国家标准 GB/T35541一2017 pfDNA聚合酶 pfuDNApolymerase 2017-12-29发布 2018-07-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/35541一2017 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口本标准起草单位:厦门致善生物科技股份有限公司、福建华灿制药有限公司、福建南生科技有限公司、深圳华因康基因科技有限公司、华灿南生(厦门)生物技术有限公司、科学院微生物研究所、厦门大学北京化工大学,山东大学,复旦大学,海狸纳米科技(苏州)有限公司、上海博仕生物科技有限公司、安琪酵母股份有限公司、农业大学、福建农林大学、上海百赛生物科技有限公司本标准主要起草人;宋娜杰、黄发灿、郑登忠、何昌华,詹学雄、李庆阁、赵晶、李全宏、盛司道陈劲春、陈秀兰、钟江,刘斌、姚娟、任辉、邢志刚黄发喜、张熙颖、邓丽君、章丽丽
GB/T35541一2017 引言 pfuDNA聚合酶来源于耐热球菌(Pyrococcusfarioss),具有极高的热稳定性和保真性,被广泛应用于常规分子生物学实验制定pfuDNA聚合酶国家标准,用以推动该类工具酶的产业化,对于pfu DNA聚合酶的生产和使用具有重要的意义 IN
GB/35541一2017 pfuDNA聚合酶范围本标准规定了pfuDNA聚合酶的技术要求、检验方法,包装、运输、贮存和保质期本标准适用于以基因工程菌制成的pfuDNA聚合酶规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志术语和定义下列术语和定义适用于本文件 pfuDNA聚合酶pfuDNApolymerase ,分子质量为90ku,具有极高的热稳定性和保真性的 -种来源于耐热球菌尸yrorocwsuriosws NA聚合酶该酶能催化脱氧核糖核苷酸从模板的5'3'方向聚合到引物上,具有3'5'外切酶活性,无 5'-3'外切酶活性 3.2 pfuDNA聚合酶活性单位activityunitofpfuDNApoymerase 以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板/引物,在74C,6min内,将0.14nmol脱氧核苷酸聚合成双链DNA中所需的酶量为1活力单位(U) 技术要求 4.1外观澄清透明液体,无沉淀 4.2酶活 >5000U/ml 4.3杂质不应含有核酸外切酶和核酸内切酶
GB/T35541一2017 5 检验方法 5.1外观直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察 5.2酶活依据附录A的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1核酸外切酶检测依据附录B的方法进行检测 5.3.2核酸内切酶检测依据附录C的方法进行检测 o 包装、运输和贮存 6.1包装内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的规定 6.2运输产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨、防晒设施,运输过程中应做好防护措施避免倒置及破损不宜与有毒、有害、有异味物品混运 6.3贮存应在温度低于一20C的条件下储存保质期在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为3年;超过保质期,使用前应检测酶活
GB/35541一2017 附录 A 规范性附录) pfuDNA聚合酶酶活检测 A.1仪器全自动医用PCR分析系统 A.2试剂 A.2.1发夹型寡核苷酸序列(T2),序列为: ccTGCTCcCGCGGCCGat cCGGCcGCGGGAGCA-3 5' -tagcgaaggatgtgaacctaatccc atctgc A.2.2dNTP 注包括dATP.dCTP,diP,dGTP,其中dGTP经热启动修饰 A.2.3Pico(Green 染料 A.2.4 lamda DNA标准品 A.3试剂溶液配制 A.3.11×TE溶液;10mmol/1LTris-HCI,lmmol/LEDTA2Na,pH8.525C) A.3.2PCRbuffer:;200mmol/LTris-HC,100mmol/L(NH..sO,100mmol/LKCl,1%<体积分数Tritonx-100,1mg/mLBSA,20mmol/儿MgSO,pH8.725 .3.3LambdaDNA预染液;以8.5AL;l4lL:0.5L，的比例分别量取纯化水、10×PCRbufer和 A PicoGreen染料加人EP管,在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒,储存于2C 8 C A.3.4MgCl溶液;25mmol/LMgCl6H.O. A.3.5酶稀释缓冲液:10mmol/ITris-HCI,0.1mmol/IEDTA 2Na,lmmol/LDTT,50%体积分数甘油,pH8.0(25C A.3.6T2溶液;将发夹型寡核苷酸序列(T2)干粉按照合成单上的说明稀释到100mol/L,储存于 -20C.使用时从一20取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒 A.3.7dNTP混合液;将dATP,dCTP,dTTP和dGTP等体积进行混合,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒,配制成浓度为12.5mmol/L的dNTP混合液 A.3.8LamdaDNA标准品;使用1×TE溶液将LamdaDNA标准品进行4倍连续梯度稀释,得到 1004g/ml、254g/mmL、12.5从g/ml、6.25从g/mL将3.1254g/mmL、1.56254g/ml和0.78125从g/ml 8个浓度梯度溶液,以相同体积的1×TE溶液作为背景对照各梯度溶液和背景对照分别加人等体积的预染液,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒,以20AlL/管分装于PCR八联管内,每个梯度3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用 A.3.9pfaDNA聚合酶梯度稀释祥液;根据标定的酶比活力使用酶稀释缓冲液对pfuDNA聚合酶进行适当稀释(如标定浓度为5000U/ml，即5U/L，可稀释至4U/AL,3U/Al,2U/4L.)该步骤应在冰上进行
GB/T35541一2017 A.4实验步骤 A.4.1聚合反应液的配制与分装 A.4.1.1在EP管中按照表A.1的比例配制聚合反应液(冰上配制)聚合反应液配制完成后,在漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒注:配制总体积计算见式(A.l): 总体积=[3×(n十1)十1]x (A.l 式中; -重复次数; -pfuDNA的稀释梯度; 前一个1表示空白对照数,后一个1表示预留损失数量; V -1个反应用量,见表A.1 表A.1聚合反应配比聚合反应液组分！个反应用量/儿L. 规格纯化水 15 PCRbuffer 10 25nmmol/L MgC溶液 T2溶液 1004mol/I 0.1 dNTP混合液 12.5mmol/L 0.4 Pieo(Green 0.5 A.4.1.2将A.4.1.1中的聚合反应液平均分装到n个(n为pfuDNA的稀释梯度数)EP管中,分别加人 1.3AL的各浓度梯度的pfuDNA聚合酶梯度稀释溶液和空白对照(酶稀释缓冲液),在漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒各管混合液以20L/管,分装于PCR八联管内,每管混合液3个重复,盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用 A.4.2运行程序在全自动医用PCR分析系统上设置如下温度程序 95 55min 74C16 荧光采集通道:SYBR 120eycles 将装有LambdaDNA标准品和聚合反应液的PCR八联管置于全自动PCR分析系统中,启动温度程序,开始聚合反应 A.5数据分析 A.5.1L.ambdaDNA标准曲线的制作使用全自动医用PCR分析系统软件打开数据,导出Excel文件选取Excel文件中LambdaDNA标准品和背景对照的第2leycdles的荧光值计算背景对照3个
GB/35541一2017 重复的平均荧光值,将各梯度LambdaDNA标准品的荧光值减掉背景对照的平均荧光值,得到净荧光值计算各梯度净荧光值的平均值和标准偏差SD 以LambdaDNA标准品DNA量(ng)为X轴,以各梯度净荧光值的平均值为Y轴,标准偏差SD为Error值进行多项式拟合分析,制作工作曲线,从中获得净荧光值与双链DNA浓度的关系曲线如下,R'>0.98 A.2 =A十B 式中荧光值; -双链DNA的量,单位为纳克(ng) A.5.2聚合反应新生成的双链DNA量的计算选取Excel文件中待检pfuDNA聚合酶的第2leycles的荧光数据首先计算空白对照3个重复的平均荧光值,将各梯度pfuDNA聚合酶的荧光值减掉空白对照的平均荧光值,得到净荧光值,计算备梯度净荧光值的平均值(y) 将各净荧光值代人式(A.1)计算聚合反应新生成的双链DNA量(ci) A.5.3各pfuDNA聚合酶梯度条件下的dNTP消耗量计算各pfuDNA聚合酶梯度条件下的dNTP消耗量以y表示,单位为纳摩尔(mmol),按式(A.3) 计算 A.3 y？一 ×324.5 式中: 新生成的双链DNA量,单位为纳克(ng); Z 双链DNA由2条单链DNA组成; 324.5 dNTP的相对平均分子质量 A.5.4pfuNA聚合酶活计算 pfuDNA聚合酶酶活以S表示,单位为U/ml 选择在0.023nmol0.142nmol范围内的dNTP 消耗量按照式(A.4)计算: y+0.06)×D S A.4 0.04 式中 dNTP消耗量,单位为纳摩尔(nmol) y2 D 酶的稀释倍数
GB/T35541一2017 附录 B 规范性附录) 核酸外切酶检测 B.1原理 ccepUC19所含经BamHI位点居于编码LacZ的a互补肽上,ccepUC19经BamHI酶切后,由环形DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链,极易受核酸外切酶作用若样品存在核酸外切酶时,黏性末端易受外切酶切割,再经T4DNA连接酶连接,其电泳条带位置不一致 B.2仪器和设备恒温水浴槽 B.2.1 B.2.2台式离心机 B.2.3超净工作台 B.2.4电泳仪 B.3材料 B.3.1高纯cccpUC19DNA B.3.2T4DNA连接酶 B.3.3氯仿-异戊醉(24:1,体积比). B.3.4琼脂糖 B.4实验步骤 B.4.1长时程过量酶切各取54g高纯ccepUC19DNA置于两支eppondorf管,分别标记阴性对照和测试管，在阴性对照管里加人10AL10×BamHI缓冲液,2AL限制性内切酶BamHI(10U20U)，加人纯化水至 100L;在测试管里加人10AL10×BamHI缓冲液,2L限制性内切酶BamHI(10U20U). 5ALpfuDNA聚合酶样品(50U100U)，加人纯化水至100L 混匀，37C水浴10h,各取出 20AL,分别标记1,2号,待电泳检测;再各取20AL,分别标记3,4号 B.4.2电泳鼓.42.1取出1号和2号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测， B.4.2.21%~1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照
GB/35541一2017 B.4.3连接 B.4.3.1回收NA 取出3、4号管,各加人20L氧仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真空干燥样品 B.4.3.2连接反应每管加人2AL.l0×T4DNA连接酶缓冲液,2UT4DNA连接酶，加人纯化水至20AL，混匀 15水浴8h B.4.3.3电泳 B.4.3.3.1取出3号和4号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 B4.3.3.21%1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳，取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 B.5结果判定在电泳板上,肉眼观察若1号和2号的谱带一致.3号和4号的谱带一致,则判定样品中不含楼酸外切酶;若1号和2号的谱带不一致或(和)3号和4号的谱带不一致,则判定样品中含核酸外切酶
GB/T35541一2017 附录规范性附录) 核酸内切酶检测 C.1原理 pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致 c.2仪器 C.2.1电泳仪 C.2.2分析天平(万分之 c.2.3紫外透光分析仪 c.3实验步骤 C.3.1pUc19质粒反应 C3.1.1在测试管里先后加人4L.pUC19质粒DNA(14g/pL),14L纯化水、2L酶,振荡器混匀. 水浴1h; C3.1.2在对照管里先后加人4ALpUC19质粒DNA(1"g/L)、16AL纯化水,振荡器混匀,水浴 1h C.3.2电泳 1%1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/cm~10V/cm ,当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.4结果判断在电泳板上,肉眼观察若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含核酸内切酶;若不一致则判定样品中含有核酸内切酶

了解pfuDNA聚合酶GB/T35541-2017

一、pfuDNA聚合酶的定义

pfuDNA聚合酶是从嗜热菌Pyrococcus furiosus中分离出的一种高保真度的DNA聚合酶，其全称为Pyrococcus furiosus DNA polymerase.

二、pfuDNA聚合酶的特点

pfuDNA聚合酶具有高保真性、高准确性和高温稳定性等特点。其在50℃以上仍能保持较高的活性，因此被广泛应用于PCR反应中。此外，pfuDNA聚合酶还具有3'→5'外切酶活性，在PCR扩增后可直接进行克隆，而无需进行克隆前修饰处理。

三、pfuDNA聚合酶的应用

pfuDNA聚合酶主要用于PCR扩增反应，特别适用于需要高保真度和高准确性的PCR反应。其在基因克隆、遗传图谱构建、基因诊断等领域都有广泛应用。

四、pfuDNA聚合酶的优势

相比其他常规的DNA聚合酶，pfuDNA聚合酶具有更高的准确性和保真性，能够减少PCR扩增过程中的错误率，并且可以扩增较长的目标序列。此外，由于其具有3'→5'外切酶活性，可直接进行克隆，无需克隆前修饰处理。

总之，pfuDNA聚合酶是一种重要的分子生物学工具，在现代生命科学研究中发挥着重要作用。