,从而表现出枯萎症状,甚 至整株枯死 维管束变为褐色至黑褐色,根、根颈部、叶柄变为红色根部和根茎部腐烂 该病潜育期 20d左右,最适宜的发病温度为25C32笔,气温低于7.7C或高于36C则发病轻
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GB/T36779一2018 附 录 规范性附录) 基因组DNA提取方法 C.1种子、病组织、菌丝DNA提取 取适量待检测菌丝、种子或新鲜病组织,置于灭菌研钵中,加人适量液氮,迅速研磨成粉状,将研磨 后的0.1g样品转移至1.5mL离心管中,加人1.2mLDNA抽提缓冲液(2%cTAB,100mmol/LTris HCl,25mmol/LNagEDTA,1.4nmol/LNaCl,2%B筑基乙醇,pH8.0),充分混匀,65C水浴中孵育 min 室温12000r/min离心10min,取上清液700L移至1.5m离心管中,加人5MLRnaseA g0 104g/mL),37C水浴孵育30nmin 加人等体积的三氯甲烧-异戊醇(24:1),颠倒混匀 室温 12000r/min离心10min,取上清液6004L移至另一1.5mL离心管中,加人等体积CTAB沉淀液,混 匀,室温12000r/min离心10min,弃上清液 加人600 L氯化钠(1.2mol/L )室温静置5min,加人 等体积的三氧甲烧-异戊醉(24:1),颠倒混匀 室温12000r/min离心10min,取上清液600L移至 12000 另一1.5m离心管中,加人0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温静置30min r/min离心101 min， 弃上清液 用70%冷乙醉洗涤沉淀2次,无水乙醇洗涤沉淀一次,晾干 加人50LTE缓冲液溶解 DNA沉淀，-20C长期保存 镰刀菌DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒 C.2土壤中病菌DNA的提取 土壤中病菌DNA的提取见SN/T2589,样品在室温下晾干后碾碎过筛,剔除石砾等相关杂质,装 袋后置于4C冰箱保存 土壤总DNA提取方法如下;称取10.0g土样,放人盛有10粒无菌玻璃珠(直 mmolLTris-HCl，100mmol/INaEDTA 径3mm的锥形瓶中,加15mL提取缓冲液(100 200mmol/L.NaCl,1%PVP,2%cTAB.pH8.0) 在180; r/min,37条件下振荡30min,加2ml 20%SDS继续振荡10 min 65C水浴1h后6000r/min离心15min, ,收集上清液,加0.5倍体积 PEG(30%)-NaCI(1.6mol/L),混匀后室温下静止2h,l0000r/min离心20min,沉淀用2mlTE重 新悬浮 加4molL乙酸钠(pH5.4)至终浓度0.3mol/I,用苯酚;三氧甲烧:异戊醉(体积比为25:24 :1)抽提一次,0.6倍体积异丙醇沉淀2h,12000r/min离心20min,沉淀干燥后,200!LTE溶解,置 于一20C保存备用 镰刀菌DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒
GB/T36779一2018 录 附 规范性附录) 尖抱镰刀菌(F4sariwmoxysporwm)PCR检测方法 D.1引物信息 R检测引物根据尖弛罐刀菌色微管重白基因(etwbuim.TUB)序列设计序列见表D1. 表D.1CR引物 目标基因 引物序列 扩增片段大小/bp F1 5'-AGGAGGCCATCGATGTTGTG3 B微管蛋白 650 5'-GTcCATcTCATCTCATGCATcC3 基因(TUB R2 D.2CR反应体系 PCR扩增反应体系为25ML,每个反应分别加人10×PCR缓冲液2.54L,dNTP(10mmol/L ll，上下游引物各！ALcDma/LruDNA聚合俐(sU/L0后L.DNA模板1L最后补允 双猴水至总体积为25AL 用尖他镰刀菌DNA作阳性对照,以非尖袍镰刀菌作为阴性对照,同时设置 空白提取对照和空白对照,每个样品重复3次 D.3PCR反应条件 PCR反应条件为95C预变性5min;30个循环为95C变性30s,60C退火45s、72C延伸 min;最后72C延伸5min,PCR结束后产物于4C冰箱保存 D4电泳分析 取5!L扩增产物与1L的6×上样缓冲液混合均匀,在0.5×TBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝 胶中,4V/cm~6V/em电泳50min,澳化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察,拍照并保存 D.5CR结果判定 阳性对照在650bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性 对照一致的扩增条带,判定结果为尖抱镰刀菌阳性 阳性对照在650bp处出现扩增条带,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品未出现与阳性 对照一致的扩增条带,判定结果为阴性 D.6测序结果 PCR扩增结果为阳性,需将PCR扩增产物进行测序比对,以进一步确证是否为尖徊镰刀菌 芹菜
GB/T36779一2018 枯萎病菌的TUB序列如下 AGGAGGCCATCGATGTTGTGCGACACGAGGTTGAGAACTGTGACCATCTTCAGGGTTT CCAGCTCACCCACTCTCTGGGCGGTGGTACCGGTTCCGGTATGGGAACGCTTCTTCTGTCGA AAATCCGTGAGGAGTTT TGGATTTGCcGCCTTTGACTGGTCG AAGATGCAGGGCTTCCAAC AGAACGTTATGGCTGCTGCTGATTTCCGCAACGGTCGATACCTCACTTGTTCCGCGATTTT GTAAGTTTTGATTTGAAAAGATGCATGAGATGAGATGGAC 0
GB/36779一2018 参考文献 [1]严进,吴品珊.2013.进境植物检疫性有害生物;菌物卷.北京;农业出版社 AwuahR.T.,LorbeerJ.w.,EerbrockL..A.,1986.Oe ofFu [[2] iwsariumydlowsdfcler ccurrence race2inNewYorkanditscontrol.PlantDisease.70 causedbyFusarium orysporw.sp.api 1154-1158. newtoOn [3]CerkauskaR.F.,McDonaldsR.M.,l989.Race2ofFusariumoxysporumf f.p.api tario.PlantDisease73859. [4]CorrellJ.C.,PuhallaJ.E.,SchneiderR.W.1986.IdentifieationofF4sarium orysporwum.f.sp. apionthebasisofcolony size,virulence,andvegetative compatibility[C].Phyopahology,76(4): 396-400. LoriG,A.,WolcanS,M.,IarranS 2008,.FusariumyellowsofcelerycausedbyFusariuum1 [5 o.rysorumf.sp.apiiinArgentina.JournalofPlant Pathoogy. y.90(2):173-178. L6 enorthD.C.,EndoR.M.1985.AbioticfactorsandchlamydosporeformationinFusariumn Opge o.rysorumf.sp.aii[J].TransactionsoftheBritishMycologicalSociety.84(4):740-742. SaidM.,O)rmrodD.J.,1989.FieldsurveyforFusariumyellows(F4sariuo.rysporumf.sp. apii,race2ofceleryinCloverDale,BritishColumbia.CanalianPlanDiseaseSurvey.69:71

芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法GB/T36779-2018

引言

芹菜是一种常见的蔬菜，但其生产过程中常常受到各种病毒和真菌感染的威胁。其中，芹菜枯萎病是一种常见的病害，能够严重影响芹菜的产量和品质。因此，对于芹菜枯萎病菌的检测与鉴定具有极其重要的意义。

GB/T36779-2018标准介绍

GB/T36779-2018是我国针对芹菜枯萎病菌制定的检疫鉴定方法标准。该标准主要包括以下几个方面：

• 样品采集和处理
• 菌种分离和纯化
• PCR扩增和检测
• 检测结果的判定

检测流程

芹菜枯萎病菌的检测流程主要包括以下几个步骤：

1. 样品采集：从疑似感染的芹菜植株中取样，注意避免样品受到污染。
2. 菌种分离和纯化：将样品中的病原体分离出来，并进行纯化处理。
3. PCR扩增和检测：根据GB/T36779-2018标准中的扩增方案进行PCR扩增和检测。
4. 检测结果的判定：根据扩增产物的大小和浓度等情况，结合实验室内对照组的数据，判断样品是否为芹菜枯萎病菌阳性。

应用范围

GB/T36779-2018标准适用于芹菜种子、苗和根茎等材料的芹菜枯萎病菌检测。该方法具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已经被广泛应用于芹菜枯萎病菌的检测与鉴定。

结论

GB/T36779-2018标准为芹菜枯萎病菌的检测和鉴定提供了具有可行性和科学性的方法，其检测流程简单方便、检测结果准确可靠，适用范围广泛。在未来，我们相信该方法将在芹菜生产中发挥越来越重要的作用。

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芹菜枯萎病菌检疫鉴定方法

2022/8/11 22:29:52 现行