动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR方法

动物源性饲料中骆驼源性成分定性检测方法PCR方法

国家标准 GB/T21100一2007 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法PCR方法 IdentificationofCamelidaederivedmaterialsinanimal wtetnatedtedstutts一PCRmethnd 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21100一2007 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、辽宁出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:陈颖吴亚君、徐宝梁、王晶、曹际娟、高宏伟、宗卉、黄文胜、袁飞、赵贵明 本标准首次发布
GB/T21100一2007 动物源性饲料中骆驼源性成分 定性检测方法PCR方法 范围 本标准规定了动物源性饲料中骆驼(Camelidae)源性成分检测的PCR方法,该检测方法的检出限 为0.1%质量分数). 本标准适用于动物源性饲料中骆驼源性成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1一2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 聚合酶链式反应polymerasechainreaction;CR 用于扩增位于两段已知序列之间的DNAdeoxyribonueleosideaaeid,脱氧核糖核酸)的方法 模板 DNA经过高温变性成单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTPde oxyribonueleosidetriphosphate,脱氧核苷酸三磷酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性,退火 和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经25个30个扩增 循环,扩增倍数达到约10 原理 利用裂解液破碎细胞，三氧甲婉抽提蛋白质,无水乙醉沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行 PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂 实验用水符合GB6682的要求 骆驼源性成分检测用引物对序列为: F;5’-AGCCTTCTCTTCAGTCGCACAC-3 R:5'-GCCCATGAAAGCTGTTGCT-3” TaoDNA聚合酶(TaqTher /,水生栖热菌. erm1usaquaticu 限制性内切酶:Taq酶 4 5. dNTP.dATP(doxsysdenosinetriphopharte,脱氧腺苷三磷酸),.dirTP(deoxsythymiadinetriphos
GB/T21100一2007 hosphate,脱氧胞昔三腾酸),dGTP(dee bhale,脱氧胸背三磷酸),dCTP(deoxwyeytidinetriphe eoxyguanosine triphosphate,脱氧鸟苷三磷酸 5.5琼脂糖;电泳纯 5 .6 溴化乙锭 5.7三氨甲烧 5.8无水乙醉 5.970%乙醉 5. ..10DNA分子量标准品(100bp一600bp)(bp:basepair ,碱基对. 5.11裂解液;1%cTAB(cetyltrithyla lammoniumbromide,十六婉基三甲基澳化铵),0.05mol/I.Tris HClpH8.0[Tris-;trishydroxymethylaminomethane,三(胫甲基)氨基甲炕],0.7mol/LNaCl 0.01mol/LEDTApH8.0)(ethylenediaminetetraacetieacid,乙二胺四乙酸) 5.12TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HClpH8.0),1mmol/LEDTApH 8.0) 5.1310×PCR缓冲液;l00mmol/LKCI,l60mmol/L.(NH,)SO,,20mmol/几MgSO,200mmol/L Tris-HClpH8.8),1%TritonX-100(toetylphenoxypolyethoxyethanol,辛基苯氧基聚乙氧乙醇)， albumin,牛血请蛋白. mg/mlBSA(bovineserum 5.14电冰缓冲液Tisdg,闹酸27.5g0.5ml儿TE缓冲液(pH8.o20m.加蒸溜水至100ml. 使用时10倍稀释 5.15澳化乙锭贮存液;用水配制成10mg/mL 55. 16加样缓冲液;0.25%澳酚蓝,40%(质量浓度)蔗糖水溶液 5. 17 酶切缓冲液;10nmol/LTis-HCl(pH7.5),10mnmol/LMgCl,50mmol/1Na(Cl,0.lmg/mlSA 仪器设备 6.1DNA热循环仪 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.3恒温水浴锅 6.4离心机:离心力12000 6.5微量移液器(0.5AL~10AL,l0AL100AL,lAL一200AL,l00AL~1000pL). 6.6电泳仪 6.7紫外检测仪 pH计 6 .8 6 天平;感量0.01g 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品粉碎,充分混合均匀后待用 检验步骤 8 样品的总DNA提取 样品粒度100目时最少称取50mg;60目时最少称取100mg;20目时最少称取200mg 称取样品于微量离心管中,加人600AlL800Al裂解液,65C3h,期间不时振荡混匀;12000从离 心5min,转移上清于洁净离心管中,加等体积酚,混匀;12000只离心5min,转移上清于洁净离心管 中,加等体积三氯甲烧十异戊醉(24+1),混匀;12000g离心5min,取上清液;加2倍体积冰预冷的无 水乙醇，一20C沉淀1h;12000g离心5min,弃上清液;70%乙醇洗涤一次,晾干;加人50ALTE,溶解
GB/T21100一2007 沉淀 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5LDNA溶液加双燕蒸水稀释至1ml,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A和Aw DNA的浓度按式(1)计算 c=A×N×50/1000 式中: -DNNA浓度,单位为微克每微升(4g/L); 260nm处的吸光值; N -核酸稀释倍数 当A/A比值在1.71.9之间时,适宜于PCR扩增 8.3PCR扩增 50AL反应体系:10XPCR缓冲液5ALdNTP(5mmol/LlL、引物对各5mol/L)2LTag DNA聚合酶2U,模板DNA100ng士50ng. -般反应程序:94C预变性5min,94C变性30s,63C退火30s,72C延伸30s,30个循环 72C 延伸5min 4C保存 检测过程中分别设阳性对照.阴性对照和空白对照 用已知含骆驼赢性成分的样品作阳性对照,用 已知不含骆驼源性成分的样品作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照 8 PCR扩增产物电泳检测 取2g琼脂糖,于10mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加人澳化乙绽贮存液至终浓度为0.5g/ml 制胶 在电冰糟中加人电冰缓冲液,使液面刚刚设过硬酸 将了,L8LrR扩地产物分别相适量 加样缓冲液混合,点样 9/em恒压电泳,直至祺酚蓝指示剂迁移至凝胶中部 紫外检测仪下观察电 泳结果并记录 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应 反应体系(20pL):TaqI酶2U,酶切缓冲液2L,加人PCR扩增产物至总体积20AL 酶切在65C或37c下进行,30min 酶切完成后电泳,方法见8.4 结果判断与表述 CR扩增产物电泳检测结果 9 阳性样品扩增产物为208bp(序列参考附录A). 9 限制性内切酶酶切电泳检测结果 扩增产物酶切片段大小为153bp和55bp 9 结果表述 3 PCR产物为阳性,同时酶切结果正确者判为含有骆驼源性成分,表述为检出骆驼源性成分; PCR产物为阴性者判为不含有骆驼源性成分,表述为未检出骆驼源性成分 1 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理
GB/T21100一2007 附录 A 资料性附录 PCR产物测序结果 AGCCTTcTCTTCAGTCGCACACATCTGcCGAGATGTTAACTACGGCTGAATCATTcGA TATTTACATGCTAACGGAGCTTcCATATTcTTCATTTGcTTATATATTCcAcGrGGGTcGc GGGcTTTATTACGGCTcGTATACCTTTTCAG.AAACCTGAAACGTTGGAATKGTTTTATTG TTCACAGTAATAGCAACAGCTTTCATGGGC