国家标准 GB/T33834一2017 微束分析扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法 Mieroheamanalysis一Seamningelectromieroscopy Scanningelectronmicroscopeanalysisofbiologicalspecimens 2017-05-31发布 2018-04-01实施中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/33834一2017 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口本标准起草单位;浙江大学、同济大学、人民解放军第二军医大学,复旦大学本标准主要起草人:洪健、陈汉民、戎念杭,祝建、杨勇骥,俞彰
GB/T33834一2017 引言扫描电子显微镜是观察分析固态试样表面形貌和超微结构的分析仪器,要求试样干燥和表面导电大多数生物试样(动物,植物和微生物)水分含量高、不导电,进行扫描电镜观察分析时极容易在真空环境中收缩变形,导致真实的形态结构被破坏,且不能获得良好的结构信息因此,需采用化学或物理的手段对生物试样进行处理,才能最大限度地保持试样的原貌,供扫描电镜观察和分析随着电子显微镜技术的发展,在扫描电镜生物试样常规化学处理方法的基础上,又发展了一些新的物理处理技术如冷冻扫描电镜技术,并在实践中得到了良好应用为了规范扫描电镜生物试样的制备程序,正确指导生物试样的扫描电镜分析工作,有必要制定生物试样扫描电镜分析方法的国家标准 IN
GB/33834一2017 微束分析扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法范围本标准规定了生物试样扫描电子显微镜分析的技术要求和规范本标准适用于各种类型的扫描电子显微镜规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注目期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T21636微束分析电子探针显微分析(EPMA)术语 GB/T23414微束分析扫描电子显微术术语术语和定义 GB/T234l4和GB/T21636界定的术语和定义以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 电子枪eleetrongun 电子显微镜中的电子光源,由一发射体(加热钨丝、六棚化锏L.aB灯丝、冷场或热场发射尖端)1 与电子加速系统组成 3.2 电子束 electronbeam 由电子光学系统聚焦到试样表面的一束电子 3.3 加速电压aceeleratingvoltage 为加速从电子源发射的电子而加到灯丝和阳极之间的电位差 3.4 生物试样biologiealspeeimens 供扫描电子显微镜分析用的具有或者曾具有生命形式的各种动物、植物和微生物样品 3.5 二次电子semdaryeetrwn 由于人射电子轰击试样而从试样表面发射的电子注通常把能量小于50eV的电子称为二次电子 3.6 背散射电子backscatterelelectron 通过背散射过程从试样的电子人射表面出射的电子注通常把能量大于50eV的电子称为背散射电子
GB/T33834一2017 3.7 图像分辨率imageresolutom 能被清楚地分开、识别的两个图像特征之间的最小间距 3.8 图像放大倍率imagmagnifieation 扫描电镜显示的线性尺度L与试样上扫描范围的相应长度1之比则为图像放大倍率,以M表示 M=L/l 3.9 工作距离workingdistance 物镜极靴下表面与试样表面之间的距离 3.10 像散astigmatism -个物点发出的电子,不是像理想柱状透镜聚焦成一点,而是聚焦形成2条互成90°的分离聚焦线注像散是由于极靴加工精度,极靴材料不均匀,透镜内线圈不对称及不完善的光闹形成的透镜不对称磁场产生 3.11 荷电charging 由于缺少足够的对地导电途径,当试样受人射电子束轰击时其表面发生电荷积累的现象 3.12 导电镀层conduectivecatimg -种覆盖到绝缘试样表面的低电阻材料(如金、铂,铬、碳等)薄镀层,以提供电子束轰击时可能在表面积累电荷的接地通道注:导电镀层一般厚度为2nm20nm 3.13 scanningeleetronmicroscope;SEM 扫描电子显微镜通过电子束扫描试样表面产生放大图像的一种仪器该仪器用细聚焦的高能电子束轰击试样表面,通过电子与试样相互作用产生二次电子、背散射电子等信息,可对试样表面或断口形貌进行观察 3.14 冷冻扫描电子显微镜ery0scanningeleetronmieroseope;Cry0-SEM 样品台由液氮致冷的专用扫描电镜,以及在扫描电镜上附加液氮致冷的冷冻样品台附件,可将含水、含油试样超低温快速冷冻至固体状态下进行观察基本原理 4.1扫描电镜的成像原理由电子枪发射电子,经聚光镜和物镜的逐级会聚,形成具有一定能量和照明强度、束斑直径极细的人射电子束(电子探针),在扫描线圈的作用下,电子束在试样表面作光栅状扫描,通过闪烁体等检测器件接收试样中被激发出的二次电子,背散射电子等信号,把它转变成光信号,再经光电倍增管放大并转变成电信号,最后由计算机进行信号数据处理,在显示器上呈现试样表面形貌的电子图像 4.2冷冻扫描电镜的成像原理冷冻扫描电镜的成像原理同常规扫描电镜,区别在于样品台是由液氮致冷,并可以调节温度,控制冰的升华,观察的是经过超低温冷冻固化的试样
GB/33834一2017 仪器设备和材料 5.1扫描电镜 5.1.1扫描电镜由电子光学系统(电子枪、电磁透镜、光阑、扫描线圈、合轴线圈、消象散器、样品室、信号检测处理系统真空系统、电气系统和计算机系统等组成 5.1.2冷冻扫描电镜除了扫描电镜所有的组件外,还包括冷冻样品台和外置的样品快速冷冻装置，主要有:液氨泥装置、真空转移装置、准备室、扫描电镜样品室内的组件、控制板、电子箱和真空泵系统、氮气和饭气装置、红外观察器等 5.2辅助制样设备 5.2.1临界点干燥仪 5.2.2冷冻干燥仪 5.2.3离子溅射仪 5.3仪器的环境条件 5.3.1电源电压及频率稳定(220V士22V,50Hz士1Hz) 5.3.2室内相对湿度小于60% 5.3.3室温为20士5C 5.3.4场发射扫描电镜要求杂散电磁场干扰应小于0.1AT 5.3.5场发射扫描电镜的地基振动不超过5m(峰-峰值) 5.3.6具备仪器专用地线,接地电阻值参照仪器的要求 5.4试剂及材料 5.4.1戊二醛(分析纯 5.4.2四氧化俄(晶体). 5.4.3丙(分析纯). 5.4.4乙醉(分析纯 5.4.5醋酸异戊酯(分析纯). 5.4.6叔丁醇(分析纯 5.4.7液态二氧化碳 5.4.8导电银胶 5.4.9导电双面胶带 5.4.10冷台粘样胶水 5.4.11液氮 5.4.12氮气(高纯). 氧气(高纯). 5.4.13 5.4.14离子溅射金靶 5.4.15离子溅射铂靶
GB/T33834一2017 6 试样 6.1生物试样的要求 6.1.1自然状态下化学和物理性能上稳定的固体生物样品如;动物毛发、骨头、牙齿、干燥的植物种子干标本等,在真空及在电子束轰击下不挥发、不变形、无放射性和腐蚀性,适合于扫描电镜在高、低真空条件下观察分析 6.1.2自然状态的生物样品如;动物组织和细胞,植物的根,茎,叶、花,真菌、细菌等微生物样品,水生生物,培养在各种固体材料上的生物细胞等,需要用化学或物理方法进行试样干燥和表面导电处理,然后进行扫描电镜观察分析或者不经过试样干燥处理,采用冷冻扫描电镜进行观察分析 6.2生物试样的制备 6.2.1扫描电镜观察生物试样表面的制备方法 mm5mm 6.2.1.1取材:将生物组织切成直径不大于10 ,高度为31 的小块,采用与固定液配置相 mm 同的缓冲液或生理盐水清洗试样表面,游离细胞或微小试样用缓冲液离心漂洗 6.2.1.2前固定;将清洗后的试样放人由0.1lmol/L磷酸盐缓冲液(或其他缓冲液)(pH6.8~7.2)配置的2%3%戊二醛固定液中进行前固定,植物组织前固定期间应经过抽气以排出组织内含的气体,使固定液充分渗透进人试样,4C下前固定2h以上培养细胞和游离细胞固定的时间可以缩短至1h. 固定液的配置参见附录A 6.2.1.3 后固定:经戊二醛固定的生物试样用与前固定相同的缓冲液充分漂洗后,加人相同缓冲液配置的1%四氧化俄固定液,，4C下固定1h一2h 6.2.1.4脱水和置换:用浓度分别为50%、70%,80%,90%、95%、100%的乙醇或丙酮进行梯度脱水 min15min 每级浓度脱水5 吸弃100%脱水剂,转人醋酸异戊酯与脱水剂1;1的混合液中置换 10min20min， n,并适当摇动,再转人纯醋酸异戊酯中充分置换 6.2.1.5干燥:脱水后的生物试样可选用临界点干燥法或冷冻干燥法进行干燥临界点干燥;脱水后的生物试样采用临界点干燥法进行干燥,临界点干燥仪采用液态二氧化碳为介质,具体步骤按照临界点干燥仪的操作说明进行冷冻干燥:脱水后的生物试样也可以采用冷冻干燥法进行干燥,经100%脱水剂脱水后,转人75% 的叔丁醉中过渡10min,再置于100%的叔丁醉中两次,然后在冷冻干燥仪上进行冷冻干燥,具体步骤按照冷冻干燥仪的操作说明进行 6.2.1.6粘样;用导电双面胶带或导电银胶将试样粘接在扫描电镜样品台上,使试样观察面朝上 6.2.1.7表面导电处理:采用离子溅射法对干燥后的生物试样表面喷镀一层导电镀层,如金、铂或碳场发射扫描电镜高分辨观察的试样应用铂进行表面喷镀,具体步骤按照离子溅射仪的操作说明进行 6.2.2扫描电镜观察生物试样断面的制备方法(乙醇割断法 6.2.2.1将生物组织切成(1 mm~3mm)×(5mm~10mm)左右的长条状,按照与表面观察相同的试样制备方法进行化学固定和乙醇梯度脱水 6.2.2.2将试样连同100%乙醇包裹在空心胶囊中,封闭胶囊,不留气泡 6.2.2.3将此胶囊迅速投人液氮快速冷冻,用钳子夹持单面刀具插人液氨预冷,然后将刀刃对准胶囊想要割断的部位,用榔头敲击刀背割断试样 6.2.2.4将冷冻割断的试样迅速投人室温下的乙醇中,融化后试样与胶囊脱离,再转人醋酸异戊酯中过渡,进行临界点干燥;或者转人叔丁醇中过渡,进行冷冻干燥
GB/33834一2017 6.2.2.5将试样的割断面朝上粘到样品台上,然后采用离子溅射法在割断面上喷镀导电镀层观察分析步骤 7.1仪器的工作条件调试扫描电镜使之达到规定的技术指标,保证仪器正常运行并能提供清晰、正确的图像 7.2扫描电镜观察分析步骤 7.2.1开启扫描电镜,待真空度达到仪器规定的高真空指标后进行观察前的仪器检查,对中电子束消除图像像散 7.2.2关闭电子枪发射后对样品室放气,按要求将试样装人样品室,重新抽真空对于场发射扫描电镜则是切断电子束通道后进行样品室放气和安装试样,不关闭电子枪发射对于设有换样预抽室的扫描电镜则是通过该装置进行换样操作,无需对电镜样品室放气和重新抽真空 7.2.3根据不同生物试样的观察要求,设置扫描电镜观察条件高分辨观察需要短工作距离,大视野低倍率观察需要长工作距离,观察生物试样时工作距离一般选择在10mm左右,高分辨率观察可选择在3 样品台倾角根据试样情况进行调整,对于表面平坦的试样可选择30'~45"甚至更大 mm5mm 的倾角对于导电性良好的试样,加速电压一般选用15kV20kV,对于导电性差容易产生荷电的试样可采用1kV3kV甚至1kV以下的低电压 7.2.4打开电子枪束流,选择需要的信号检测器,获得二次电子扫描图像或背散射电子扫描图像、消像散、亮度和反差调节等操作 7.2.5根据观察需要选择合适的放大倍率,进行图像聚焦、 7.2.6根据不同需要选择物镜可变光闹 7.2.7根据不同需要选择图像扫描模式和扫描速度 7.2.8对感兴趣区域的生物试样形态结构进行图像记录 7.2.9观察结束后,依次关闭扫描电镜的灯丝电流和加速电压,关闭主机电源和稳压器,油扩散泵真空系统需要等待15min后再关闭冷却循环水场发射扫描电镜观察结束后,关闭加速电压,退出计算机系统,让仪器处于抽真空待机状态 7.3冷冻扫描电镜或配置冷冻台附件的扫描电镜)的试样处理和观察分析步骤 7.3.1试样:冷冻扫描电镜(或配置冷冻台附件的扫描电镜)观察用的含水生物试样不需经过任何处理,保持试样原貌或仅做适当的表面清洁即可 7.3.2准备及观察步骤如下: 开启扫描电镜,打开冷冻部分的电源开关,对准备室抽真空 a b 待准备室达到要求的真空度后,加液氮降温,使准备室样品台温度降至一150C以下在液氮泥装置里注人液氮,并抽真空,使液氮成为液氮泥. c 给扫描电镜样品室内的组件加液氮或者通人经过液氨冷却的干燥氮气,使其温度降至 d -150C 以下用冷台粘样胶水将固体试样粘于样品台上,液体试样可直接滴在样品台上,用真空转移装置把粘有试样的样品台迅速插人液氮泥中充分冷冻抽真空后,把试样拉人真空转移装置的腔内盖上盖,转移到准备室如需要,在准备室内完成试样的冷冻断裂设定升华温度进行试样的升华 fD 升华结束后,使试样温度重新达到一150C以下打开氧气,按下镀膜键,进行表面镀膜 g h 镀膜结束,待真空达到要求后,打开准备室与扫描电镜样品室之间的隔离阀,将试样从准备室移人扫描电镜样品室内,然后退出真空转移装置,关闭隔离阀,进行扫描电镜观察,记录图像
GB/T33834一2017 在观察期间需保持扫描电镜样品室内组件温度在一150C以下,视需要可续加液氮 i 观察结束后,关闭扫描电镜电子枪发射,打开隔离阀,拉出试样放出剩余液氮,给样品室内组件和准备室回温,待温度回到室温后,才可关闭冷冻部分的电源视需要选择关闭扫描电镜或者让其继续运行 8 结果表述生物试样的扫描电镜形态观察结果以记录的电子图像形式提供,图像上应注明样品名称、标尺,放大倍率等工作条件在文字报告中应注明电镜型号、工作条件和制样方法异常情况的处理 9.1荷电如果图像显示器上出现横向条纹闪烁,图像结构断裂,图像衬度及亮度异常等现象,表明生物试样导电性不佳,应该停止观察,取出试样后重新喷镀表面导电镀层 g.2试样变形损伤如果图像显示器上显示试样变形或损伤严重,表明试样前处理不符合要求,应重新进行试样的前处理 9.3冷冻扫描电镜的试样结霜、产生冰晶等如果在冷冻扫描电镜观察时发现试样表面结霜,冷冻断裂样品时发现试样内部产生异常大的冰晶结构,表明试样快速冷冻速率不够,或除霜处理不当,应重新进行试样快速冷冻,调整除霜参数,以得到结构良好的图像 10 分析结果报告分析结果报告应包括以下信息分析报告的唯一编号 a b) 分析报告的页码样品名称 c 送样人姓名、单位和地址; d 样品的接收日期; e 实验室名称和地址 f 分析检测依据日分析仪器及其工作条件; h 分析结果和必要的说明; 分析报告负责人的签字; j kk 分析报告的日期
GB/33834一2017 附录 A (资料性附录) 常用固定液的配方 A.1戊二醛固定液 A.1.10.2mol/L磷酸缓冲液分别配制A液和B液,然后按照表A.I量取A液和B液混合后测pH值 A液0.2mol/几磷酸二氢钠水溶液: 27.60" NNaHPO H.O 31.21 或NaHPO2H.O g 加双燕僧水到1000mL B液0.2mol/儿磷酸氢二钠水溶液 NaHPO2H O 35.61g 或Na,HPO12H.O 71.64g 加双蒸馏水到1000mL 表A.1不同pH值磷酸缓冲液配制表 6.1 6.5 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 pH值 A液/mL 85 68 51 45 39 33 28 23 19 16 67 15 32 49 61 72 77 8 B液/ml 55 84 A.1.20.1mol/L磷酸缓冲液配制的戊二醛固定液分别取0.2mol/L磷酸缓冲液、25%戊二醛水溶液和双蒸水,按照表A.2量取混合表A.2戊二醛固定液配制表 0.2mol儿磷酸缓冲液/ml. 50 50 50 50 50 50 50 12 25%皮二醛水溶液 ml 10 16 20 100 100 100 加双蒸溜水至/" ml 100 100 100 100 戊二醛最终浓度 1.5% 2.5% 5.0% 1.0% 2.0% 3,0% 4.0% A.2四氧化锻固定液 A.2.12%四氧化镀贮存液将装有四氧化俄的安瓶(共0.5g)清洗干净,用玻璃划割器在上面刻痕,再用蒸僧水冲洗几次,放人洁净棕色广口玻璃瓶内,加上25mL双蒸圜水,用洁净玻璃棒捣破安然后用石蜡将广口玻璃瓶严密封口,贴上标签备用将配好的2%四氧化锻贮存液置于干燥器中,4笔保存
GB/T33834一2017 A.2.20.1mol/L磷酸缓冲液配制的四氧化锻固定液取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液pH值7.2)与2%四氧化锻贮存液混合,现配现用

微束分析扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法GB/T33834-2017

近年来，微观结构分析已成为生物学研究中不可或缺的技术手段。微束分析扫描电子显微术（Microanalysis Scanning Electron Microscopy, MSE）是一种高分辨率的成像和化学分析技术，可以同时获得样品表面形貌和元素分布信息，被广泛应用于生物学、材料科学、地质学等领域。

技术原理

MSE技术是将扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope, SEM）与X射线能谱仪（Energy Dispersive X-ray Spectrometer, EDS）相结合的一种分析方法，通过SEM进行对样品表面进行扫描，利用电子束与样品相互作用产生的X射线，实现对样品的元素定性和定量分析。

仪器设备

MSE技术需要使用SEM和EDS两种设备，其中SEM主要负责扫描样品并获得高分辨率图像，而EDS则是通过探测SEM所激发出的X射线，获得元素能谱信息。通常情况下，这两种设备会被集成在一台设备中，称为SEM-EDS联用系统。

实验操作

在进行MSE分析前，需要对待分析样品进行处理和制备。通常情况下，生物试样需要经过固定、切片、脱水等步骤，以保持样品的完整性，并减少与周围环境的干扰。随后，将样品放置于SEM工作台上，并调节SEM参数，例如加速电压、探头电流、探头扫描方式等。当SEM开始扫描样品表面时，EDS会同时记录下X射线信号，并将其转换成元素能谱信息。

数据处理

MSE分析获得的数据包括元素分布图和元素能谱图。元素分布图可以直观地展示样品表面中各个元素在空间上的分布情况，而元素能谱图则可以用于元素定量分析。对于得到的数据，可以通过相关软件进行分析和处理，例如ImageJ、EDAX等。

综上所述，MSE技术是一种可靠高效的微观结构分析方法，可以在不破坏样品完整性的前提下获得高分辨率的成像和元素分布信息。GB/T33834-2017标准为MSE技术的规范化操作提供了重要的依据，具有指导意义和推广意义。