动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程

动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程

国家标准 GB/T27537一2011 动物流感检测A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 Animalinluenzadeteetion一ProtocolofDNAmieroarrayexamination forinfluenzaAvirssubtypes 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27537一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、人民解放军军事医学科学院、兽医药品监 察所 本标准主要起草人.韩雪清、刘伯华,、李建、林祥梅,王慧熄、刘建、陈茹、候义宏、刘业兵、贾广乐 吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴
GB/T27537一2011 动物流感检测A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 范围 本标准规定了A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程 本标准适用于口岸样品中A型流感病毒全部亚型(HlHl6,NN9)的筛查 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 control1、control2andcontrol3 1.ctr2和ctr3;质控探针1、2和3(e ctrl DEPC;焦碳酸二乙酯(diethylpyroearbonat te aNTP;脱氧核苷酸三磷酸(deox y-ribonucleosidetriphosphate PIS;磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufersolution) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid RT-PCR;反转录聚合酶链反应(reversetranscriptionpolymerasecehainreaction SDS;十二炕基磺酸钠(sodiumdodeeylsulfate) SsC;氯化钠/柠檬酸钠缓冲液(sodiumchloride-sodiumcitratebufer) TAMRA;拨基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine) 主要试剂和仪器 主要试剂 4.1.1试验用水 蒸馏水,按照GB/T6682,三级用水,除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯 4.1.2提取试剂 Trizol试剂等或商品化的病毒RNA提取试剂 4.1.3A型流感病毒多重不对称T-PCR扩增引物和探针的合成 特异性引物和探针参见附录A) 探针和引物合成后,采用无RNA酶的水(参见附录B)分别溶解 为50Amol,一20C保存备用
GB/T27537一2011 4.1.4RRT-PCR反应试剂 -步法RT-PCR缓冲液,dNTP,酶混合物,RNA酶抑制剂等 4.1.5基因芯片 含有A型流感病毒16个HA亚型和9个NA亚型特异性探针和质控探针,参见附录C 4.1.6基因芯片杂交液 商品化的基因芯片杂交液参见附录B)，每份含有ddH,O0.7AL,20×sSC1.5AL. 50×Denhardt's1.5AL,50%质量体积比)硫酸葡聚糖3.0L,4%质量体积比)SDs1.5L,共 8.2AlL/份 4.1.7杂交质控探针 TAMRA荧光标记的一段寡核苷酸(ctrl),与芯片上杂交阳性参照(PC,ctr2)序列互补,用于质控 杂交过程(序列参见附录A) 合成后,采用无RNA酶的水溶解为50Amol/L,-20C保存备用 4.2仪器 4.2.1微型台式高速冷冻离心机(大于13000r/min. 4.2.2PCR仪 4.2.3涡旋混匀器 42但温水浴箱 42s 芯片杂交盒 4.2. 脱色摇床 4.2.7基因芯片扫措仪 42.8冰箱e它一8、一20七和一80c三种) 4.2.9微量可调移液器 4.2.10离心管和枪头 操作方法 1 采样工具 5 下列采样工具应经(121士2)C,15min高压灭菌并烘干 -棉拭子 剪刀 -锻子; -1.5mL离心管; 研钵 5.2样品采集 5.2.1活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下: -取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次3次并旋转,取鼻腔分泌液; -取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上飘裂来回刮2次3次并旋转,取咽喉分泌液;
GB/T27537一2011 -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便 将采样后的拭子分别放人盛有1.0mlPBS的1.5mL离心管中,加盖、编号 5.2.2脏器或肌肉组织 用无菌锻子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织,装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号 5.3样品贮运 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰,密封,24h 内送实验室 5.4样品的处理 5.4.1棉拭子处理方法 样品在混匀器上充分混合后,用高压灭菌子将拭子中的液体挤出,室温放置30min,取上清液转 人无菌的1.5mL.离心管中,编号备用 5.4.2肌肉或组织脏器处理方法 取待检样品2.0g,加人等量灭菌石英砂,于洁净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加人10mLPBS 混匀,4,3000r/min离心15min,取上清液转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用 5.5样品RNA的制备 5.5.1取上清液200L,分别加人1.5m离心管内,各加人Trizol试剂1.0mL,反复混匀,冰上放置 5 min 5.5.2加人200L氯仿,小心盖上帽盖,用力摇动离心管15s,室温放置5min 5.5.312000r/min,4C,离心15min,可见分为三层,上层水相含RNA 5.5.4转移水相至一新离心管内,加人等量异丙醇,混匀,室温放置15nmin. 5.5.512000r/min,4C,离心10nmin,离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒 而言,可能看不到沉淀. 5.5.6小心吸弃上清,加人500L75%乙醇(用DEPC水配制,小心颠倒以漂洗沉淀及管壁 12000r/min,4C,离心5min. 小心股弃上清,室温干燥RNA沉淀5 5.5.7 min10min 然后加人20AL无RNA酶的水溶解沉 淀 提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存,应放置一80C冰箱保存 5.6A型流感病毒RNA多重不对称RT-PCR扩增体系 5.6.1引物混合比例 25对引物分为4组 第1组包括H1,H3,H5、H6,H7、H9,N1和N2,其中H5和H7亚型的上游 引物为0.65ML,下游引物为1.3AlL,N2亚型的上游引物为0.6L,下游引物为1.2L,其余亚型的上 游引物均为0.5L,下游引物均为1L;第2组包括2. ,H4、H8,H10,H11,IH13、H15和H16,每个亚 型的上游引物均为0.5L,下游引物均为1lL.;第3组包括Hl4、N4、N6,N7和N9,其中N7上游引物 为0.65L下游引物为1.3Al,其余亚型上游引物均为0.5L,下游引物均为lAL;第4组包括H12 N3,N和N8,其中N5上游引物为0.6L,下游引物为1.2aL,其余亚型上游引物均为0.5nL.下游 引物均为1AL 5.6.2RT-CR反应体系 每个样品分4个管进行RT-PCR 在0.2mL PCR反应管中依次加人一步法RT-PCR缓冲液
GB/T27537一2011 10L,l0mmol/LdNTP2.0L,酶混合物2.0AL,RNA酶抑制剂0.5L,通用引物上游0.5AL 下 游5.0L,RNA模板5.0l,按照4组引物混合物的用量分别加人引物混合物,补无RNA酶的水至 0.0AL 置于CR仪立即进行RT-PCR扩增 5.7A型流感病毒多重不对称RT-CR反应条件 反应条件:50C30min;95C15min;94C20s,52C60s,72C90s,共20个循环;然后94C 20s,70C90s,共20个循环;最后72C延伸10min 扩增反应结束后,取出放置于4C 5.8基因芯片的杂交、洗涤与扫描 5.8.1杂交步骤 5.8.1.1扩增产物5.2L(4组RT-PCR产物各取1.3nL)、杂交质控探针0.8L和杂交液6ulL于 0.2mLPCR管中,混匀 5.8.1.295C变性5min,立即冰浴31 3min,4000r/min离心5s~10s,将离心管放回冰浴 5.8.1.3在杂交盒的沟槽中加人200L蒸水以防止杂交体系蒸发,将芯片正面向上放人盒中 5.8.1.4将已变性的杂交样品从冰盒中取出,用枪头轻轻吹吸3次一5次 5.8.1.5取7l杂交混合液加到探针点阵区,迅速盖上盖片和杂交盒并密封 5.8.1.6将杂交盒水平放人52C的水浴锅中,杂交2.5h 5.8.2洗涤步骤 杂交结束后,立即将芯片取出,放人预热至45C的洗涤液I中,100r/min水平振荡洗涤 5.8.2.1 5 ,相同条件重复一次 min 5.8.2.2取出芯片,放人预热至45C的洗涤液I中,100r/min水平振荡洗涤5min,相同条件重复 5.8.2. 3 取出芯片,放人洗液中,100r/min室温振荡5mina 5. 8. 2 将芯片在无水乙醇中浸提几次,然后把芯片放人芯片盒中,1000r/nmin离心5min. 5.8.3扫描 用基因芯片扫描仪(波长532nm,P\MT60%,激光能量90%,扫描仪参数不作硬性规定)进行芯片 扫描 结果判定 6.1检测结果成立条件 A型流感病毒基因芯片点样阳性参照(QC,即ctr3)和杂交阳性参照(PC,即ctr2),经杂交扫描后出 现特异性荧光信号,同时点样buffer参照(NC)和空白参照(N)无荧光信号,则检测结果成立,否则结果 不成立,应重新试验 结果判断 6.2.1阳性判定 在试验结果成立的前提下,如果样品RT-PCR产物经杂交后,在各自的位置上见图1)出现特异性
GB/T27537一2011 荧光信号,则判定为A型流感病毒各个亚型包括HA和NA)核酸阳性 每条探针有2个重复位点,出 现2个或2个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性;出现1个荧光信号需进行重复试验再次读判,如果 仍出现1个荧光信号,就判为可疑,可采用其他方法进一步验证 如果只有HA或者只有NA位点出现 荧光信号,或者2个以上HA或NA亚型位点出现荧光信号,都判定为该亚型核酸阳性 Hn1 H H H HH2 O N N QC Hl H H2 QC H!2 H2H3 H3H3 H3H4 H H4H H5H5 H H5 H6 H6 H6 H6 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H7 H8 H8 H8 H8 H9 H9 H9 H9 H10 H10 H10H10 Hl1 H H11 H11 NC NC H12 H12 H12 H12 P P H13H13 H13 H13 NC NC H14 H14 Hl4 Hl4 H15 H15 H15 H15 H16Hl6 H16 Hl6 N N N N N2 N2 N2 N2 N3 N3 N3 N3 N4 N4 N4 N4 N5 N5 7 N7 N5 N5 N6 N6 N6 N6 N7 N7 N8 N8 8 Q QC N8 N9 N9 NC N N9 N9 N N QC 点样阳性参照 QC PC 杂交阳性参照; NC 点样buffer参照 N 空白参照; DP(H1一H16,N1一N9) 检测探针 图1芯片探针排布图 阴性判定 6.2.2 如果在各亚型特异性探针位置上(见图1)均未出现荧光信号,则判定为A型流感病毒亚型核酸阴性 注意事项 7.1样品处理,RNA提取和RT-PCcR加模板等操作应该符合相关生物安全操作管理规定的要求,同 时注意自身防护 扩增后芯片杂交检测可在普通实验室进行操作 7.2因涉及RNA操作,为了防止RNA降解,用于试验的器皿和离心管、,PCR管及枪头等均需要用 DEPC水处理,并经过121C、,15nmin高压灭菌后才可使用 操作时应戴一次性手套,并经常更换 7.3模板RNA提取、PCR反应液配制、芯片杂交、芯片洗涤和结果观察等应分区或分室进行,实验室 运作应从洁净区到污染区单方向进行 当同时需要进行数个样品的多重不对称RT-PCR反应时,先配制除待检样品外的各种试剂的混 合液,然后再分装到每个反应管中 这样,可使所取的试剂体积更准确,减少试剂损失,避免重复分取同 一试剂 同时也可以减少实验操作产生的误差 7.5使用酶混合物和RNA酶抑制剂等酶类时,取样之前要瞬时离心,将液体收集到反应管底部;由于 酶保存液中含有50%的甘油,黏度高,应慢慢吸取以保证取样量的准确 7.6上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧,以防RNA和PCR产物污染仪器 7.7取杂交混合液加到探针点阵区时,一定要轻柔,避免出现气泡,否则会影响杂交结果 7.852C杂交时,杂交盒要水平放置 7.9芯片洗涤时,洗涤液I和洗涤液要预热,否则洗涤不干净,影响扫描结果 7.10芯片常温避光保存
GB/27537一2011 附录A 资料性附录 引物和探针序列 表A.1A型流感病毒基因芯片多重不对称RT-PCR引物 引物编号 长度 型别 序列(5'一3') Uamiv-PMA06001 TcAcTTGcTTccGTTGAGG ersalPMA-06002-ur TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT GAG;CAATTG;AGTTcAGTATc TACTTCTTGTTGNcG0 H1PMA -06003-H1f 601bp PMA-06004-HlrTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTG PMA-06005-H3 TcAcTTGcTTCcGTTGAG;GTGTTAccCTTATGATG;TGCc H3 669bp PMA-06006-H3r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTcCCTGTTGCCAATTTCAGAG H5 PNMA06007-H5n TcACTTGcTTcG CGTTGAGGAGTG AATTGGAATATGGTAAcTG 380bp PMA-06008-H5r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAAC'TGAGTGTTCATTT'TGTCAAT PMMA-06017- H6 TcAcTTGcTTc CGTTGAGGAAGGCACTTATTGG GRTcAGG -H6F 685bp PMA-06018-H6R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTAGT'TTCAATCTGTGG H7 PMA -06009- -H7fTcAcTTGcTTc cGTTGAGGTcAGGwTcTTcwTTcTATGc 641bp PMA-06010-H7r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCYcCCTTGTGCATTTTGATG PMA60H9rTACTTGcTT GTTGAGGAAGAGAATGGTccTAcATcGT H9 493bp PMA-06012-H9r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTG PMMA TcAcTTGcTrccGTTGAGGTccCACTrGGAATGcAGAA N1 -06013-Nf 328bp PMA-06014-Nlr TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTG PMA-06o15-N2f TcAcTTGCTTccG;TTGAGGATAGcATGGTccAGCTcAAG N2 299bp PMA-06016-N2r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTCCTG PMMA H2 TcACTTGcTTccGTTGAGGcGTcATTcTTCAGGAAcATGG -06019-H2F 229bp PMA-06020-H2RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGCC'TTGTTGCTATTTCwGG PMA06021-H4IF TcAcTTGcTTccGTTGAGGTTGTTAYY 'CCATTT GATGT (GCC H4 324bp PMA-06022-H4RTAMRA-GGTT'TCGGATGT'TACAGCGTGTRACTCTTCCAGGGTTGTT ？ H8PMA06023-H8F TcAe rTGcTTcc cGTTGAGGAAGGTTGGTcATAcATAGTGG 4444bp PMA-06024-H8R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCT'TACTAATGGTCTGG 0025-HoFTCACTTGCTTC HoPMMA GAcAAGATAAGcAccGG CGTTGAGGGATTGA 435bp PMA-06026-H10RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT'TTACTYACTCTACTAGGTGCTAT Hl1PMA CTTGcTTc CGTTGAGGACTTAGAAATGTCCCAGCAA 06027-HllFTCN 137bp PMA-06028-Hl1RTAMRA-GGTT'TCGGATGTTACAGCGTCATTTCCCTCGTCT'TTGGC rCACTTG;cTTccGTTG;AG;GAGTACAAG;AACAcC PMMA H2 -06035-H12F AGACATT 537bp PMA-06036-H12RTAMRA-GGTT'TCGGATGTTACAGCGTCTGGCCATCCGCCTTCTA！ TCcAcTTGcTTccGTTGAGGGAccCTTCTGcTccTcATG H3PMA-06029-H13F 474bp PMA-06030-H13RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGAAACTGATTGATTCCCCTGG Hl4PMA-06037-Hl4FTcACTTGcTTccGTTGAGGTcTcccGACTAAAcTGGcTA 247bp PMA-06038-Hl4RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGCCGCTCTGATTCCTTAC
GB/T27537一2011 表A.1续 序列(5'3' 长度 型别 引物编号 H15PMA-06031-H15FTCACTTGCTTCcGTTGAGGGACTcCTTGACTGAGATCTGG 305bp PMA-06032-H15RTAMRA-GGTTTcGGATGTTAcAGcGTAGTATcAcATcTTTGTAcccAc H16PMA-06033-H16FTCAcTTGCTTccGTTGAGGTAAAcTTcTcGTGCTAATcG 252 oo PMA-06034-H16RTAMRA-GG;TTTcGGATGTTAcAGcGTG;TcTTcAAcTTGATcccTTc N3PMA-06049-N3F TCACTTGCTTccGTTGAGGGGGAAAGARTGGATGCATGT 366bp PMA-06050-N3R TAMRA-GGTTTcGGATGTTAcAGcGTGTTGTTGATTcTCATCcAAGG V PMA-06039-N4F TcAcTTGcTTccGTTGAGGGGAAGCAATcGAcCCATGGAT [2叩 PMA-06o40-N4R TAMRA-GGTTTcGGATGTTAcAGcGTcGAcAcCcATcCATTAGCAT PMA-06051-N5F TCACTTGCTTCCcGTTGAGGACTGTTATTGGGTAATGACG 459l N PMA-06052-N5R TAMRA-GGTTTcGGATGTTACAGcGTTGcTTGTTTTGGTcCAAccG N6PMA-06041-N6F TCACTTGCTTCcGTTGAGGACCTAATAACAATGCTTcGG 246bp PMA-06o42-N6R TAMRA-GGTTTcGGATGTTAcAGcGTcAcTcTTcTATATGCTGTGC PMA-06043-N7F TCACTTGCTTCcGTTGAGGTGTGcCAGAGATAAYTGGCA 352bp PMA-06o44-N7R TAMRA-GGTTTcGGATGTTACAGcGTccGGAATAGcCTGAcCAATT N8PMA-06045-N8F TcACTTGCTTCcGTTGAGGGGGCAMTGATGTATGGATGG 340bp PMA-06046-N8R TAMRA-GG;TTTcGGATG;TTACAG(cG;TAAGAATAG;cTccATcGTGcc N9PMA-06047-N9F TCACTTGcCTTcCGTTGAGGTTcTATGCTcTCAGCCAAGG 310bp PMA-06048-N9R TAMRA-GG;TTTcGGATG;TTACAG(cG;TTGGCATAcGCATTcAGATTc 注:Y=(c,T),w=(A,T),R=(A.G 表A.2A型流感分型基因芯片探针 型 号 别 编 探针序列(5'3') 质控探针QCP PBA-08001-etrl TAMRA-CCTCAACGGAAGCAAGTGAT PBA-08002-etr2 NH2-T15-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG PBA-08003-etr3 NH2-GCTGCCTcGGCAAGGAGT-TAMRA Hl PBA-08004-HIla NHH2-Tl5-TGCTTATGTCTCTGTAGTGTCTTC PBA-08066-Hld NHH2-Tl5-AATAGAACCTGGAGACACAATAA PBA-08068-H1 NH2-T15-CGAGATATTCCCCAAGACAAGTT H3 PBA-08007-H3a NH2-T15-CCTCGGGGTTACTTCAAAATACG PBA-08008-3 NH2-T15-GGAAGCATTcCCCAATGACAAACC H5 NH2-T5-GTcAccAATAAGGTcAAcTcGAc PBA-08011-H5a PBA-08012-H5b NH2-Tl5-ACATAGAATGAGCAGGGGA H6 NH2-T15-TGAGATGTTTCCCAAAAGTACATGG PBA-08025-H6a PBA-08026-H6b NHH2-T15-ATGGGAACTGAAAGCATGAATTT H7 PBA-08013-H7a NH2-T15-CAGAcCcAAAcTcTATGGAAGTGGA PBA-08014-H71 NH2-T15-GTcAAACACAGACAATGCTGCTT NH2-T15CAAGGAAAGAcccAGcTcTGATAAT PBA-08065-H7e H9 PBA-08017-H9a NH2-T15CAAG.AcGcccAATACACAAATAAT NH2-T15-AAGcATGTTCAG.ATTcATTcTACAG PBA-08018-IH9b
GB/27537一2011 表A.2(续) 型 别 编 号 探针序列(5'一3' PBA-08019-Nla NHH2-T15-AGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTG PBA-08020-N1b NH2-T15-CAAGAGTTGGAGGAACAACATAcT PBA-08022-N2a NHH2-T15-GcGTTTGTATCAATGGAACTTGTA PBA-08023-N2b NH2-T15-ATGATGGGAAAGCATGGTTACATG H2 PBA-08027-H2a NH2-T15-ACATcCAACAcTGAATAAGAG(GTc PBA-08028-H2b NH2-T15-(GAACAAAGGACACTGTACCAGAAT H4 PBA-08029-H4a NH2-Tl5-GACAAAGGTCAACAATGGGGA PBA-08030-H4b NH2-Tl5-CTTCAACTGAcGCAGAACAAA H8 PBA-08031-H8a NH2-T15-TGGAGACATCATTTTCTTATGGG PBA-08032-H8b NH2-T15-(GCATcTTAcAAGAGAATAAGGcTATT H1o PBA-08034-H10a NHH2-T15-AAAACAACTTTGTGcCTGTGGT PBA-08035-H10b NH2-T15-CAcCAAGAAAAGAATGATcTGTATGG H1m PBA-08036-H11a NH2-T15-CAGTGAAATAGAGGAGAGGATAAACC PBA-08037-H11b NH2-T15-AGAAGGATGcTAAAGGACAATG H12 PBA-08045-H12a NHH2-T15-TAATCACAGGGAAATCACATGGC PBA-08046-H12b NH2-T15-CAcTAG;TAAGcAcTATATTGGGAA H13 PBA-08038-H13 NH2-T15-(GGATGAAGATTTACTG;GTATTTGATG PBA-08039-H13b NH2-Tl5-(G;TTCATGG;AG;TAGGAAATAcAAcc H14 PBA-08047-H148 NH2-T15-CCATCAAGcGATAATGAGCAAAc PBA-08048-Hl4b NH2-Tl5-TcTTATGTcAGGcTcTATcTCTGG H15 PBA-08040-H158 NH2-T15-GCATACAATTGACCTTGCAGATTC PBA-08041-H15b NH2-T15-CcGATGTGAcGATcCAATGTATG H16 PBA-08043-H16b NHH2-T15-GACAGAACATTAGACCTGCATGAT PBA-08044-H16e NH2-T15-ATCATGAGGACTACAAAGAAGAG PBA-08049-N3a NH2-T15-TATGTAGGGACAATTGGAAGGG PBA-08050-N3b NH2-T15-GATAATGATGcAAGTGccCcAGA PBA-08051-N4a NHH2-T15-GGCTATGTATGTAGTGGGATATTTG PBA-08052-N4b NH12-T15-GATGGcACAGGcTCATGTAATAG PBA-08053-N5a NH2-T15-(GTTTGCcGAGATAATTGGAATGG PBA-08054-N5b NH2-Tl5-AGGGAG;GTCACATTG;AAGAGT PBA-08055-N6a NH2-Tl5-GGcAGGAAATATATTAAGGAcTCA PBA-08056-N6b NH2-T15-CcCAGCTAATAACAGAGCAGAAAc PBA-08057-N7a NHH2-T15-ATGTTGAAAATACCTAATGCAGG PBA-08058-N7b NH2-T15-AAGGGATTCGGGTTTCTAAATGG PBA-08060-N8a NHH2-T15-AGCTcCATTGTGATGTGTGG PBA-08061-N8b NH2-T15-AACTTAAATTGGTcAGGATAcAGcG PBA-08062-N9a NH2-T15-TCATcACCACcCACAGTATACAA PBA-08063-N9b NH2-T15-AGAGcCAGGATGTCGATATGTA
GB/T27537一2011 B 附 录 资料性附录 试剂配制 B.1无RRNA酶的水 1000mL超纯水中加人1mlDEPC,37C静置1h,然后121C高压燕汽灭菌15min B.220×Ssc 用800m超纯水溶解175.3g氧化钠和88.2g柠檬酸钠,调节pH值至7.0,定容至1000ml 分装后121C高压蒸汽灭菌15min B.350XDenhardt's 50×Denhardt's试剂的成分为;1%(质量体积比)聚糖体400,1%质量体积比)聚乙烯此咯熔酮和 1%质量体积比)牛血清白蛋白 B.450%(质量体积比)硫酸葡聚糖 用900ml超纯水溶解500g硫酸葡聚糖,定容至1000mL B.54%质量体积比)SDs 用900m超纯水溶解40gSDS,调节pH值至7.2,定容至1000mL B.6PBs缓冲液 B.6.1A液(0.2mol/1磷酸二氢钠水溶液 Ho27.6《.游于超纯水中,定容至1o0md. NaHP(O B.6.2B液(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液 NaHPO7H.O53.6g(或NaHPO12H.O71.6g或NaHPO2H.O35.6g),溶于超纯 水中,定容至1000mL B.6.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制 0.2mol/LA液 14ml 0.2mol/LB液 36mL NaCI 8.5 g 1000mL 加超纯水定容至
GB/T27537?2011 B.7??I,??I?? ??I;2SsC,0.1%SDS(17.53?,8.82,pH ,ó?? 1000ml,1gSDs);??I;0.2ssC,0.1%sDs(1.753??,0.882g, pH=7,ó??1000mL,1gsDs);??:0.2ssc(1.753g?,0.882g ,pH=7,ó??1000mL) 10o
GB/T27537一2011 附 录 C 资料性附录 基因芯片的制备与检验 C.1芯片的设计方案 本芯片设计为每张经醛基修饰的玻片上含4个点阵,每个点阵的微矩阵为14×9阵列(见图cC.1) 芯片点样矩阵图包括5个部分:Qc为点样阳性参照.8个重复位点;NC为点样bufer参照.8个重复位 点;PC为杂交阳性参照,2个重复位点;N为空自参照,2个重复位点;其他位点为检测探针.HA亚型和 NA亚型(HlHl6,N1NN9)的52条特异性探针,每条探针2个重复位点 HH2H2QcQc H Hm HHNcNC Hm H2HH2IH3IH3IH3IH3H4IH4H4H4HI5HI5H5H5 H6H6H6H6H7H7H7H7 H7H7H7H7H8H8 H8H8H9H9H9H9H1oH1oHoH1oHlHl1H11H1 N NCH12H12H12HH12P PCH13H13H13H13 NC H14H1l4H14H14H15H15H15H15H16H16H16H16N N N N2 N2 N2N3N3 N3 N3N4 N4 NT N2 N4 N N5N5N55 66N6N67 N7N7 N7 N8N8 N8 N8 N9N9 N9 N9 QC NC QC 质控探针 PC 阳性探针; 阴性对照; NC N 空白对照; DP 检测探针(Hl~Hl6,NlN9). 图c.1芯片点样矩阵图 c.2芯片的制备 稀释好的探针按照芯片点样矩阵图点制到醛基基片上,即为点制好的芯片,保存期为12个月 C.3芯片的检验 从每批点制好的芯片中随机抽取2张,应为无色、透明,无缺刻,无划伤的玻璃片,对光观察能看到 有明显的4个点阵

动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程GB/T27537-2011

动物流感是由A型流感病毒引起的一种高传染性的呼吸道疾病，严重危害着动物的健康和畜牧业的发展。为了及时检测和控制动物流感的传播，科学家们开发了一种基于分型基因芯片技术的检测方法，即A型流感病毒分型基因芯片检测。

A型流感病毒分型基因芯片检测是一种高效、快速、准确的检测方法，能够同时检测多个A型流感病毒亚型，包括H1、H3、H5、H7等亚型，并可判断该病毒是否为疫苗株或野生株。

GB/T27537-2011是我国针对A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程，下面将介绍该规程中具体的操作步骤：

第一步：样本DNA提取

首先需要从病原体样本中提取出核酸（DNA），通常采用商业化的核酸提取试剂盒进行提取。注意事项包括：

• 必须避免污染，防止异物、其他细菌或病毒的混入；
• 严格按照试剂盒说明书操作，注意试剂保存和使用期限；
• 提取后的DNA应保持干燥，避免长时间暴露在空气中。

第二步：PCR扩增

将提取的DNA作为模板参与PCR扩增反应，通常使用特定引物对目标基因进行扩增，以增加信号强度并降低背景噪音。注意事项包括：

• 反应体系要准确配制，PCR条件需要优化，确保反应成功；
• 注意控制其它因素如环境、操作、质控等可能影响PCR扩增结果的因素；
• 必须采取防污染措施，避免异物、其他细菌或病毒的混入；
• 注意检查PCR扩增产物的品质和纯度。

第三步：芯片杂交

将PCR扩增产物与芯片上的探针进行杂交反应，形成互补杂交结构。通常需要对杂交条件进行优化，包括温度、时间、盐浓度和缓冲液条件等。注意事项包括：

• 芯片及其组成部分必须在无菌的条件下操作；
• 反应体系中的杂交反应条件需要优化，确保反应成功；
• 芯片在杂交过程中必须完全覆盖PCR扩增产物，避免出现漏洞和缺失区域；
• 注意控制其它因素如环境、操作、质控等可能影响杂交结果的因素；
• 杂交后需要对芯片进行洗涤和染色，以达到高灵敏度和高特异性的检测结果。

第四步：芯片扫描和数据分析

将染色后的芯片放入芯片扫描仪中进行扫描，获得图像信息，并通过计算机软件进行数据分析和解读。注意事项包括：

• 芯片扫描前需调整扫描参数并进行质量控制；
• 芯片图像处理需要遵循严格的标准化流程；
• 数据分析涉及到数据挖掘和模型建立等方面的知识，需要有专业人员进行。

综上所述，A型流感病毒分型基因芯片检测是一种高效、快速、准确的动物流感检测方法，可以有效地控制和预防动物流感的传播。但是在实际操作中需要注意各个环节的细节，以保证检测结果的可靠性。

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