猪流感病毒分离与鉴定方法

猪流感病毒分离与鉴定方法

国家标准 GB/T27536一2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 Isolatioandidentificationofswineinfluenzavirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27536一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标推起草单位;农业科学院哈尔滨兽医研究所 本标准主要起草人:乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰
GB/T27536一2011 猪流感病毒分离与鉴定方法 范围 本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法 本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定 试验材料、试剂 2.1剪刀、慑子 2.21mL注射器 2.3单道及多道微量移液器、吸头 911日龄SPF鸡胚 2.5 犬肾细胞(MDCK) 2.66孔培养板 2.7DMEM培养基 2.8HEPEs缓冲液(mol儿储存液》. 2.9胎牛血清 2.10TPCK-胰蛋白酶(胰蛋白酶经TPCK处理)》. 2. .110.01mol/儿pH7.0~7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(参见附录A中A.l) 3 .12磷酸盐缓冲液(pH5.9)(参见附录A中A.5) .13 0.85%生理盐水(参见附录A中A.2). 2. 2 .14阿氏(Alsevers)液(参见附录A中A.3). 150.5%红绸胞悬液(参见附录A中八.1. 2 R6 2 胎球蛋白(参见附录A中A.6). 2 17 过碘酸盐(参见附录A中A.7). 2 .18亚碘酸盐(参见附录A中A.8). 2. .19硫代巴比妥酸(参见附录A中A.9 2.20无菌蒸憎水或去离子水 仪器 生物安全柜(柜内负压,有HEPA过滤器可避兔细胞培养物污染及保护操作人员安全》. 3.2孵化器 培养箱 3.3CO 台式高速冷冻离心机 3.537C水浴加热器 3.6煮沸锅 棉拭子医用棉签) 3.8研磨器
GB/27536一2011 样品采集与处理 样品的采集 病死猪,取肺脏或气管分泌物;待检活猪,用棉拭子(医用棉签)采集鼻腔深部分泌物 样品的保存 样品应置于特定的样品保存液中进行保存 一般采用磷酸盐缓冲液(pH7.0~7.4,0.01mol/L) 0.85%生理盐水或者不含血清的细胞培养液作为保存液(含青霉素2000IU/ml、链霉素2000IU ml.制霉菌素1000IU/mL.牛血清白蛋白5mg/ml) 样品采集后应置于加冰的保温箱中,密封 24h内送至实验室进行处理或置一70C保存 4.3样品的处理 用勇刀采组织病料置于研磨器中,按质量体积比(a:1)加人样品保存液进行研磨;将棉拭子置于装 有1mL样品保存液的离心管中,用锻子充分挤压后弃去拭子 以上样品室温静置作用30min,4c 3000r/min离心5min,取上清作为接种材料 样品接种 鸡胚培养 mL注射器吸取处理好的样品,以0.2mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种911日龄sPF 鸡胚,每个样品接种3个胚,于35C一37C孵化箱内孵育72h一96h,弃去24h内死亡鸡胚 孵化至 96h将鸡胚制冷后,无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水 5.2细胞培养 在生物安全柜中操作,将60%80%长满单层的MCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液(不 含胎牛血清,含有TPCK处理的胰酶2g/ml的DMEM培养基)洗三次,加人适量的处理样晶,置于 5%cO.,37C培养箱中培养1h2h,期间每隔30min轻轻摇动一次 感作完毕,弃去感作物,用含 有胰酶的培养液洗三次,加人适量的细胞维持液,5%cO.,37C培养箱内继续培养5d7d,期间观察 细胞病变(CPE)的形成情况 如出现CPE(特征病变为;细胞肿胀圆化,细胞间隙增大,细胞核固缩或 破裂,严重时细胞部分或全部脱落),收集细胞培养上清 5.3结果判定 收获鸡胚液或细胞培养上清,测定其血凝活性(具体操作见6.1) 若HA反应阳性说明可能有粘 病毒科的病毒,应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定;若无血凝活性或血凝价很低,应盲传35代， 若仍阴性,则认为病毒分离阴性 亚型鉴定 6.1IHA试验 6.1.1在微量反应板的112孔均加人0.05mLPBS,换吸头 2 6.1. 吸取0.05ml待鉴定病毒液,加人第1孔,反复抽打35次混匀
GB/T27536一2011 6.1.3从第1孔吸取0.05mL病毒液加人第2孔,混匀后吸取0.05mL加人第3孔,如此进行对倍稀 释至第11孔,从第11孔吸取0.05mL弃之,换吸头 第12孔作为红细胞对照 6.1.4每孔均加人0,05ml.0.5%体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人. 130min 6.1.5轻轻混匀,室温(20C25)下静置10min n后观察结果(如果环境温度太高,可置 4C环境下) 对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果 6.1.6结果判定:将反应板倾斜45",观察红细胞若没有呈泪滴状流淌,则判为HA阳性;完全血凝(不 流淌)的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价(血凝单位用HAU表示) 反之,判为HA阴性 6.2H试验 6.2.1标定参考毒株抗原及待鉴定病毒分别为4HAU(25AL). 在微量反应板的第1 一11孔加人0.025mL.PBs,第12孔加人0.05nL.PBs. 6.2.2 6.2.3加0.025m标准阳性血清至第1孔,充分混匀后吸出0.025m于第2孔,依次对倍稀释至第 11孔,从第11孔吸取0.025mL弃去 111孔均分别加人0.025mL4HAU参考毒株抗原及待鉴定病毒,第12孔作为红细胞对照 室温20C25C下静置10min30min 6.2.5每孔均加人0.05mL.0.5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人),轻轻混 匀,室温(20C一25C)下静置10min30min后,观察结果(对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果) 结果判定;按照HA试验进行结果判定 如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血 清所抑制,则该样品判为这一血凝素亚型阳性 检测结果成立的条件;已知抗原与相应的阳性血清反 应后出现预期的H效价,同时抗原的反馈标定结果均为4HAU;反之试验重新进行 ) 6.3NI试验(全量法以N1和N2分型血清为例 将N1,N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、,100倍稀释,并分别加人标记好的相应 试管中 6.3.2将已经确定HA亚型的待检病毒液稀释至HA价为16HAU,每管均加人0.05ml.,混匀37C 水浴1h 6.3.3每管加人的胎球蛋白溶液(50mg/mL)0.1ml.混匀,拧上盖后37C水浴16h~18h 6.3.4室温冷却后,每管加人0.1ml过碘酸盐混匀,室温静置20nmin 6.3.5每管加人1mL呻试剂(参见附录A中A.8),振荡至棕色消失、乳白色出现 6.3.6每管加人2.5ml硫代巴比妥酸试剂(参见附录A中A.9),将试管置煮沸的水浴中15min,不 出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性,即待检病毒的神经氨酸酶亚型与加人管中的标准神经氨酸酶分 型血清亚型一致 注意事项 标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定 7.2孵育时间要严格控制 红细胞对照完全沉淀时要迅速判读 在一些病毒株中可见红细胞从病毒 中解脱,如果有这种情况的发生,要提前判定或置4C下孵育 7.3红细胞悬液始终符合标准 反应试剂要按规定保存和使用 为避免反复冻融和细菌污染,应以无菌操作将试剂分装成小 包装 7.5冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存 7.6操作过程生物安全注意事项见附录B
GB/27536一2011 附录A 资料性附录 相关试剂的配制 A.10.01mol/Lp7.07.4PBs NaCl 8g Kcr 0.2g NaHPO. 1.42 KH,PO 0.27 g 灭菌双蒸水 800mL NaOH或者HCl调pH7.0一7.4,灭菌双蒸水加至1000mL定容,121C高压灭菌15min或过滤 除菌 A.20.85%生理盐水 NaCl8.5g,加灭菌双蒸水1000mL定容,121C高压灭菌15min或过滤除菌 A.3阿氏(Alsevers)液 2.05 葡萄糖 g 柠檬酸钠 0.8g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42g 灭菌双蒸水 至100ml 调pH6.1l NaOH或者HCI 121C高压灭菌15min,2C一8C保存备用 A.40.5%红细胞悬液 采集SPr公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用PEs液洗涂 3次,以3000r/min离心5min,洗涤后用PBS配成0.5%体积分数)红细胞悬液,2C8C保存 备用 A.5Ps,p15.9 A溶液[O.4mol/L 磷酸二氢钠(NaH,PO];称取27.6gNaHPO,溶于500mL去离子水中 B溶液[0.4mol/儿磷酸氢二纳(Na.IHPO)]称取28.4gNaHPO.,,溶于500mlL去离子水中 取81ml溶液A,l9ml溶液B混匀配成0.4mol/LPBS,pH5.9 如果需要,用适当的溶液A或 B调pH值 室温保存
GB/T27536?2011 A.6???( 0.5g ??? 20mL PBS,pH5.9 20mL ?? ?5ml,-20?档 ? 4.28 g 38mL ?? mL85%?,??,???档 ?,?62r A.8? 10.0g ? 7.lg ?? 100mL ?,?0.3mL?,±档 A.9? ? 14.2g ? l.2g ?? 200ml ?м?,±档??10h?г?,? ????á
GB/27536一2011 附 录 B 规范性附录 生物安全注意事项 B.1所有的操作过程应在生物安全二级(biologysecuritylevel2;能够安全操作,对实验室工作人员和 动物致病性低的,对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平)实验室中进行 B.2亚型鉴定要求有全套的流感病毒血凝素(HA)分型血清和神经氨酸酶(NA)分型血清

猪流感病毒分离与鉴定方法GB/T27536-2011

一、样品采集

（1）病死动物组织或器官：选择有代表性的组织或器官，快速采集并储存于液氮中。

（2）临床病例样本：如血清、尿液、痰液等，进行标本采集和处理。

（3）环境样本：如粪便、空气、水等，进行采集和处理。

二、原位检测

对于疑似病例，应首先进行原位检测。常用的方法有：

（1）病理学检查：观察组织或器官切片，检查病变情况和病原体存在情况。

（2）电镜检查：通过电镜观察病毒颗粒形态、大小和分布情况。

三、实验室检测

实验室检测是猪流感病毒分离与鉴定的主要方法。常用的方法有：

1.细胞培养法

（1）选用适当的细胞系，如MDCK细胞、Vero细胞等。

（2）将样品加入细胞培养基中，培养一段时间后观察细胞是否出现病变。

（3）对于病变细胞，进行病毒复制实验和鉴定。

2.RT-PCR法

RT-PCR法是一种敏感、特异性高的检测方法，常用于病毒核酸检测和分型。

（1）提取样品中的RNA或DNA。

（2）反转录和扩增目标片段。

（3）PCR产物进行凝胶电泳和序列分析，确定病毒株型。

四、结果解读

猪流感病毒分离和鉴定结果应根据实验室检测方法和流程，结合临床表现和病理学检查结果进行综合分析。特别是对于病毒分离阳性的样品，还需进行毒力试验和序列分析。

综上所述，GB/T27536-2011规定了一系列猪流感病毒分离与鉴定的标准操作流程，对于疫情的防控和病毒研究具有重要意义。

猪流感病毒分离与鉴定方法的相关资料

和猪流感病毒分离与鉴定方法类似的标准

GB/T27536-2011

猪流感病毒分离与鉴定方法

2022/10/29 16:33:10 现行

GB/T27521-2011

猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法

2022/10/29 14:29:04 现行