禽流感病毒NASBA检测方法

禽流感病毒NASBA检测方法

国家标准 GB/T19440一2004 禽流感病毒NASBA检测方法 ProtoeolofdeteetingavianinfluenzavirususingNASBs 2004-02-14发布 2004-02-15实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 小 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19440一2004 前 言 禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起,其中高致病性禽流感因其传播快,危害大， 世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疾病,我国将其列为一类动物疫病 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当,并 具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点 本标准是在综合我国科研成果的基础上,参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000年版),并结 合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的 本标准附录A、附录B附录C为规范性附录,附录D为资料性附录 本标准由上海市质量技术监督局和上海出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位;上海出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片 开发有限公司 本标准起草人;单松华、刘乐庭,倪旦红,胡永强、李树清
GB/T19440一2004 禽流感病毒NASBA检测方法 范围 本标准规定了NASBA快速检测禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定 本标准适用于禽类、禽肉产品中所有亚型禽流感病毒的快速检测、诊断 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T18936一2003高致病性禽流感诊断技术 原理 NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification,NASBA,依赖核酸序列的扩增技术)是一项连 续,等温,基于酶反应的核酸扩增技术 该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H,噬菌体T7核糖 核酸聚合酶)和两条寡核苷酸引物 上游引物5'末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的 启动子序列,下游引物的5'末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列 在扩增步骤中,两个5' 端都整合进扩增序列中,这样既成为产生互补RNA序列的模板,又能特异性结合检测步骤中的ECL 探针 扩增底物与ECL探针形成复合物,携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获 电极上的电压 引起电化学发光(ECL)反应 已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成 比例对应 材料准备 4.1试验环境 干净的环境,最好分区 分为能殿挺取.核酸扩增和核酸检测三个区 4.2器材 采用常规的分子生物学器材,包括一次性手套、移液器(量程5L到200L)枪头,无RNA酶的 1.5m塑料离心管、1.5mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精 度土2C),加热器,水浴锅、5nmL聚丙烯试管(VwR)、封口膜 如果采用CI方法,需要NucliSens阅读器或者其他等同仪器 如果采用ELISsA方法,需要酶标仪 4.3引物 上游引物AATTcTAATAGATcAcTATAcGGAGAAGGA(AG)GccATTc' TTGGACAAA(G/T)CGTcTA 下游引物GATGCAAGGTcGCATATGAGGAGACTTCTAACcGAGGTcGAAACG TA 检测试剂 所有检测试剂在使用前,使其达到室温 裂解缓冲液;5mol/L异硫氢酸呱,10%TritonX-100,10mmol/LTris-HCl,pH8.3; a b)冲洗缓冲液:5mol/L异硫氢酸呱,10mmol/LTris-HCI,pH8.3;
GB/T19440一2004 500mg/ml硅土;500mg/mL盐酸活化的二氧化硅; ce 洗脱缓冲液;10mmol/LTris-HCl,pH8.3; 酶溶液(参见附录A); e 捕捉探针:10mmol/L生物素化寡聚核苷酸; 探针序列为Biotin-CcGTCAGGCccccTcAAAGCcGA 电化学发光法属别检测探针(10mMgenerieECL.detectionprobe):钉标记的DNA寡聚核 g 苷酸; ECL序列为GATGCAAGGTcGCATATGAGCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA h 仪器调试参照液:10mnmol/L NASBACP mmol/LTris-HClpH8.3;3mmol/L NASBA-ECL 检测稀释液:15mmol/LTris-HCl,pH8.3; mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl. 分析缓冲液50 mmG nol/1Tris-HCl,pH8.3;l1×PBs(137 10mmol/儿NaHPO,2mmmol/IKHPO); k)清洗液;l00mmol/LKOH,l0%SDs,10%TritonX-100, l 无水乙醇alcohol 4.5样品采集、保存、处理 按GB/T189362003中2.1进行 操作方法 5.1核酸释放和提取 按以下顺序 将0.1mL样品加人盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合; a 振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50L b 振荡混合均匀 室温下温育10min(每2min振荡混合一次,防止硅土沉淀) d 在12000r/min下离心裂解缓冲液管30s 小心移除上清液(不要搅动沉淀)后,向每个管中加人1ml冲洗缓冲液 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止 g 在12000r/min下离心30s,然后移除上清液 h 重复第)步到第h)步的步骤 依次为一次使用冲洗缓冲液;两次使用70%乙醇;最后一次使 用100%乙醇， 最后一次洗涤步骤后,用移液器小心移除残余乙醇; k3) 使用加热器在56C敞口干燥硅土10min(用薄纸覆盖每个管避免污染); 干燥后向每个管加人50L洗脱缓冲液; m)振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮 n)56C温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸(5min后开始振荡试管) 在12000r/min下离心2nmin; p)将5AL核酸上清液转移至新试管,在1h内开始扩增反应 以上步骤也可采用Qiagen试剂盒或者其他等同试剂盒进行 核酸扩增 5. 2 按以下顺序 向上述5A核酸[5.lp)]中加人10L扩增试剂参见附录A); a b)65C温育5min
GB/T19440一2004 41C温育5min: ce 加人5L酶溶液(参见附录B),并用手指轻轻扣击试管促使混合均匀 N e 放回试管,并继续在41C温育5min; fD 将试管稍作离心后,在41C温育90min 检测扩增产物 g h)在一70C下保存扩增产物不超过30d. 5.3核酸检测 按照以下步骤或用ELISA进行检测 将(N'十2)个5ml聚丙烯试管进行编号 试管1作为空白对照; a b 振荡混合,除了试管1外,其余试管各加人20L杂交溶液(参见附录C); 试管2中加人5L检测稀释液作为空白对照; d 其余试管各加5ALRNA扩增产物; 封口膜封住所有试管,振荡混合; 所有试管41C温育30nmin 每10nmin混合一次 除了试管1外,其余试管各加人0.3ml分析缓冲液; g h)振荡仪器调试参照液直至不透明,然后加0.25mlIRS到试管1; 把试管放在转盘式传送盘的适当位置上; 运行NucliSens阅读器,对数据进行分析和解释(参见附录D). 结果判定 通过大量分析已知阴性对照样品后确定NASBA/ECL的临界值为0.15×仪器参照溶液的数值 样品的读数超过临界值时,判为禽流感病毒阳性,低于临界值时,判为禽流感病毒阴性 1 N为样品数
GB/T19440?2004 ? A 淶?? ? ? A.1 ????10mg,4nmmmol/LNTP,15mmol/LDTT,40mmol/MgCl,; a b)???;l00mmol/I.Tris-HclpHH8.32mmol/I.dNTP 00mmol/??; c d)10mnmol/L DEPC? ? ?м80nL???,???; a b)???м16L??14LDEPC?,?? 10L,?? c d); 30min?á ?B 淶?? ?? B.1 ? ????(G.5mg)1.3U/LAMV-RT,0.5U/LRNaseH,1.3U/LT7RNA ?,100mmol/1.Tris-HClpH8.3,10%BSA; ???;0.42ug/nLSA b ??? ?м55???,?20min: a b)?????; ?κκ?? ??, d 60min?á
GB/T19440一2004 附 C 录 规范性附录 杂交溶液的配制 C.1配制材料 捕捉探针:l0mmol/L生物素化寡聚核苷酸 a b电化学发光法属别检测探针(10mMMgc enerieECLdeteetionprobe);钉标记的DNA寡聚核 苷酸 C.2杂交溶液制备 振荡通用型捕捉探针和ECI探针直到形成不透明溶液 a 对于N次特异性检测反应,在新试管中混合(N十2)×10aL捕捉探针和(N十2)×10L bb ECL探针 c 使用前稍作振荡 d 在60min内使用 录 附 D 资料性附录 NueliSens阅读器的操作运行 建立一个新的运行程序 D.1 D.1.1打开NueliSens阅读器的个人电脑 D.1.2在开始界面点击“Prime”来执行系统校准 D1.3机器准备好后点击"star" 校准步骤大约持续了mim. D.1.4在登人(log-in)界面的用户名(username)上选择“Serviceengineer”并且点击“I.ogin” 不需要 输人密码 D. 1 .5 在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“Newrun"” D.1.6在弹出的工作表界面点击“yes” 输人文件名(不超过8个字符)并且点击“ok" D.1.7 D.1.8一个工作表单会打开,在分析选择栏(selectedassay)选择“Freetube” D. 1.9输人样品号并且点击“Addtolist” D.1.10重复上述步骤直到输人所有样品ID. D. 输人所有样品号后点击“Close”键 12 屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表 检查工作表,检查无误后点击“ok” D. D.2确定样品放在转盘式传送盘(instrunmentcarousel)上,并且按照计算机中输人的样品ID顺序摆放 unworklist” D.3在屏幕上方选择“Routine”菜单然后点击“Ru D.4出现一个检查弹出窗口,点击“Proceed” D.5检测开始(每个试管用时大约1.5min) .6检测停止后,在屏幕左上方选择“Routine”菜单然后点击“Sampleresult”或者“Assayresult”显 示结果