M-MLV反转录酶

M-MLV反转录酶

国家标准 GB/T36757一2018 M-MLV反转录酶 M-MLVreversetranseriptase 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36757一2018 目 次 前言 引言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 技术要求 5 检验方法 包装、运输及贮存 保质期 附录A规范性附录M-MIV反转录酶酶活力检测 附录B规范性附录核酸外切酶检测 附录C规范性附录核酸内切酶检测
GB/36757一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口 本标准起草单位:科学院微生物研究所、厦门致善生物科技股份有限公司,福建华灿制药有限 公司、福建南生科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、上海博仕生物医学服务中心、北京化工大学 本标准主要起草人:李晶、宋娜杰、黄发灿、刘文军、詹学雄、郑登忠,李庆阁、赵晶,章丽丽,姚鹃、 邢志刚、陈劲春
GB/T36757一2018 引 言 MMLV反转录酶(MMLVReerseTransecriptase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成 互补DNAcDNA)的酶,可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针,RRNA转录、测序和RNA的逆转 录反应 制定M-MLV反转录酶国家标准,用以推动该类工具酶的产业化,对于M-MLV反转录酶的 生产和使用具有重要意义 IN
GB/36757一2018 M-MLV反转录酶 范围 本标准规定了MMLV反转录酶的技术要求、检验方法,包装,运输和贮存 本标准适用于通过基因重组表达中提取的M-MIV反转录酶 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T191包装储运图示标志 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 MH-MV反转录酶MH-MVreversetranscriptase 以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNAcDNA)的酶 3.2 MF-MLV反转录酶活性单位activityunitor-\MLVreversetranseriptase 以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物,在37C,18.67min内,将0.105nmol脱氧核苷酸 聚合成双链DNA中所需的酶量为50活力单位 技术要求 4.1外观 澄清透明的液体,无沉淀 4.2酶活力 >200U/L 4.3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶 检验方法 5.1外观 直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察
GB/T36757一2018 5.2酶活力 依据附录A的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1核酸外切酶 依据附录B的方法进行检测 5.3.2核酸内切酶 依据附录C的方法进行检测 6 包装运输及贮存 6.1包装 内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏 外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定 6.2运输 产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨,防晒设施,运输过程中应做好盼 护措施避免倒置及破损 不宜与有毒、有害、有异味物品混运 6.3贮存 应在温度低于一20C的条件下储存 保质期 在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为三年;超过保质期,使用前应检测酶 活力
GB/36757一2018 录 附 A 规范性附录 M-MLV反转录酶酶活力检测 A.1仪器设备 荧光PCR仪 A.2试剂 A.2.1发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为 cCGGCCGCGGGAGCA-3 5' -aggaaeatgtgactaateeTGcTccccGcGcccGt atctgc A.2.2dNTP 注:dGTP:;三磷酸鸟噪岭脱氧核苷酸;dATP:三磷酸腺喋吟脱氧核苷酸;dTTP:三磷酸胸腺嗜脱氧核苷酸 dcTP;三磷酸胞喘吭脱氧核苷酸 dNTP三磷酸碱基脱氧核背酸，包括dGTP,dATP,drTP,dcTP 包括 dCTP、dATP、dTTP,dGTP A.2.3荧光核酸染料 A.2.4LamdaDNA标准品 A.3试剂溶液配制 A.3.11×TE溶液;10mmol/几Tris-HCl,lmmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液,pH8.5(25C) A.3.2 PCR缓冲液:500mmol/L.Tris-HCI,750mmol/L 氧化钾溶液,100mmol/L DTT,pH8.5 25 A.3.3LambdaDNA预染液:以8.5AL:1!L:0.5L的比例分别量取纯化水、10×PCR缓冲液和荧 光核酸染料加人离心管,在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒,储存于2C~ A.3.4氯化镁溶液:25mmol/L A.3.5酶稀释缓冲液;10mmol/几LTris-HC,0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液,1mmol/LDTT， 50%(体积分数)甘油,pH8.0(25C A.3.6T2溶液:将发夹型寡核苷酸序列(T2)干粉按照合成单上的说明稀释到100mol/L,储存于 -20C 使用时从一20C取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒 A.3.7dNTP混合液;将dNTP中的dCTP,dATP,dTTP,dGTP等体积进行混合,于漩涡混匀器上混 匀10s,在微型离心机上离心数秒,配制成浓度为25mmol/L的dNTP混合液 A.3.8l.ambdaDNA标准品;使用1×TE溶液将L.ambdaDNA标准品进行4倍连续梯度稀释,得到 /ml,25g/ml12.5"g/mL.,6.254&/ml,3.1254g/ml.l.56254g/ml和0.78125"g/mL的 100 "g 8个浓度梯度溶液,以相同体积的1×TE溶液作为背景对照 各梯度溶液和背景对照分别加人等体积 的预染液,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒,以20L/管分装于PCR八联管内,每 个梯度3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用
GB/T36757一2018 A.3.9M-MLV反转录酶梯度稀释溶液;根据标定的酶比活力,使用酶稀释缓冲液对M-MLV反转录 酶进行适当稀释(如标定浓度为200U/L,则可2倍稀释,得到2×、4×的梯度稀释液) 该步骤需在 冰上进行 A.4实验步骤 A.4.1聚合反应液的配制与分装 A.4.1.1在微量离心管中按照表A.1的比例配制聚合反应液(冰上配制),聚合反应液配制完成后,在 漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒 配制总体积计算见式(A.l) (A.1 V=[3×(n+1)+1]×V 式中 V 总体积,单位为微升(L); 重复次数; -M-MIV反转录酶的稀释梯度数; 前 一个1表示空白对照数;后一个1表示预留损失数量 表示！个反应用量,见表A.1,单位为微升(nL) V 表A.1聚合反应液配比 聚合反应液组分 规格 1个反应用量/L 14.8 PCR缓冲液 10X 氧化镁溶液 25mmol/1I T2溶液 1004mol/I 0.1 dNTP混合液 25mmol/L 0.2 荧光核酸染料 0,5 A.4.1.2将A.4.1.1中的聚合反应液平均分装到n个(n为M-MLV反转录酶的稀释梯度数)微量离心 管中,分别加人1.2AL的各浓度梯度的M-MILV反转录酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液). 在漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒 各管混合液以20L/管,分装于PCR八联管内,每 管混合液3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用 A.4.2运行程序 在荧光PcR仪上设置如下温度程序 37C16s 荧光采集通道:SYBR 120个循环 将装有LambdaDNA标准品和聚合反应液的PCR八联管置于荧光PCR仪中,启动温度程序,开 始聚合反应
GB/36757一2018 A.5数据分析 A.5.1L.ambdaDNA标准曲线的制作 使用荧光PCR仪的软件打开数据,导出文件,按以下步骤进行,按式(A.2)计算 选取数据文件中L.ambdaDNA标准品和背景对照的第25个循环的荧光值,并计算平均荧 a 光值 b 将各梯度IambdaDNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值,得到净荧光值 计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差sD. 以LambdaDNA标准品DNA量(ng)为X轴,以各梯度净荧光值的平均值为Y轴,标准偏差 d SD为错误值进行多项式拟合分析,制作工作曲线,从中获得净荧光值与双链DNA浓度的关 系曲线如下,R'>0.98 y=A十B.x A.2 式中: A 线性方程拟合曲线的截距; B 线性方程拟合曲线的斜率; -荧光值; 双链DNA的量,单位为纳克(ng). A.5.2聚合反应新生成的双链DNA量的计算 选取Excel文件中待检M-MLV反转录酶的第70个循环的荧光数据 首先计算空白对照3个重 复的平均荧光值,将各梯度M-MLV反转录酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值,得到净荧光值,计 算各梯度净荧光值的平均值(yi) 将各净荧光值代人式(A.2)计算聚合反应新生成的双链DNA量 .工 A.5.3M-MLV反转录酶梯度条件下的dINIP消耗量计算 M-MLV反转录酶梯度条件下的dNTP消耗量以y表示,单位为nmol,按式A.3)计算 A.3 y2= 2324.5 式中: 新生成的双链DNA量,单位为纳克(ng); .' -双链DNA由2条单链DNA组成 324.5 -dNTP的相对平均分子质量 A.5.4M-MV反转录酶活力计算 根据3.2M-MIV反转录酶活性单位定义,M-MIV反转录酶酶活力以s表示,单位为U/l 选 择在0,014nmol0.196nmol范围内的dNTP消耗量按照式A.4)计算 y十0,045×D (A.4 O.0012
GB/T36757一2018 式中 dNTP消耗量,单位为纳摩尔(nmol). y" D -酶的稀释倍数
GB/36757一2018 附录B 规范性附录) 核酸外切酶检测 B.1原理 由于BamHI切开DNA双链产生一对黏性末端,其各有5个碱基失去互补碱基形成突出单链,它 易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端;如果将此DNA连接后再用BamHI酶切,结果 是无法切开 如果该位点是在外显子区或编码区,即意味其对应的氨基酸序列发生变化,乃至某些生物 性状发生改变 例如质粒pBR322所含BatmH1识别位点是在其抗四环素基因上,如果使用被核酸外 切酶污染的样品BamH1过量长时程切割pBR322,然后再连接闭环后重新转化受体菌,该菌在含四环 素培养基上无法生长,而没有这样酶切的pBR322转化菌能够生长 又如质粒pUc19所含BamH!位 点居于编码l.ac乙的a互补肽上,若发生前述状况,就会导致该肽链的氨基酸序列变化,最终在含异丙 基硫代半乳糖苷(IPTG)和g半乳糖苷酶的LB培养基上由原本是蓝斑变成白斑 如果白斑数目占到 总菌斑数的10%以上,就判定该样品已有核酸外切酶污染 B.2 仪器和设备 B.2.1 恒温水浴槽 B.2.2台式离心机 B.2.3超净工作台 B.2.4恒温培养箱 B.3材料 B.3.1高纯ccCpUC19DNA B.3.2T4DNA连接酶 B.3.310×T4DNA连接酶缓冲液500mmol/几Tris-HCl缓冲液(pH7.8).100mmol/I Mg 10mmol/L.ATP,100mmol/IDTT B培养液 B.3.4 B.3.5氯仿-异戊醇(24:1,体积比) B.3.6大肠杆菌DH5a(感受态》. B平板[含已半乳糖苷酶,异丙基碗代半乳糖苷(IPTG),氨节青霉素] B.3.7 B,4实验步骤 B.4.1长时程过量酶切 取104g高纯CCCpUC19DNA置于一只微量离心管中,加人20AL10×BamHI缓冲液和 150AL水,充分混匀后平均分成A和B两管;A管加人5ALBamHI50U100U)和5L水,达总 体积100AL;B管加人5lL IBatmHI(50U~100U)和5AlL M-MLV反转录酶(1g/"L) 混匀后置
GB/T36757一2018 于37C水浴槽,lh后各取出40L,其中20ML(标记A1号和B1号)待电泳检测,另20L(标记 A2号和B2号)待连接及蓝白斑计数;所剩60L继续酶切达10h以上,又将它各均分为3管,分别标 记A3、B3、A4、B4、A5,B5号 B.4.2电泳 B.4.2.1取出A1,B1,A3,B3号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 B4.2.21.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm~10V/cm ,当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝 胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 B.4.3连接 B.4.3.1回收DNA 取出A2.B2,A4,B4、A5.B5号管,各加人20L氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真 空干燥样品 B.43.2连接反应 每管加人2L10×T4DNA连接酶缓冲液,2UT！DNA连接酶,加人水达总体积20L.混匀后 置于15C水浴槽8h B.4.3.3转化与铺板 B.4.3.3.1将感受态菌液加人含连接处理过的DNA微量离心管内,轻混,置于4C冰浴槽0.5h以上 B.4.3.3.2将上述6只微量离心管移到42C水浴中热击2nmin,迅即取出再置于！C冰浴槽0.5h 以上 B.4.3.3.3向上述6只微量离心管各加人1mLLB培养液,轻混,置于37C水浴槽1h. B.4.3.3.4将18块固态LB板,分别标上A2,B2,A4,B4,A5,B5号,每号均有3块板;在超净工作台铺 板,每板加人上述菌液200AL;待板上菌液不会流动时,翻转平板,置于37C恒温培养箱8h以上 B.43.3.5计算每块板蓝白斑数量,再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比 B.5结果判定 在电泳板上,A1、B1、A3、B3号的谱带没有明显差异,说明长时程过量酶处理对DNA没有造成额 外的切割 B2,B4,B5号和A2,A4、A5号的白斑总数与其蓝斑总数相比,若比值小于1/9,则判定样品 不含核酸外切酶;若比值大于或等于1/9,则判定样品含有核酸外切酶
GB/36757一2018 录 附 C 规范性附录 核酸内切酶检测 原理 C.1 pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致 C.2仪器 C.2.1电泳仪,备电泳槽 C.2.2分析天平(万分之 C.2.3紫外透光分析仪 c.3实验步骤 C.3.1 pUc19质粒反应 C3.1.1在测试管里先后加人4AL.pUC19质粒DNA(14g/L),14AL.水、2AlL酶,振荡器混匀,水浴 lh C3.1.2在对照管里先后加人4"LpUC19质粒DNA(1"g/AL),16AL.水,振荡器混匀,水浴1h C.3.2电泳 1%1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/cm10V/cm, ,当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.4结果判定 在电泳板上,肉眼观察 若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含有内切酶;若不一致,则 判定样品中含有内切酶