饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应（PCR）法

饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚合酶链式反应（PCR）法

国家标准 GB/T28642一2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法 RapiddeterminationofSsalmonellaspp.inanimalfeedingstufls CRmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28642一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口 本标淮起草单位;农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心(沈阳) 本标准主要起草人张秀芹、张建勋、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月
GB/T28642一2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应(PCR)法 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的快浊检测的PCR方法 本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T13091 GB/T14699.1饲料采样 GB19489实验室生物安全通用要求 sN/T1193基因检验实验室技术要求 sN/T1870食品中致病菌检测方法实时PCR法 原理 利用沸水浴使菌体细胞破裂,释放基因组DNA,离心使细胞壁等有形物沉淀,以上清液为模板进行 扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682的要求 4.1沙门氏菌检测用引物(对)序列为 SalF:5'-TcGCAccGTCAAAGGAACcGTAAAGC3' SalR;5'-GCATTATcGATCAGTACCAGCCGTCT-3" 4.2PremixTaq缓冲液(2×);内含TaqDNA聚合酶1.25U/25L4mmolMg+,dNTP 各0.4mmol 4.3琼脂糖:电泳级 4 Marker2000. .5缓冲蛋白陈水(BPw);见A.1 4.6大豆蛋白陈肉汤(Rvs);见A.2 4.7亚晒酸盐胱氨酸增菌液(SC):见A.3 4.810倍上样缓冲液(10Xloadingbufer)10.05%的澳酌蓝,50%丙三醉游液,1%的sDs. 4.9质控菌株:沙门氏菌阳性标准菌株 4.1050×TAE缓冲液:见A.4
GB/T28642一2012 4.111×TAE缓冲液见A.5. mg/mL)见A.6 4.12涛化乙锭(5m 注;4.2和4.8缓冲液为商品化成品 以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代 仪器设备 5.1PCR仪 5.2恒温水浴锅 5.3离心机:离心转速12000g 5.4微量移液器 5.5电泳仪 .6 凝胶成像仪 5 5.7天平;感量O.o只 5.8电热恒温培养箱 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品充分混匀后密封低温保存待用,注意整个过程中不要将样 品人为污染 检验步骤 7.1样品的增菌及模板的制备 取25g样品于225ml的缓冲蛋白陈水(IBPw,4.5)中,37C士1C培养18h士2h进行预增菌,取 0.1 lmL预增菌液转移至10mL大豆蛋白陈肉汤(RVs,生.6)培养基内1.5C士1C培养24h土3h. 同时取10mL预增菌液于100ml亚晒酸盐胱氨酸增菌液(sC,4.7)中37C士1C培养24h士3h,进 行选择性增菌,取选择性增菌液1mL于离心管中1000反离心10mm,弃上清，lmL无菌去离子水愁 浮离心10min,弃上清,再用0.2mL无菌去离子水悬浮,95C水浴20nmin,将离心管迅速转移至冰浴 中使其迅速冷却,用涡旋仪混匀裂解物,20C25C下10000g离心3min,转移上清至新鲜管中备用 模板制备可选用商业试剂盒) 检测过程中分别设阳性对照和阴性对照,用添加沙门氏菌阳性标准菌 株的样品作阳性对照,用不含沙门氏菌的样品作阴性对照 7.2PCR扩增 50A的反应体系,在0.2mL，的反应管中,PremixTaq缓冲液(4.2)25AL,模板4AL,浓度为 204mol/I的上下游引物各1AL,去离子水19AL 反应程序为;94预变性2min,30个循环94C变性1min,58.4丫退火40s,72C延伸30 S; 72C终延伸7min后4C保存 3 7 电泳检测CR扩增产物 取1.5g琼脂糖(4.3),于100mL1×TAE缓冲液(4.11)中加热,充分熔化冷至65笔左右的时 候,加人10l澳化乙锭(4.12),充分混匀,根据需要在模板内放人合适的梳子,制成约5mm厚的胶 块 在电泳槽中加人1×TAE缓冲液,使液面没过凝胶2mm3mm 将6l8l.的PCR扩增产 物与1L.10倍上样缓冲液(4.8)混合后点样,取6LMarker20004.4)点样 5V/cm一8V/cm恒 压电泳,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部,用成像仪进行凝胶成像
GB/T28642一2012 结果表述 在阴性对照于330bp处未出现条带,而阳性对照在330bp处出现扩增条带的条件下,如待测样品 在330bp处未出现相应大小的扩增条带,则可报告待测样品未检出沙门氏菌;如待测样品在相应处出 现扩增条带,则为疑似阳性样品,此时需用GB/T13091进行确证,最终结果以后者检测结果为准 对 于疑似阳性样品,可以对其扩增产物进行测序,结果参照附录B. 如果阴性对照出现条带和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带,本次待测样品的结果无效,应 重新进行检测,并排除污染因素 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193,SN/T1870和GB19489的要求执行 10 废弃物处理 检测过程中的废弃物及一切可能被污染的物品均应做无害化处理
GB/T28642一2012 附录 A 规范性附录 培养基及缓冲液的配制 A.1缓冲蛋白陈水(BPw) A.1.1成分 蛋白陈 0.0g 5.0 氯化钠 g 9.0g 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 1.5g 燕僧水 1000ml pH7.0 A.1.2制法 按上述成分分配好,校正pH,分装于大瓶中,121C高压灭菌20min,临用时分装在500mL无菌 瓶中,每瓶225ml,或配好后校正pH,分装于500ml瓶中,每瓶225ml,121丫高压灭菌20min,冷 却备用 A.2大豆蛋白陈肉汤(RVs) A.2.1溶液A A.2.1.1成分 蛋白陈 5.0g 8.0 氯化钠 g 1.4 磷酸二氢钾 8 磷酸氢二钾 0.2 8 蒸僧水 1000mml pH7.0 A.2.1.2制法 将各成分加人蒸憎水中,加热至约70C溶解 此溶液需当天使用 A.2.2溶液B A.2.2.1成分 氯化锁 400.0g 燕僧水 1000ml A.2.2.2制法 将氯化镁溶于水中
GB/T28642一2012 A.2.3溶液c A.2.3.1成分 0.4g 孔雀绿 蒸水 100ml A.2.3.2制法 将孔雀绿溶于水中 溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中 A.2.4完全培养基 A.2.4.1成分 溶液A 1000ml 100mL 溶液B 10mL 溶液c A.2.4.2制法 按上述比例配制,校正plH,使灭菌后pH为5.2,分装于试管中,每管10ml l15C高压灭菌 15min 冰箱保存 A.3亚晒酸盐胱氨酸增菌液(SC) A.3.1基础液 A.3.1.1成分 胰蛋白脉 5.0g 乳糖 4.0g 0.0x 磷酸氢二钠 4.0 亚晒酸钠 g 1000mL 蒸榴水 pH7.0 A.3.1.2制法 溶游解前三种成分于水中,煮沸5min,冷却后,加人亚晒酸纳校正pH后分装,每瓶1000mL. A.3.2L-胱氨酸溶液 A.3.2.1成分 L胱氨酸 0.lg 5mL mol/L氢氧化钠溶液 3.2.2制法 A， 在无菌环境中,用灭菌水将上述成分稀释到100mL,毋须蒸汽灭菌
GB/T28642一2012 A.3.3完全培养基制备 1000ml 基础液 10mL L-胱氨酸溶液 pH7.0 基础液冷却后,以无菌操作加L-胱氨酸溶液,将培养基分装于适当容量的灭菌瓶中,每瓶100mL 注:培养基在配制当日使用 A.450xTAE缓冲液 A.4.10.5mol/LEDTAp8.0 取二水乙二胺四乙酸二钠186.1g,加人800mL蒸僧水充分搅拌,加10mol/L的氢氧化钠调解 pH至8.0,待完全溶解后,定容至1L 高压灭菌 A.4.2制法 Tris碱242.0g溶于700mL的水中,加人0.5mol/LEDTApH8.0100mL,冰乙酸57.1mL 充分溶解,用水定容至1L A.51xTAE缓冲液 取20mL50×TAE,加水定容至1000mL Tris-乙酸终浓度为0.04mol/L,EDTA终浓度 为0.001mol/L A.6澳化乙锭(5mg/mL 取溴化乙锭0.0500g溶于10ml水中
GB/T28642一2012 B 附 录 资料性附录 PCR产物测序结果 沙门氏菌阳性菌株PCR产物测序结果(331bp)如下 \AccGTAAAGu TcGCAccGTcAAAGGA CTGGCTTTcTcTTTcCCAGTAcGcTT CGccGTTcGcGCGcGGCAT GCCTTCAAATcGG( TCCGCATCAATA ATCAATACTCATCTGTTTACCGGGCATA \AAATcCGGGCCG AGAGA CGACTTcCGCGA CGCGTTCTGAACC1 cTTTGGTAATAACGATAAACTGGACC ACGGTGACAATAGAGAAGACAACAAAACCCACCGCCAGGCTATcGCCAAT AACGAATTGCCCGAACGTGGCGATAATTTCACcGGCATCAGCTTCAATCA AGATAAGACGGCTGGTACTGTCCGATAATGC

饲料中沙门氏菌的快速检测方法——聚合酶链式反应（PCR）法GB/T28642-2012

沙门氏菌是一种常见的食源性病原体，其感染可以引起人和动物的胃肠道疾病，甚至危及生命。因此，对于含有沙门氏菌的食品和饲料进行快速检测具有重要意义。

聚合酶链式反应（PCR）技术是一种高效、敏感、特异性强的分子生物学技术，被广泛用于病原体的检测和鉴定。GB/T28642-2012标准规定了饲料中沙门氏菌的PCR检测方法，该方法具有操作简便、灵敏度高、准确性好等优点。

下面是该方法的主要步骤：

• 1. 样品制备：将样品加入含有抗生素的缓冲液中，振荡混匀后离心沉淀。
• 2. DNA提取：使用商用DNA提取试剂盒或自制方法提取样品中的DNA。
• 3. PCR扩增：将提取的DNA作为模板，在PCR体系中反复扩增沙门氏菌特异性片段。
• 4. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据特定大小的PCR产物进行沙门氏菌的检测和鉴定。

总之，聚合酶链式反应（PCR）法GB/T28642-2012是一种快速、灵敏、可靠的检测饲料中沙门氏菌的方法，可以为保障食品安全提供有力的技术支持。

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