淀粉胶电泳同工酶分析

淀粉胶电泳同工酶分析

国家标准 GB/T25877一2010 淀粉胶电泳同工酶分析 Starehgeleleetrophoresisisozymeanalysis 2011-01-10发布 2011-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25877一2010 前 言 本标准的附录A,附录B,附录C,附录D和附录E均为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会归口 本标准起草单位;海洋大学、黄海水产研究所 本标准主要起草人:高天翔、张岩、韩志强、肖永双、张辉
GB/T25877一2010 淀粉胶电泳同工酶分析 范围 本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料、仪器、抽样,分析步骤及结果判定 本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 (GB/T18654.1一2008养殖鱼类种质检验第1部分:检验规则 GB/T18654.2一2008养殖鱼类种质检验第2部分:抽样方法 原理 利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同,在电场作用下,凝胶中出现的同工酶迁移率不同， 经催化、染色、扫描,获得各同工酶谱带、数目及吸收强度等,经比较分析,判定鱼类的遗传特性 试剂和材料 除另有说明外,所有试剂均为分析纯或以上级别,水为蒸懈水或去离子水或相当纯度的水 4.1水解马铃薯淀粉 4.2柠檬股 4.3乳酸 乙二胺四乙酸 乙二胶四乙酸二纳 ，5 苹果酸 乳酸锂 4.8磷酸氢二纳 9 磷酸二氢钠 .1D辅M！ 辅酶I 2 吩嗦甲酯硫酸盐 氯化硝基四氮幽蓝 异柠檬酸三钠 415G磷酸葡萄糖酸的. 乙醇 " 丙明 18a-禁乙酸 4 .19a-磷酸甘油 4.206-磷酸葡萄糖 4.21 山梨糖醇
GB/T25877一2010 4.22固蓝RR盐 4.23冰乙酸 盐酸 4 .24 425复复化的 4.26肝素 4.27氯化镇 4.283-氨甲基-吗啡嘛 我29 TC-7.0制胶缓冲液配制方法见附录A ，30Tc8.0胡股缓冲被，,肥制方法见附录 4.31cAPM6.0制胶缓冲液配制方法见附录A 4.32 CAPM-7.0制胶缓冲液:配制方法见附录A 433TC7.0电泳缓冲液,配制方法见附录B. 434TC8.0电泳缓冲液;配制方法见附录B. 4.35cAP\ME;.0电泳缓冲液;配制方法见附录B. 4.36cAPME7.0电泳冰缓冲液;配制方法见附录B. 437淀粉凝胶配制方法见附束c 38染色缓冲液;配制方法见附录D 4. 4 ..39染色液:几种常见同工酶染色液配制方法见附录E. 仪器 5.1微量匀浆机 5.2高速冷冻离心机(转速12000r/min). 5 多用电泳仪 5.4真空抽气机(泵). 电炉或微波炉 .5 6 削胶器 多层滤纸 s， B 激光扫描仪 5.9p计,精度为a.0n 55 制胶模具 10 11 染色盒 4C冷藏冰箱 12 13 5 低温冰箱;冰室温度在一20C以下 55. .14恒温培养箱 5. 15分析天平;精度为0.0001g 16电子天平;精度为0.1g 55 5 7 摄影装置;数码照相机 抽样 6 样品的抽样 按GB/T18654.22008的规定执行 6 取样 取样品组织1g2g试样,于低温冰箱中(一25C以下)保存;对于血液试样,加肝素抗凝,于4C
GB/T25877一2010 冰箱中保存,备用 分析步骤 7.1分析样品的制备 电泳前取0.3g左右样品放人1.5mL离心管,加人等体积的蒸水或提取液后置于冰浴中研磨， 研磨混合液置于冷冻离心机中,在4C、12000r/min的条件下离心直至上清液澄清,取上清液冷冻保 存备电冰用 对于血液试样,待分离出血清后上样 7.2凝胶制备 凝胶制备见附录C 7.3电泳步骤 用手术刀在凝胶距离边缘三分之一(约2.5cm)处切开,用适当大小的滤纸片蘸取7.1制备的样品 提取液(或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁)插人切口中 上样完毕后,向电泳槽内加人电 泳缓冲液,用滤纸搭盐桥,在4C条件下以恒定电流(40mA)进行电泳,电泳时间依酶的种类而不同 染色、固定 电泳结束后,用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片,置于染色盒中,将配制好的染色液倒 人染色盒后置于37C的恒温箱中进行染色 待显色充分后,用7%的冰乙酸溶液终止反应 各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E 7.5制干胶片 取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上,压制封膜,风干后编号保存 7.6摄影、扫描 用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相,或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描 7.7结果分析 酶位点与等位基因分析 7.7.1 根据鹏的结构组成和同工鹏在组织中所表现的孵谱特征,确定每种同工刚的编码基因位点、多态位 点的等位基因频率 7.7.2群体遗传特异性 多态位点比例(P),平均杂合度观察值H.、平均杂合度期望值(H.)分别按式(1),式(2)和式(3) 计算 P=N/n×100% 式中 多态位点比例; N 多态位点数; 检测位点总数 Y-二 H =- 式中: 平均杂合度观察值; H 第i个位点上第个等位基因的纯合基因型的频率 g 第个位点上的等位基因总数， 1 检测位点总数 n
GB/T25877一2010 >> H =三 (3 式中: 平均杂合度期望值; H -第i个位点上第个等位基因的纯合基因型的频率; g" -第i个位点上的等位基因总数; mn 检测位点总数 结果判定 8.1个体测定结果的判定 按GB/T18654.1一2008中6.1的规定执行 将所有测定结果逐一与标准对照,凡符合或接近标准规定的,判定为合格;凡不符合标准,或与标准 规定有显著差异的,判定为不合格 8 样品群体的判定 2 根据8.1的判定结果,计算出被检样品合格品的百分比,用百分数表示
GB/T25877?2010 ?A 淶?? ?? A.1Ic-7.0?? ??1.09g,????pH7.0,??1L A.2Ic-8.0?? ??1.21g????pH8.0,??1L A.3CAP\-6.0?? 0.42g,????3-?-?pH6.2,??1L CAPM-7.0?? A4 0.42g,????3-?-?pH7.0,??1L
GB/T25877?2010 ? B 淶?? ?? B.1Ic-7.0?? ?16.35g,???pH7.0.?1L B.2IC-8.0?? ??20g,???pH8.0,?1L B.3CAP\-6.0?? 8.4g????3-?-?pH6.2,??1L B.4CAPM-7.0?? 8.4g,????3-?-?pH7.0,??1L
GB/T25877一2010 c 附 录 规范性附录 淀粉凝胶的配制 加淀粉30旦和制胶缓冲液254mL.在锥形烧瓶内混匀,加水定容至1L.,加热至沸腾、完全溶解,抽 气后注人制胶模具(见图C.1)中,冷却后,保鲜膜密封保存备用 制胶模具示意图 图C.1
GB/T25877?2010 ?D 淶?? ??? D.10.2mol/1Iris-HC.p8.0 ??24.22g????pH8.0,??1L D.20.2mwl/LIris-HHCI,pHH8.5 ??24.22g???pH8.5,??1L D.30.2mol/LIris-lHCl,plH9.5 ???24.22g,????pH9.5,???1L D.40.1mo/1??,pH7.0 17.91g8.05g,????1L
GB/T25877?2010 ? E 淶?? ?????? ??????E.1 E.1????? ?? ?д ? ? ?(99% 99% 1ml~2ml Tris-HCI 0.2mol/LpH8.5 25ml alcoholdehydroenase; ? ADH NAD? 0.25% 25ml 0.5% PMs? 0.5ml a- 200mg glyceraldehyde-3phosphate ?-3 Tris-HCI 0.2mol/L,pH8.5 25ml dehydrogenase:; NA? 0.25% 25mL G3PDH ? PMS? 0.5% 0.5ml ? 250mg ? 25ml Tris-HCI 0.2mol/LpH9.5 malatedehydrogenate ? MDH 0,25% 25mL NAD? PMS? 0,5% 0.5ml 0.6mg 0.2mol/L,pH8.5 25mL Tris-HCIl lactatedehydrogenase; ? LDH NAD? 0.25% 25mL PMS? 0.5% 0.5ml 25mg Tris-Hc" 25mL 0.2mol/LpH8.0 isocitratedehydrogenase; 0.25% 25mL NADP? ? DHHIP ?? mol/L 1.2mL PMS? 0.5% 0.5ml ?? 10mg 100mg Tris-HCI 0.2mol/LpH9.5 25ml superoxidedismutase; 绯 S(OD ? 2.5 ml 0.5% PMS? 0.5ml ? 20m 6- 50mg phosphoglucommutase 0.2mol/L,pH8.0 Tris-HCI 25ml ?λ? PGM ?? lmol/L 0.4ml
GB/T25877?2010 E.1) ?д ? ? ? 0.25% NADP? 25ml phosphoglucomutase; 25uU -6-? λ? PGM 0,5% 0.5mL PMs? ? 1mL RR 32mg esterase; ?? 0.1mol/LpH7.0 20ml EST ? 2ml 1% 20ml 250 ? mg Tris-HCIl 0.2tmol/L LpH8. 25mL malieenzyme; ?? ?? mol/L ml ME NADP? 0.25% 25tml PMS? 0,5% 0.5ml ?? 25mg ?洼 Tris-HCT 0.2mol/LpH8.0 25ml sorbitoldehydrogenase; 0.25% 25m SDH NAD? 0.5% PMs? 0.5ml -6- 25mg gucose-6-phosphate 6- Tris-HCI 0.2mol/L,pH8.0 25mL dehydrogenase:; ? lmol/L 0.6ml ? G6PDH PMS? 0.5% 0.5ml 10