GB/T29375-2012
马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程
Codeofpracticeforin-vitrovirusfreeseedpotatoesplantletsbreeding
- 中国标准分类号（CCS）B05
- 国际标准分类号（ICS）65.020.20
- 实施日期2013-06-20
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
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马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程
国家标准 GB/T29375一2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 Coleofpraetieeforin-vitrovirustreeseedpotatoesplantletsbreeling 2012-12-31发布 2013-06-20实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29375一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出 本标准由全国蔬菜标准化技术委员会(SAC/TC467)归口
本标准起草单位:内蒙古大学内蒙古马铃薯工程技术研究中心、标准化研究院、甘肃爱兰马铃 薯种业有限责任公司、定西马铃薯研究所,重庆市薯类脱毒种苗快繁中心,秘鲁国际马铃薯中心北京联 络处、四川省凉山州良圆马铃薯种业有限责任公司、内蒙古希森马铃薯种业有限公司、成都科欣农业生 物工程有限责任公司、北京辛普劳食品加工有限公司、湖南农业大学园艺学院、东北农业大学农学院、华 ,桶建省农业科学院作物研究所,河北省郑州 南农业大学园艺学院、云南省宣威市马铃薯种薯研发中心 市蔬菜研究所、云南省丽江市农业科学研究所、农业科学院农业资源与农业区划研究所、内蒙古铃 田生物技木有限公司 本标准主要起草人;张若芳、杨丽、周爱兰、孙清华,昊蕾杜密茹、巩秀峰、王义、宋荣庆,李进福、 黄振霖、,谢开云,严欣、王官茂、,陈涛、曲仁山、熊兴耀、王凤义、曹先维,展康、汤浩、吴焕章、王绍林、罗其友、 李文刚
GB/T29375一2012 马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程 范围 本标准规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养,脱毒试管苗扩繁的技术要求和操作规程
本标准适用于马铃薯脱毒试管苗的培育,扩繁
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB18133一2000马铃薯脱毒种薯 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 叶原基leafprimordium 在茎尖生长点的基部形成的突起
3.2 茎尖stemtip 芽顶端部分(0.1mm一10mm)其中包括分生组织(0.05mm~0.1mm)及芽原基和正在发育的叶 原基
3 3. 茎尖分生组织meristem 茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群
3 离体培养in-yitropropagationm 从植物体分离出符合需要的器官、组织、细胞、原生质体等,通过无菌操作,在人工控制条件下进行 培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术
3.5 脱毒苗in-itrvirwsfreeplantlet 经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX),马铃薯Y病毒(PVY),马铃薯S病毒(PVS),马铃薯卷叶病 毒(PLR,马铃兽M病毒(PVM,马铃酱A病毒(PVA)和马铃兽纺锤块茎类病毒(PsTVa)的试 管苗 3.6 核心苗eoreplantlet 通过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒,经试种观察具有原品种典型性状的脱毒苗
基础苗besfcplamlet 由核心苗繁殖的、经检测无病毒的脱毒苗
GB/T29375一2012 试管苗生产车间 4.1布局原则 脱毒苗生产车间布局应遵循方便消毒、减少污染的原则,遵守操作流程
周围应无污染源,与大田 生产隔离
要具备更衣室、清洗室、配制室,灭菌室,无菌贮存室、接种室、培养室等,各房间应隔离
产环境应清洁、干燥,具有可提供充足自然和人工光源的组培室,车间或生产线
4.2布局平面示意图 培 养 室 入口 图1试管苗生产车间布局平面示意图 4.3设备、试剂 试管苗生产的组培设备,试剂参见附录A
卫生要求 4.4.1接种室、培养室应保持卫生,定期消毒,每周至少消毒一次
按照40%的甲醛和高锰酸钾21 的比例.40%的甲醛溶液10mL倒人5高瞌酸钾容器内(每立方米空间用量),进行熏蒸
密闭1 d 后,通风
4.4.2接种前接种室应强制过滤通风
4.4.3每次使用超净工作台前,应提前20min打开紫外灯
接种时关闭紫外灯打开风机,超净工作台 面及内壁用75%乙醇擦拭消毒
4.4.4操作使用的所有工具,使用前应灭菌
操作过程中锻子,剪刀、解剖刀等工具,每次使用前接触 植物材料的部分应灼烧消毒或插人高温灭菌器中灭菌.冷却后使用,避免交叉污染
工作人员应穿消毒工作服,用肥皂洗净双手,操作过程中,手和工作台面要经常用75%的乙醇 4.4.5 清擦 4.4.6若将温室作为培养室,在温室配备有降温水帘和风机,水帘外进风方向应加孔径0.247mmm 60目)网纱
温室内门口有缓冲间,在缓冲间应有消毒装置,可放人生石灰或其他消毒剂,工作人员进 人时鞋底消毒
4.4.7发现污染及时清除
GB/T29375一2012 茎尖脱毒与培养 脱毒材料的选取 5.1.1 田间选择 5.1.1.1在土壤肥力中等的地块,于现蕾期至开花期选择生长势强、具备原品种典型性状的健康植株， 做好标记
生育后期到收获期在已做标记的植株中进行薯块复选
选择无病斑、虫蛙、机械损伤而且皮 5.1.1.2 色、肉色、薯形,芽眼等性状符合品种特征的幼龄薯,清洗泥土后催芽作为脱毒材料;或选取健康且具备 品种典型性状植株的中、下部短枝茎尖或腋芽进行茎尖剥离
5.1.2病毒检测筛选 人选的块茎或植株,按照GB18133一2000中附录B的方法检测类病毒(PsTVd);按照GB18133一 2000中附录A的方法检测病毒
筛选无类病毒(PSTVd)的块茎或植株作为茎尖脱毒基础材料;若检 测到没有带病毒的块茎或植株,可直接剥较大的茎尖
其后可不经试种观察直接进行扩繁培养
5.1.3催芽处理和病毒钝化 5.1.3.1块茎可通过自然方法出芽或通过人工方法(用1%硫脉十5mg/L赤霉素的溶液浸种5 min 打破休眠催芽
自然出芽的情况下,块茎长出2 5.1.3.2 cm3cm的新芽
对含有S病毒、X病毒的块茎需置于 7C土1C培养箱中处理3周一4周,钝化病毒
人工打破休眠催芽的情况下,可采用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%乙醇喷湿进行表 面消毒,置于25C黑暗条件下催芽;或播种于含水量20%灭菌细沙中发芽(水中含5mg/L多菌灵),块 茎长出2cem3em的新芽
对含有s病毒、x病毒的块茎需置于37C士1C培养箱中处理3周~ 4周,钝化病毒
5.2茎尖培养 5.2.1茎尖培养基的制备 5.2.1.1茎尖培养基配方参见附录B 5.2.1.2将制备好的茎尖培养基快速分装于容器中,用封口膜封口
5.2.1.3将盛有培养基的容器整齐排列于灭菌锅内,l.1kg/cm'、121笔高压灭菌20min,冷却后在无 菌贮存室放置3d一5d,无污染的培养基放到超净工作台备用 5.2.2材料消毒 取经催芽处理和病毒钝化处理的块茎的顶芽、2em3cm的侧芽,剪去外叶,用自来水冲洗30min 后,移人接种室进行严格消毒
先用75%乙醇浸泡30s,再用50/L的漂白粉液浸泡7nmin10minm 或0.1%的氯化汞溶液浸泡5min10min,然后用无菌水冲洗4次一5次
5.2.3茎尖剥离与接种 接种在超净工作台上操作
剥去外叶,借助40×双目解剖镜,剥离茎尖直至露出半圆形光滑生长 点,用解剖刀或解剖针从0.lmm~0.3mm处切,带1个2个叶原基
迅速接种于盛有茎尖培养基 的容器中,进行离体培养
用酒精灯烤干容器口并封口,在容器上注明编号、品种名称,接种时间
GB/T29375一2012 待看到明显伸长的小茎、叶原基形成可见的小叶时,转移到盛有MS培养基(配方参见附录C)的容 器内培养,培养成带4个5个叶片的试管苗
5.2.4培养条件 试管苗在温度20C一25C,相对湿度70%光照强度2000lx一3000lx的条件下培养,光照时数 16h/d
病毒检测 将试管苗按瓶上的编号,在超净工作台内将每株的上部1/31/2茎段转人新的培养瓶中,编号 不变
同时再将植株下部1/31/2的茎段装人病毒检测的样品袋中
取样时样品不能粘有培养基
6. 2 6 检测方法按照GB18133一2000的附录A执行
筛选出不含PVX、PVY、PVS,PLRV,PVM、 3 PVA病毒的脱毒苗
试种观察 经检测不带病毒的试管苗进行试种观察
将每个试管苗取出一部分移栽到防虫网棚,结出的小薯 种植到田间试种观察,检验其是否发生变异,符合原品种的典型性状的脱毒即为核心苗
基础苗培养 8.1在超净工作台上对核心苗切段扩繁
将培养容器置于超净工作台上,瓶口用75%乙醇擦拭消毒， 用毁子取出核心苗,按单茎节切段,每个切段至少带1个叶片
8.2操作时将剪下的切段腋芽朝上插人Ms培养基(配方参见附录C)或其他脱毒苗扩繁培养基上配 方参见附录D),用酒精灯烘烤瓶口,用封口膜封好,注明编号、品种名称和接种时间
8.3培养条件;置于温度22C,相对湿度70%、光照强度2000 l 3000lx,光照时数16h/d的条件 下培养
基础苗保存 选择保存培养基(配方参见附录E)保存基础苗
将基础苗置于温度1316C、相对湿度70%、光照强度3000lx,光照时数10h/d14h/d的 条件下使其缓慢生长,继代培养出一定数量的脱毒苗保存 10扩繁 10.1常规扩繁 10.1.1扩繁前检测基础苗是否带病毒(PVX、,PVY,PVs,PLRVv,PVM,PvVA)和类病毒(PsTvd)
检 测方法参照第6章执行
10.1.2选择用MS固体培养基(配方参见附录C)或其他扩繁培养基(配方参见附录D).
10.1.3将配制好的培养基装人容器中,每瓶加人1/5容量的培养基,用封口膜封口;置于1.1kg/cnm" 灭菌锅121C高压灭菌消毒20 1,取出后放置3d5d待用
min
GB/T29375一2012 10.1.4检测合格的基础苗在超净工作台上切段扩繁
将培养容器置于超净工作台上,瓶口用75%乙 醇擦拭消毒,用长把锻子取出脱毒苗,按单茎节切段,每个切段至少带1个叶片
10.1.5操作时将剪下的切段腋芽朝上插人培养基上,用酒精灯烘烤瓶口,用封口膜封好,注明编号、品 种名称,接种时间
10.1.6培养条件为;白天23C一25C,夜间16C20C,光照强度2000lx一3000lx,光照时数 16h/d,培养21d~25d
10.1.7待长出7片一8片叶片后可再次切段繁殖
脱毒苗一般间隔25d左右继代繁殖一次
10.2水培扩繁 10.2.1在温室中培育
培养基为1/4MS液体培养基 10.2.2 使用1cm厚的泡沫板做支撑物
密度拨3cm义3cm打孔.孔径为0.7 mm
在切转操作时.,将小苗的顶芽及基部剪掉,剪成带4个一5个叶片的茎装段插人泡沫板中培养
10.2.3 11 壮苗培养 11.1扩繁的脱毒苗移植前,最后一次扩繁需接种到壮苗培养基(配方参见附录F)上培养
11.2置于温度22C一25C,光照2000lx3000lx,光照时数18h/d的条件下,培养至株高6em 7cm准备定植
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GB/T29375一2012 D 附 录 资料性附录 扩繁培养基配方 表D.1 母液成分 化学试剂 质量浓度 硝酸钾(KNO. 1900mg/L 硝酸铵(NHNO. 1650mg/L 大量元素 磷酸二氢押(KH.Po 170mg/1 氧化钙(CaCl
2H.o) 440mg/1 硫酸镁(MgSO7H.O) 370nmg几1 碉酸(HBO. 6.2mg/几 硫酸(MnSO4H.O 22.3mg/1 钼酸钠(NaMo(O2H.O 0.25mg/几 微量元 硫酸锌(ZnSO
4H.O) 8.6mg/L 碘化伊(KD) 0.83mg/L 硫酸铜(Cuso5H.o) 0,025mg/L 氯化(CoCl6H.O) 0.025 mg/ 硫酸亚铁(FeS(O7H.O) 27.8mg/1 铁盐" 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O) 37.3mg/L 蔗糖 25g/L 其他 倍力凝 4.5g/L一5g/I 注1;本配方pH为5.6一5.8.
注2;可用卡拉胶或琼脂替代倍力凝
铁盐母液的配制:两种试剂分别称量并分别加热溶解,待两种试剂均溶解后混合,混合后的溶液继续加热使其 充分赘合,冷却后定容备用 10o
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GB/T29375一2012 附录 资料性附录 壮苗培养基配方 r.1MS十30g/1食用白糖,液体培养,pH5.8. F.2MS双倍大量元素十微量元素十30g/1食用白糖,液体培养,pH5.8
r.3MS无机成分十0.4mg/L维生素B十30g/L食用白糖十4.2g/L卡拉胶十5.0mg/儿L一8.0mg/L 维生素B,pH5.8.
马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB/T29375-2012
马铃薯是我国重要的经济作物之一，其种植面积和产量均居世界前列。然而，长期以来，马铃薯种植过程中遭受病虫害的侵袭，对马铃薯生产造成了极大的危害。为此，我们开发出了马铃薯脱毒试管苗繁育技术，该技术在保证马铃薯品质的同时也提高了种植效率。
马铃薯脱毒试管苗繁育技术，顾名思义就是通过在无菌环境下进行培养，使得马铃薯苗不受外界病菌的影响。在此基础上，我们对该技术进行了深入研究和推广，制定了相应的标准GB/T29375-2012。
根据GB/T29375-2012标准的要求，在进行马铃薯脱毒试管苗繁育时，需要注意以下几点：
- 选取健康的马铃薯作为材料，进行芽插或切块。
- 将马铃薯芽或块进行表面消毒处理，并在无菌条件下培养1-2周左右，直至生长出健康的小苗。
- 将小苗移植到含有适当营养物质的培养基中，进行进一步的生长。
- 检测小苗是否获得脱毒效果，可以采用病原学检测或鉴定法进行确认。
通过马铃薯脱毒试管苗繁育技术，可以保证种植过程中不受外界病菌的影响，减少病虫害发生率，从而提高收成率。同时，这项技术还可以以较低的成本、较短的时间、较少的空间完成繁育工作，为马铃薯种植业带来了巨大的经济效益。
总的来说，马铃薯脱毒试管苗繁育技术已经逐渐成为马铃薯产业发展的新方向。我们应该积极推广这项技术，引导农民加强对马铃薯种植过程的管理和监控，实现高效、健康的马铃薯种植技术。
