用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求

用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求

国家标准 GB/T40664一2021 用于高通量测序的核酸类样本 质量控制通用要求 Generalrequirementsforhigh-throughputsequeneing teehnologiesofdeteetingnueleieacidsamples 2021-10-11发布 2022-05-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/T40664一2021 目 次 前言 引言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 # 普# 质量控制要求 4.1通用要求 4.2基因组DNA核酸类样本质量要求 4.3总RNA核酸类样本质量要求 质量检测方法 主要设备和仪器 5.l 5.2核酸类样本质量检测方法 附录A(资料性核酸类样本完整性检测示例图
GB/T40664一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国生物样本标准化技术委员会(SAC/TC559)提出并归口 本文件起草单位;深圳华大生命科学研究院、计量科学研究院、深圳华大智造科技股份有限公 司、青岛华大基因研究院、深圳华大基因股份有限公司、上海生物芯片有限公司、广州中医药大学第二附 属医院(广东省中医院),湖北国际旅行卫生保健中心武汉海关口岸门诊部) 本文件主要起草人;祝珍珍、王晶,苏小珊、耿春雨、李倩一,陈芳、刘心,谢泽宇、陈利、牛春艳、黄翔、 张小燕、许靖曼、陈曲波、龚睿、王鹏、周艳、孙静、曾漩
GB/T40664一2021 引 言 随着高通量测序技术的不断发展和广泛应用,越来越多种类的核酸样本被用于高通量测序,从而在 DNA和RNA的分子水平来揭示不同物种间核酸序列的差异以及特定生物学过程和疾病发生过程中 的分子机理 由于核酸样本的质量会对高通量测序的数据结果产生直接影响,因此制定用于高通量测 序的核酸类样本质量控制的通用要求就显得尤为紧迫和重要,从而保证高通量测序的核酸样本具备达 标的质量,进而得到可靠的测序数据,避免信息错误和信息丢失等情况的出现 本文件是基于高通量测序技术应用和验证数据而制定,规定了多种高通量测序类型的核酸样本准 人要求,从而提高测序的成功率及准确性,对于规范整个高通量测序市场起到了重要作用 IN
GB/T40664一2021 用于高通量测序的核酸类样本 质量控制通用要求 范围 本文件规定了用于高通量测序的基因组DNA以及总RNA核酸类样本的质量控制通用要求,包括 样本检测的术语和定义、质量控制要求、质量检测方法 本文件适用于从新鲜血液、唾液、动植物组织、细胞培养液以及菌液等样本中提取的真核生物和原 核生物的基因组DNA和总RNA样本 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB/T30989高通量基因测序技术规程 GB/T35537高通量基因测序结果评价要求 GB/T37864生物样本库质量和能力通用要求 术语和定义 GB/T30989和GB/T35537界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 脱氧核糖核酸deoxyribouecleicaeid;DNA 带有遗传信息的生物大分子 由四种主要的脱氧核苷酸(脱氧单磷酸腺喂岭dAMP,脱氧单磷酸 鸟嗯怜dGMP,脱氧单磷酸胞嗜髋dCMP和脱氧单磷酸胸腺嗜dTMP)通过3',5'-磷酸二酯键连接 而成 注，它们的组成和排列不同,显示出不同的生物功能,如;编码功能,复制和转录的调控功能等 3.2 核糖核酸ribonueleieaeid;NA 核酸的一类 由核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的多聚体 注不同种类的RNA链长不同,行使各式各样的生物功能,如与蛋白质生物合成有关的RNA有信使RNA(n mes- sengerRNA，mRNA)、转运RNA(transferRNA,tRNA)和核糖体RNAribosomeRNA,rRNA);与转录后加 工有关的RNA有核小RNA(smallnlearRNA.nRNA).核仁小RA(smalnelelrRNA.oRNA)与 生物调控有关的RNA有微RNAmieroRNAs,miRNA、干扰小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等 3.3 核糖体RNAribosomeRNA;rRNA 生物细胞中主要的核糖核酸之一,是一种具有催化能力的核糖酶 注:其单独存在时不能如其他核糖核酸那样发挥作用,仅在与多种核糖体蛋白质共同构成核糖体(一种无膜细胞 器)后才能执行其功能,是含量最高的一种RNA 原核生物的核糖体所含的RNA有5S,.l6S及23s三种 真
GB/T40664一202 核生物有4种rRNA,它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S 3.4 凝胶电泳 gelelectrophoresis;GE -种简便高效的分离和纯化DNA片段的方法 注由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动 在一定的电场强度 下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,常用的分子筛有琼脂糖凝胶和聚丙烯肤胶凝胶等 具有不同的 相对分子质量的DNA在分子筛中泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离 在电泳过程中 可以通过将样品和示踪染料或相对分子质量标准参照物一起进行电泳而得到检测 通常包括自配制及商业化 预制胶凝胶电泳 3.5 微流控分析mitcrlwdiesteehmolughaselanalysis 使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到微升)的系统所涉及的科 学和技术 3.6 RNA完整性分数RNAintegrityscore;RIS RNA RNA完整值 integritynumber;RIN(RIN) RNA质量分数RNAqualitysore;RQs 反映RNA完整性的数值 注:对RNA进行自动化电泳或微流控分析,其结果中28S和18S(或23S和16S)条带对应的RNA条带峰面积体现 RNA完整性，RIS/RIN(RIN"/RQS值均为l10,数值越大表明RNA完整性越好 3.7 沉降系数 sedimentationcoeffieient 表示颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率 注一般用、表示,x=u/a,其中d为重力加速度或离心加迷度,为沉降速度,即沉降系数为每单位离心力场的沉 降速度,可间接反映相对分子质量大小 3.8 高通量基因测序 high-througputgenesequencing 高通量测序high-throughputsequeneing 区别于传统双脱氧(Sanger)测序,一种能够 一次并行对大量核服外子进行平行修列渊定的技术.通 常 -次测序反应能产出不低于100Mb的测序数据 [来源:GB/T309892014,3.19,有修改] 3.9 碱基测序准确率 sequeneingaccuracy 对已知序列的参考品进行测序,经过碱基识别后比对到已知序列上,统计比对正确的碱基数占测序 获得的总碱基数比例 [来源:GB/T35537一2017,3.1.4打 质量控制要求 4.1通用要求 4.1.1用于高通量测序的核酸类样本应根据GB/T35537中的碱基测序准确率的要求进行质量控制 4.1.2生物样本及相关数据的使用应遵守区域、国家和国际的伦理规范
GB/T40664一2021 4.1.3生物样本的前处理过程、获取、保存、销毁、运输等操作应符合GB/T37864的要求 4.1.4样本质量要求应通过完整性和样本浓度确定 4.2基因组DNA核酸类样本质量要求 4.2.1基因组DNA完整性 基因组DNA是组成生物基因组的所有DNA 其完整性应符合凝胶电泳主带单一,在23kb左右 有清晰条带,且样本无严重降解 如主带不清晰,弥散现象严重则为严重降解 完整性检测图谱见附录 A中A.1 4.2.2基因组DNA样本浓度 单位体积的液体里含核酸的量,可使用质量浓度(ng/AL)表示 基因组DNA浓度低于0.5ng/Ml 时仪器检测精度不够且影响文库构建的成功率,不同文库构建类型和不同高通量测序仪对样本浓度要 求不同,样本浓度应大于0.5ng/L 4.3总RNA核酸类样本质量要求 4.3.1总RNA完整性 总RNA是从基因组转录出来的所有转录产物 包括信使RNA,核糖体RNA及一些与转录调控 转录后加工及转录后翻译有关的非编码RNA 可通过总RNA的检测确定RNA的完整性 RRNA样本的完整性宜通过微流控或自动化凝胶电泳分析总RNA的RIN值以及rRRNA的28S 18S或23S/16S比值进行判断(其中原核生物应使用23S/16S数值进行判断,真核生物应使用28s/18S 数值进行判断),真核生物又分为人、动物,植物、真菌和昆虫这三类作不同要求 不同物种的总RNA 完整性要求见表1 微流控分析检测图谱见A.2A.5 表1总RNA样本质量要求 样本类型 完整性要求 人,动物(不含 原核生物总RNA 植物、真菌总RNA 昆虫总RNA 昆虫)总RNA 值 RIN 23s/16S0.8 28s/18S0.8 28S/18S0.8 23s/16S或28s/18s 18s主带清晰 基线呈直线 基线呈直线 微流控检测图谱基线 基线呈直纱 基线呈直线 4.3.2总RNA核酸类样本浓度 总RNA样本浓度低于1ng/pL时仪器检测精度不够且影响RNA文库构建的成功率,不同文库构 建类型和不同高通量测序仪对样本浓度有不同要求,样本浓度应大于1ng/"L 质量检测方法 5.1主要设备和仪器 5.1.1凝胶电泳仪 琼脂糖凝胶电泳相关设备及仪器 5.1.2微流控电泳分析仪
GB/T40664一202 5.1.3定量荧光计;可配合荧光染料检测试剂快速完成核酸浓度的读取,最低应能检测0.2ng/L的核 酸样本 5.2核酸类样本质量检测方法 5.2.1基因组DNA核酸类样本的检测方法 采用凝胶电泳法检测DNA核酸样本的完整性,宜使用1%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳,电压 120V,电泳时间30min;采用荧光染料法进行核酸浓度的检测,按照对应的荧光染料检测试剂流程进 行操作 5.2.2总RNA核酸类样本的检测方法 采用微流控电泳或自动化凝胶电泳分析法检测总RNA核酸样本的完整性,具体操作参考微流控 电泳或自动化凝胶电泳的操作说明;常规样本宜采用荧光染料法进行总RNA浓度的检测,微量样本宜 采用微流控电泳或自动化凝胶电泳分析法检测总RNA的浓度
GB/T40664一2021 附 录 A 资料性) 核酸类样本完整性检测示例图 A.1基因组DNA样本完整性检测 凝胶电泳检测基因组DNA样本完整性结果见图A.1 泳道2、泳道3的样本降解严重,高通量测 序结果碱基测序准确率低于99% M M2 bp bp 40000 23130 000 " 000 9416 6557 4361 4072 3054 部 2036 1636 1018 说明: M -marker,参照标准,用于指示核酸分子大小的一系列核酸分子; -asepair,碱基对,用于表示DNA核酸类样本分子大小的单位 p 注1:泳道l、4,5,6、7,8,9;样本DNA在23kb左右主带清晰,无严重降解现象 注2沫道2.泳道3.样本DNA主带不清晰,有弥散,降解严重 图A.1凝胶电泳检测结果 A..2原核总RNA样本完整性检测 微流控电泳检测原核总RNA样本完整性结果见图A.2 注RIN>7,23s/16S>1,图谱基线呈直线
GB/T40664一202 [FU 30 20- 10- 25 2001000 4000 ml Ecoli711 oeallResulsforsample10: RNAArea 201.8 RNAConcentration 403ng rRNARatio[23S/16S] 1.2 RNAIntegrityNumber(RIN) 7.9[B.02.07.AnomalyThresholds)manualyadaptel 说明 FU -荧光单位,荧光的大小反映了核酸类样本的浓度; -核苷酸,用于表示RNA核酸类样本分子大小的单位 nt 样本10的总结果; OverallResultsforsample10 Ecoli71 -样本名称,可以自主设置,若没有设置,此处会显示samplel0 RNAArea -RNA的面积,指图中峰型覆盖的总面积; RNAConcentration RNA的浓度; rRNARatio[23s/16s 23S和16S的RNA比值 仪器自己计算出的一个数值.代表了RNA的完整性 RNAIntegrityNumber(RIN 图A.2原核样本微流控电泳检测结果 植物总RNA样本完整性检测 A.3 微流控电泳检测植物总RNA样本完整性结果见图A.3 注:RIN>6,28S/18S>1,图谱基线呈直线
GB/T40664一2021 [FU 10 28s 200 000 4000 25 Intl A62 OyerallResultsforsample8: RNAArea 90.2 RNAConcentration 0ng/L rRNARatio[28S/18S 1.0 6.8(B.02.07 RRNAintegrityNumber(RIN 说明 Fu 荧光单位,荧光的大小反映了核酸类样本的浓度; 核苷酸,用于表示RNA核酸类样本分子大小的单位; nt OverallResultsforsample8 样本8的总结果 样本名称,可以自主设置,若没有设置,此处会显示sample8 A62 RNAArea RNA的面积,指图中峰型覆盖的总面积 -RNA的浓度; RNAConcentration RNARatio[28S/18S 28S和18S的rRNA比值; RNA hntegrityNumber(RIN) 仪器自己计算出的一个数值,代表了RNA的完整性 图A.3植物样本微流控电泳检测结果 A.4昆虫总RNA样本完整性检测 微流控电泳检测昆虫总RNA样本完整性结果见图A.4 注:18S主带清晰,图谐基线呈直线
GB/T40664一2021 [FU 80 60 40 20 18S28S 50 40 [ 20253035 5560 65 L- OerallResultsforsample8: RNAArea 298.0 RNAConcentration: 244g rRNARato[28s18s1 0.1 NA(B.02.07) RNAintegrityNumber(RIN 说明 FU -荧光单位,荧光的大小反映了核酸类样本的浓度; 秒,表示RNA电泳迁移的时间; 样本8的总结果; OverallResultsforsample8 -样本名称,可以自主设置,若没有设置,此处会显示sample8; Ld一1 -RNA的面积,指图中峰型覆盖的总面积; RNAArea RNAConcentrationm RNA的浓度; rRNARatio[28S/18S 8S和18S的rRNA比值 RNAIntegrityNumber(RIN 仪器自己计算出的一个数值,代表了RNA的完整性 昆虫样本没有此数值,所 以显示N/A 图A.4昆虫样本微流控电泳检测结果 A.5动物总RNA样本完整性检测 微流控电泳检测动物总RNA样本完整性结果见图A.5. 注:RIN>7,28s/18s>1,图谱基线呈直线
GB/T40664一2021 [FU] 40 20 28S nt 25 200 1000 4000 HBRR-L1 OverallResultsforsample3: RNAArea 345.5 RNAConcenation. 228ng rRNARatio[28S18SL 1.3 RNAInlegrityNumber(RIN) 7.5(B02.07) 说明 FU 荧光单位,荧光的大小反映了核酸类样本的浓度 -核酸,用于表示RNA核酸类样本分子大小的单位; nt OverallResultsforsample3 样本3的总结果; HBRR-LI -样本名称,可以自主设置,若没有设置,此处会显示sample3 RNAArea1 -RNA的而积,指图中峰型覆盖的总面积 RNAConeentration -RNA的浓度; rRNARatio[28S/18S] 28S和18S的rRNA比值; RI) RNAIntegrityNumber( 仪器自己计算出的一个数值,代表了RNA的完整性 图A.5动物样本微流控电泳检测结果

GB/T40664-2021：用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求

高通量测序技术的广泛应用为生命科学领域带来了许多重大突破。然而，在进行高通量测序之前，必须对核酸类样本进行质量控制，以确保其适合进行高通量测序分析。

GB/T40664-2021中规定了一系列核酸类样本质量控制的通用要求。其中包括以下几个方面：

• 检测DNA/RNA的纯度：通过比例计算样品中的DNA或RNA与其他杂质（如蛋白质、盐）的相对含量，以确保样品中核酸的纯度达到要求。
• 检测DNA/RNA的完整性：用琼脂糖凝胶电泳等方法检测样品中DNA或RNA的大小、形状和完整性，以确保样品中核酸的分子量符合要求。
• 检测DNA/RNA的浓度：通过比色法、荧光定量等方法测定样品中核酸的浓度，以确保样品中核酸的浓度达到要求。
• 检测PCR抑制物：通过引物扩增实验检测样品中是否存在PCR抑制物质。
• 样本处理：包括采集、储存、运输和保存等环节，要求对样本进行正确处理，以确保样品的质量稳定性。

上述质量控制要求的具体操作方法和标准均在GB/T40664-2021中详细规定。专业人士可根据该标准制定相应的操作流程，以确保样品质量的可靠性和稳定性。

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