甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法

甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T36806一2018 甘蔗杆状病毒实时荧光 PCR检测方法 DeteetionofSugarcanebaeiiformvirusbyreal-timePCR 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36806一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试 中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 本标准主要起草人:高三基、孙生仁,吴小斌,黄美婷、傅华英、王锦达、张慧丽、陈如凯
GB/36806一2018 甘蔗杆状病毒实时荧光 CR检测方法 范围 本标准规定了甘蔗杆状IM病毒(Sugarcanebae eiliformIMirws, ,SCBIMV)和甘蔗杆状MO病 毒(SugarcanebaciliformNMOuirus, ,SCBMOV)实时荧光PCR检测方法的仪器与设备,试剂与材料、 样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等 本标准适用于可能带有sSCBIMV和sCBMOV病毒的活体寄主植物的快速检测、诊断 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ammoniumbromide CTAB:十六烧基三甲基溴化铵cetyltrimethyl C值;实时荧光PCR反应中,每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数(eyele threshold DNase;脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease) EDTA-Na2:乙二胺四乙酸二钠(edetatedisodium FAM;6-梭基荧光素(6-carboxyfluorescein) PCR;聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNase;核糖核酸酶(ribonuclease RT/RNaseH;逆转录酶/核糖核酸酶H(reversetranscriptase/RNaseH SCBIMIV;甘蔗杆状IM病毒(Suga1 baciliformIMirus) rca71e SCBMOV;甘蔗杆状MG病毒(SugarcanebaciiorMOuirus SCBV;甘蔗杆状病毒(Sugarcunebaciliformzirus TAMRA:6-梭基四甲基罗丹明(6-earboxytetramethylIrhodamine Tris-HCl;三羚甲基氨基甲烧盐酸盐[Tris(hydroxymethylaminommethanehydroehloride] 3 甘蔗杆状病毒基本信息 甘蔗杆状病毒属于花椰菜花叶病毒科(Caulimiviridae)杆状DNA病毒属(Badnairus),英文名 称为Sugarcanebaciliformirus,缩写为SCBV 国际病毒分类委员会(IcTV)于2012年将SCBV的 2个分离物正式定为甘蔗杆状IM病毒(SugarcanebacilliformIMirus,SCBIMV)和甘蔗杆状MO病 毒(SugarcanebaciliformMO virus,,sCBMOV)两个不同的种 甘蔗杆状病毒其他信息参见附录A 方法原理 在比对甘蔗杆状病毒基因组序列的基础上,设计一对仅在该病毒RT/RNaseH基因间保守的特异 性引物和一条特异性的荧光双标记TaqMan探针 在实时荧光PCR扩增反应中,TaqMan探针的荧光 信号强度伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系,通过收集PCR扩增过程的荧光信号值,即
GB/T36806一2018 可判断试样是否带有目标序列 5 仪器与设备 nm750nm 5.1实时荧光PCR检测仪:激发/检测波长范围350 ;可用sYBRGreenI染料和 TaqMan探针;升降温速度>2.0/s;均一性十/-0.5C;准确性十/-0,3C;温度范围4C100C 5.2 梳般蛋白分析仪或紫外分光光度计 5.3电子天平;感量0.01g 高速台式冷冻离心机离心力12000g以上 5.4 5.5微量加样器;0.1l一2.5L,0.5AL~10ML、,2AL一20l、10L100AL、,20L一200L 50L~1000AL 5.61.5mL、2.0mL离心管,PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反应管 5.7恒温水浴锅 5.8鼓风干燥箱 5.9冰箱;:2C~4C、一20C、-80C 5.10生物安全柜 5.11采样工具:砍刀、剪刀、毁子,带槽钻子 6 试剂与材料 6.1试剂 除非另有规定外,在分析中仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T6682的二级水指标,其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标 6.1.1无菌水. 6.1.2无水乙醉 6. .1.3异丙醇 6.1.48筑基乙醉 1.570%乙醉 6. G.I RNae膊a0mc/ml) 6.1.7三氧甲烧-异戊醉(24:1. 6.1.8苯-三叙甲烧-异戊醉(25:24:1) 6.1.93molL.醋酸钠(NaAc,pH5.2) 6.1.102×CTAB抽提缓冲液:100nmmol/ITris-HClpH5.0),20nmmol/LE:DTA-Na.,l.4mol/L 氯化钠,2%CTAB,使用前加人0.1%<体积分数)的8硫基乙醇 6.1.11用于检测sCBIMV病毒种引物 5'-引物(IMQF);5'-ACAAAAGGCcTGAATGACAACACA3' 3'-引物(IM-QR):5'-TTGCTACATTTTTCAGTAATGCATTG3' 扩增片段大小;79bp 6.1.12用于检测sCBMOV病毒种引物 5'-引物(MOR-QF);5'-CAGCTCATTGTATGCTGAAAATGC-3' 3'-引物MOR-QR);5'-GTTTGATTTGAAGAGCGGGTTT-3' 扩增片段大小;85bp 6.1.13用于检测sCBIMV病毒种TaqMan探针
GB/36806一2018 IM-QP5'-FAM-CCTGATCAGTACTCACTGCCCGGGA-TAMRA-3' 6.1.14用于检测SCBMOV病毒种TaqMan探针 MoRQP.5'-FAM-TGGAATAcTTTcTTcATccATGGcGAcTTGTAMRA3' 6.1.15荧光PCR反应混合液 包括2×荧光PCR反应液(含TaqDNA聚合酶),5'-引物、3'-引物、TaqMan探针等,具体配制方 法见附录B 6.2材料 6.2.1阳性对照;用已知含甘蔗杆状病毒的甘蔗样品作阳性对照 6.2.2阴性对照:用已知不含甘蔗杆状病毒的甘蔗样品作阴性对照 6.2.3空白对照:用无菌一级水代替样品 样品的采集与前处理 7.1取样工具准备 砍刀、剪刀、辍子、带槽钻子等取样工具应经121C士2C、1.1×10Pa高压灭菌15nmin或经 160C干热灭菌2h 7.2采样方法 7.2.1采样过程中应避免样本交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,每采一个样品后， 采样工具用75%乙醉进行消毒 叶片样品用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(一1叶)叶片,编号备用 7.2.2 7.2.3蔗汁样品;用带槽钻子钻取甘蔗植株上部蔗茎蔗汁1mL于1.5mL离心管,若为甘蔗蔗种,取中 部种茎,编号备用 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2C一8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,要求放置一80C冰箱 但应避免反复冻融 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,或用液氮处理,尽快运送到实 验室 8 检测 8.1蔗叶总DNA的提取 8.1.1蔗叶总DNA的提取应在样品处理区进行 取1.5mL无DNase酶的离心管,并对每个管进行 编号 8.1.2称取0.1g~0.2g蔗叶样品材料,并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干净) 8.1.3向1.5ml离心管中加人粉末,等液氮刚挥发完立即加人600AL预热(约65)的CTAB缓冲 液,充分摇匀 8.1.465C保温60min,每隔15min~20min摇匀1次 8.1.512000！离心10min,弃沉淀,取上清液移至新离心管,加人等体积苯盼-三氯甲烧-异戊醉(25 24;1),剧烈振荡30s 8.1.612000片离心l0min,弃沉淀,取上清液移至新离心管,加人等体积三氯甲炕-异戊醉(24:1)
GB/T36806一2018 剧烈振荡30s 8.1.712000！离心10min,弃沉淀,取上清液移至新离心管 随后先加1/10体积预冷(4C)的 3mol/LNaAc(pH5.2),再加等体积预冷(4C)的异丙醇,将离心管轻轻翻转几次(约5s),一20C放 置20 nmin30min 8.1.812000片离心10min,弃上清液,沉淀用70%乙醉洗涤2次,每次12000片离心lmin,最后用 无水乙醇洗涤1次,并12000片离心lmin 离心管内壁晾干或用灭菌过的滤纸吸干)后,加50L无 菌水溶解 8.1.9加人1L.10mg/mL.的RNase酶,37C水浴1h去除RNA,置一20C保存备用 nm和280nm 处的吸光值A和A 8.1.10使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260" DNA浓度按式(1)计算 c=A0×N×50/1000 式中 -DNA浓度,单位为微克每微升(4g/L); A 260nm处的吸光值; 26o N DNA稀释倍数 当A/A比值在1.8一2.0之间时,适合于实时荧光PCR扩增 8.2蔗汁总DNA提取 8.2.1取1.5mL、2.0mL无DNase酶的离心管,并对每个管进行对应编号 8.2.2取0.5mL 蔗汁于1.5ml离心管中,3000离心5min,取上清液300L移至2.0mL离心 管中 8.2.3加人600L预热(约65C)的cTAB缓冲液,充分摇匀 8.2.465C保温60min,每隔15min一20min摇匀1次 8.2.5加人600L三氯甲烧-异戊醇(24:1)剧烈摇晃30s,12000离心10min. 8.2.6取上清液移至新的1.5mL离心管中,加人等体积三氯甲烧-异戊醇(24:1),轻轻翻转几次(约 5s),12000离心10nmin 8.2.7取上清液移至新的1.5mL离心管,随后先加1/10体积预冷(4C)的3nmol/LNa.Ac(pH5.2) 再加等体积预冷(4C)的异丙醇,将离心管轻轻翻转几次(约5s).-20C放置20min30min 8.2.812000尽离心10min,弃上清液,沉淀用70%和无水乙醇各洗涤一次,每次12000尽离心 lmin 离心管内壁晾干(或用灭菌过的滤纸吸干)后,加30AlL无菌水溶解 8.2.9同8.1.9. 8.2.10同8.1.10 8.3实时荧光CR反应 8.3.1实时荧光PCR反应应在核酸检验区进行 从试剂盒中取出含有TaqDNA聚合酶荧光PCR反 应液,在冰上融化后,2000离心5s 每个测试样本反应体系见附录B 每个反应体系应设置3个平 行反应 8.3.2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,全部加完后,充分混合均匀,2000片离心5s 向 每个实时荧光PCR管中各分装24.0L 8.3.3在各设定的实时荧光PCR管中分别加人模板DNA溶液各1.0L(DNA约100ng),空白对照 加1.0L无菌水代替模板 盖紧管盖后,轻微混匀,500离心30s 8.3.4将8.3.3中加样后的实时荧光PCR反应管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 实时荧 光PCR反应条件随不同仪器略有改变 一般的反应程序为，50它2min,.95C变性10min;95
GB/36806一2018 15s,60 ,40个循环 在每次循环的延伸阶段收集荧光信号 min， 结果判断与表述 g.1结果分析条件设定 实时荧光PCR反应结束后,设置荧光信号囤值,闵值设定原则根据仪器噪音情况进行调整,以闵值 线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准 9.2对照结果 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照 用已知含甘蔗杆状病毒的样品作阳性对照,用 已知不含甘蔗杆状病毒的样品作阴性对照,用等体积的无菌一级水代替模板DNA作空白对照 空白对照,无c'值且无扩增曲线;阴性对照,无C!值且无扩增曲线;阳性对照,Ct值应小于或等于 30.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效,需要查明原因重新检测 g.3检测结果的判定 9.3.1阴性 C值大于或等于40.0,且无典型的扩增曲线,表示样品中不含甘蔗杆状病毒 9.3.2阳性 C值小于或等于35.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中含甘蔗杆状病毒 9.3.3有效原则 Ct值大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线的样本应进行重做检测实验 重复实验的结 果Ct值仍然大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线,则判定样本检测结果为阳性;Ct值大于或 等于40.0,则判定样本检测结果为阴性 9.4结果表述 该试样中检出甘蔗杆状病毒 该试样中未检出甘蔗杆状病毒
GB/T36806一2018 附 录 A 资料性附录) 甘蔗杆状病毒其他信息 病毒粒体形态特征 甘蔗杆状病毒粒体为杆状,大小约(130nm~150nm)×30nm,环状双链DNA,病毒基因组大小约 7.3kb~8.0kb A.2寄主范围 中 自然寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumofficinarum,大茎野生种(Saccharumrobustum、 国种(Sacceharumsinensis)、割手密(S Saccharumsbontaneum)和甘蔗栽培种(Saccharum pp.bybrid 实验寄主包括蔗茅属(Erianth4sMichaux),香蕉、水稻和高粱等 在寄主植株内的分布主要局限于组 织韧皮部内 病害症状 多数情况表现为叶部斑点或斑驳,也有些品种不表现明显症状 发病严重的植株表现叶部褪绿斑 块或各种长度的褪绿条纹,叶片皱缩,茎杆节间出现裂缝,植株束顶矮化等 A.4分布地区 1985年最先报道发生于古巴品种,随后在美国、澳大利亚、南非、法国、印度、等种植甘蔗的国 家或地区都有发生 A.5传播途径 主要通过甘蔗粉鱿(Saccharicoccussacchari)以半持久方式传播 还可以通过感病的无性繁殖材 料(种质)进行传播,但很难通过收获机械传播
GB/36806一2018 附录B 规范性附录 每个测试样本荧光PCR扩增反应体系 每个测试样本荧光PCR扩增反应体系见表B.1 表B.1每个测试样本荧光CR扩增反应体系 试剂 使用量 体系终浓度 2×荧光PCR反应液(含TaqDNA聚合酶 12.5Al 5'-引物(10mol/IL 2.25AL. 0.94mol/L '-引物(10mol/L) 2.25Al 0.94mol/1 荧光探针I0ml/L w.5L 0.25mol/儿 模板DNA 1.0Al 无菌水 补无菌水至25l 注1:PCR反应体系中各种试剂的使用量可根据具体情况进行适当调整 注2，可采用商品化试剂盒进行样本的荧光PCR扩增反应
GB/T36806?2018 []BodhidaM.,LockharBE,Ols szewskiNE.Ananalysisofthe completesequenceofasugar canebacilliform infectioustobananaandrice.JournalofGeneral 1violaegy. ,1993,74Pt 1virusgenome 1),15-22. ofan [2]GeijskesRJ,BraithwaiteKs,DaleJL,HardingRM,SmithGR.Seg equenceanalysis AustralianisolateofSu bugaranebacilliformbadnavirus.Archirves.ofVirology,.2002.,l47(12),2393-2404 [31 MullerE,DupuyV,BlondinL,BauffeF,DaugroisJH,NathalieL,Iskra-Caruan naML.IHigh molecularvariabilityofSugarceanebaciliformvirusesinGuadeloupeimplyingtheexistenceofatleast threenewspecies,VirusResearch ,160(1-2),414-419. R Karuppaiah G.Geneticdiversityofsugarcanebacilliform ViswanathanmR,Kumar virusisolatesinfeetin tingSaccharum1spp.inIndia.VirusGenes,2013,46(3),505-516. [5 Rao ,SinghD,AryaM,SinghP,BaranwalVK.Geneticallydiversevariants ofsugarcanebacilliformvirusinfectingsugarcaneinlndiaandevidenceofanovelrecombinantbadna" Phytopathology,2014,l6211-12),779-787. VIrusVar1ant.Journal 6 SunSR,DamaMB,AlabiOJ,WuXB,MirkovTE,FuHY,ChenRK,GaoSJ. Molecularcharacterizationoftwodivergentvariantsofsugarcanebacilliformvirusesinfectingsugar caneinChina.EuropeanJournalofPlantPathology,2016,l45(2);375-384. WuXB,AlabiOJ,DamaMB,SunSR,MirkovTE,FuHY,ChenRK,GaoSJ.Preva- lenceandRT/RNAseHgenealogyofsugarcanebacilliformvirusisolatesfromChina.JournalofPhy- topathology,2016,l64(9);595-607.

甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法GB/T36806-2018

甘蔗是我国重要的经济作物之一，但甘蔗杆状病毒的感染严重影响着甘蔗生产。因此，快速而准确地检测甘蔗杆状病毒非常重要。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光PCR成为了一种常用的甘蔗杆状病毒检测方法。相比传统的PCR方法，实时荧光PCR具有更高的灵敏度和特异性，可以在较短时间内对样本进行检测。

GB/T36806-2018是我国对甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法进行规范的标准，其中包括了样本采集、RNA提取、cDNA合成、实时荧光PCR反应等多个环节。在具体操作时，需要根据标准要求进行严格操作，确保结果的准确性。

除了实时荧光PCR，目前还有其他检测方法可用于甘蔗杆状病毒检测，如RT-PCR、ELISA等。不同的检测方法有其各自的优缺点，在具体选择时需要综合考虑。

总之，甘蔗杆状病毒实时荧光PCR检测方法GB/T36806-2018是一种快速、准确、可靠的检测方法，在甘蔗杆状病毒的防治中具有重要意义。

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