日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法

日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法

国家标准 GB/T22333一2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 Reversetranseriptionpolymerasechainreactionfor JapaneseBencephalitisvirus 2008-08-22发布 2008-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22333一2008 前 言 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心 本标准主要起草人:王宏伟、孙明、王传彬陈西钊、田克恭
GB/T22333一2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 范围 本标准规定了日本乙型脑炎病毒核酸的反转录聚合酶链反应试验的技术要求 本标准适用于动物脑组织中日本乙型脑炎病毒核酸的检测 试剂 2.1变性液(见第A.1章). 2.22mol/L乙酸钠溶液(pH4.0). 2.3酚-三氯甲烧-异戊醇混合液(见第A.2章). 2.42.5mmol/L.dNTP 2.58mmol/儿上下游引物混合液(引物序列见第A.3章) 2.610倍PCR缓冲液 2.71%溴化乙锭(EB)溶液 2.8TAE电泳缓冲液 2.91%琼脂糖凝胶 2.10上样缓冲液(见第A.4章) 2.11其他试剂10U/L.AMV反转录酶、10obpDNA分子质量标准物、,50U/LRNA酶抑制剂、 5U/aLTaqDNA聚合酶、异丙醉、75%乙醇溶液、25mmol/几氯化镁溶液、DEPC处理过的无菌双 燕水 实验室条件 3.1实验室级别要求 实验室必须为生物安全川级(IBSL-3级)实验室 3.2实验室分区 RT-PCR试验区域分反应液配制区(配液区)、核酸提取区、扩增区、电泳区 流程顺序为配液区- 核酸提取区-一扩增区-一电泳区 严禁器材和试剂倒流 3.3实验室应配备的仪器及耗材 仪器;分析天平、高速离心机、真空干燥器、,PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽,紫外凝胶成像仪(或紫 3.3.1 外分析仪)液氨罐或一70C冰箱、微波炉、组织研磨器、一20C冰箱、水浴锅、可调移液器(最大量程分 别为2l.,30L.300All00L 耗材;眼科剪、,眼科锻、称量纸、10ml一次性注射器、1.5mL灭菌离心管,0.2mL薄壁PCR 3.3.2 管、琼脂糖、500ml量筒、500ml锥形瓶、吸头(10l200Al、l000AL),灭菌双蒸水 操作程序 4.1样品的采集及处理 4.1.1样品的采集;濒死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织 4.1.2样品的处理:每份样品分别处理
GB/T22333一2008 4.1.2.1组织样品处理;取待检脑组织病料约0.05g置研磨器中剪碎并研磨,加人400L变性液继 续研磨 取已研磨好的待检病料上清200L,置1.5ml.灭菌离心管中,加人200L变性液,混匀 4.1.2.2阳性对照处理:取日本乙型脑炎病毒弱毒疫苗200AL,置1.5ml灭菌离心管中,加人200 心 变性液,混匀 4.1.2.3阴性对照处理:取健康猪血清200l,置1.5ml灭菌离心管中,加人200L变性液,混匀 4.2病毒RNA的提取 取已处理的待检样品及阴性、阳性对照样品,每管依次加人乙酸钠溶液30l,阶-三氯甲烧-异 戊醇混合液300L,颠倒10次混匀,冰浴15min,4C13000g离心15 min 4.2.2取上清300l置于新的经DEPC水处理过的1.5ml灭菌离心管中,加人等体积异丙醇,混 匀,置液氮中3min或一70C冰箱中30min 取出样品管,室温融化,将离心管开口侧朝离心机转轴方 向放人离心机内,4c2000离心20min. 4.2.3弃上清,沿离心管开口方向管壁缓缓滴人一20C预冷的75%乙醉1nml,轻轻旋转洗一次后倒 掉,将离心管倒扣于吸水纸上min,真空抽干15min 4.2.4用10L无RNA酶的灭菌双蒸水和lL.RNA酶抑制剂沿离心管开口侧相反方向溶解沉淀 20C储存备用 RT-PCR反应液组成总体积25uL DEPC水 13.8l 2.5mmol/LdNTP 2.5Al mmol/L上下游引物混合液 8 1.5pl 25nmmol/儿氯化镁溶液 1.2 叫l 10倍PCR缓冲液 2.5山 AMV反转录酶 0.2L RNA酶抑制剂 3L. 0.3 5U/LTaqDNA聚合酶 1L 提取的RNA 2l R-PCR反应程序 42c45min,95C3min;扩增条件为95C30s50C40s72C40s,35个循环后,72C延伸 10min 4.5电泳 将PCR扩增产物15l与3l上样缓冲液混合,加样于1%琼脂糖凝胶孔中,琼脂糖凝胶板一侧 点样孔加人100bpDNA分子质量标准物,以5V/em电压电泳40min,用紫外凝胶成像仪观察结果 结果判定 当阳性对照出现375bp扩增带,阴性对照未出现目的带时,实验结果成立 被检样品出现375bp 扩增带为日本乙型脑炎病毒阳性,未出现相应扩增带的样品判为阴性
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