牛性控冷冻精液生产技术规程

牛性控冷冻精液生产技术规程

国家标准 GB/T31581一2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 Codefpratieeonproduectiomofboinefrozensexed-semen 2015-05-15发布 2015-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31581一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口 本标淮起草单位;农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(北京)内蒙古赛科星繁育生物技术股 份有限公司,北京奶牛中心、农业大学,全国畜牧总站、农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心 南京 本标准主要起草人;张晓霞,李喜和周文忠、刘海良、孙飞舟、张胜利、陆汉希、杨清峰,武玉波、 钱松晋、张海涛、刘玉、赵鹏、王建国、胡树香、张勇、胡志刚
GB/I31581一2015 牛性控冷冻精液生产技术规程 范围 本标准规定了牛性控冷冻精液生产的器械清洗和消毒、稀释液配制,采精、精液处理、精子分离、冷 冻,解冻、检验,包装、贮存及运输 本标准适用于采用流式细胞分离技术生产牛性控冷冻精液 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB4143牛冷冻精液 GB/T5458液氨生物容器 GB/T31582牛性控冷冻精液 NY/1234牛冷冻精液生产技术规程 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 精子分离spermsorting 根据x精子和Y精子DNA含量的差异,利用流式细胞分离方法将x精子和Y精子分离开 3.2 性控冷冻精液frozensexed-semenm 分离后富含X精子或Y精子、经超低温冷冻后在液氮中长期保存的精液 采精用品清洗和消毒 按照NY/T1234的规定执行 溶液配制与灭菌 5.1 溶液配制 稀释液 5.1.1 稀释液配制见附录A中A.l sheath 5.1.2分离机缓冲液Tris 分离机缓冲液Tris-sheath的配制见A.2.
GB/T31581一2015 5.1.3荧光染色液和食品红染色液 荧光染色液和食晶红染色液配制见A.3 5.1.4精子染色液 精子染色液的配制见A.4 5.1.5精子收集液 精子收集液配制见A.5 5.2溶液灭菌 溶液在使用前进行高压蒸汽灭菌(120kPa,15 min),对于不能高压灭菌的溶液使用0.22Am过滤 器进行过滤除菌 主要仪器设备 流式细胞仪、精液分装机、细管印字机、程序冷冻仪、荧光显微镜、离心机、精子密度仪 采精 按照NY/T1234的规定执行 精液处理 精液处理方法按照NY/T1234的规定执行,精液分离前应添加抗生素并在18C20C的环境下 保存,储存时间不超过16h. 精子分离 分离环境 9.1 精子分离实验室应保持洁净,室温控制在18C一25C,无振动源 9.2分离前处理 根据所采原精密度,按比例进行染色 示例:对4亿个精子进行染色,用染色原液稀释到2亿个/ml,加人15al一30lLHochest33342荧光染色液放人 5mL分离专用试管,混匀后放人34水浴,加盖避光温育45min 再加人2ml含4%卵黄的食品红染色液,最后制成 精子分离样品 9.3分离 按照分离机操作规程分离
GB/T31581一2015 10 分离精液冷冻 10.1 稀释平衡 分离后的精液在4C士1C条件下平衡90min后同温1750g离心5min,去除上清液 然后用 20%卵黄Tris-A液稀释收集后的分离精液,使精子密度>2000万个/ml 之后添加等量的含12%甘 油的Tris-B液，平衡20min. 用1:1的Tris-A液、Tris-B液将最终精子密度调整为 >1000万个/mL 10.2分装 平衡后的精液在4笔土1C条件下灌装,封口,印字,在细管上打印生产单位代号品种、牛号,生产 日期或批号(见附录B),性控标记等信息 10.3冷冻、包装 在4C士1C条件下将分装后的细管按照棉塞同一方向码放在冷冻架上,然后移人冷冻仪中,冷冻 的初冻温度调节至一90C,控制降温过程,在20min到达一120C后投人液氮中 冷冻结束后进行包 装,包装应在一l40以下进行 保存性控冷冻精液的液氮生物容器应符合GB/T5458的规定 11入库前检查 性控冷冻精液产品的质量应由专职的质量检验员负责检测,每批性控冷冻精液人库前应进行常规 检验,方法见GB/T31582 检验合格后方可人库 1 贮存、运输 按照NY/T1234的规定执行
GB/I31581一2015 附录A 规范性附录 牛性控冷冻精液生产相关溶液配制 A.1溶液配制 试剂纯度应达到分析纯 A.1.1IrisA工作液 取TrizmaBase35.32g、柠檬酸17.21g、D果糖12.65只溶于750mL双蒸水,搅拌30min,再加人 双蒸水至1000mL 溶液pH调到6.8,然后用0.22Am的过滤器过滤除菌,5C士1C保存,有效期 14d A.1.220%卵黄Tris-A液 取Tris-A工作液199mL.,添加51mlL卵黄液,搅拌15min,5C士1静置12h,去除沉淀,吸出 表层卵脂后,在18500g的条件下离心 然后用0.22; m的过滤嚣过滤除菌,加人抗生素,5C士1c保 n 存,有效期7d A.1.3Iris-B工作液 取TrizmaBase35.746g,柠檬酸19.980g,D-果糖14.712g溶于750ml双蒸水,搅拌30 ,再 min， 加人双蒸水至1000ml 溶液pH调到6.8,然后用0.22m的过滤器过滤除菌,5C士1C保存,有效 期14d A.1.412%甘油Tris-B液 先用Tris-B工作液配制23%体积分数)卵黄液,搅拌15min后置5C士1C条件下12h析出沉 淀 静置后吸出表层卵脂,并在18500g的条件下进一步离心沉淀 然后用0.22Am的过滤器过滤除 菌 再加人甘油使甘油终浓度达到12%(体积分数) 溶液pH调到6.8,加人抗生素,在5C士1C保 存,有效期7d A.2分离机缓冲液Tris-sheath配制 配制20LTris-sheath工作液;取TriznmaBase477.6g、柠檬酸232.6g,D-果糖171.0g溶于3.0L 双蒸水中搅拌30mim,并加盐酸把pH调到6.8,然后添加抗生素用0.22m的过滤器过滤灭菌,再加双 10nm(Om 在5C士1保存,有效期14d 燕水至00L荐量,调节H至几原,渗透压0moOhm士" A.3荧光染色液和食品红染色液配制 A.3.10.5%荧光染色液 mg荧光染料Hocehes33342定容于2mL双燕水中,在5C土1C条件下避光保存,有效期 将101 90d
GB/T31581一2015 A.3.25%食品红染色液 将0.5g食品红染料定溶于10mL双蒸水中,0,22m过滤除菌,在5C士1C条件下避光保存 有效期为90d A.4精子染色液配制 A.4.1精子染色原液 100ml精子染色原液:依次称取HEPEs0.925g,氧化镁(Mg(Cl,6H.O)0.008g、氯化钠(NaCI 0.5518g、氧化钾(KCI)0.0224g、磷酸氢二钠(NNaHPoO)0.004g,碳酸氢钠(NaHco,)0.084g、,丙酮酸 钠0.022g,葡萄糖0.09g、乳酸钠0.361mL,BSA0.3g,溶于100ml 双蒸水中,调整pH至7.4,加人 0.25mL庆大霉素(10mg/ mL),0.22Am过滤灭菌后,在5C士1C保存,有效期为7d10d A.4.2含4%卵黄的食品红染色液 A.4.1中100ml精子染色原液,加人0.261ml食品红染色液,形成食品红染色液 取96ml食 品红染色液添加4ml卵黄,搅拌后在5C条件下静置12h 去除卵黄颗粒沉淀,18500g离心301 min 调整pH至5.5,然后加人0.25mL庆大霉素(10mg/ml),经过0,22m过滤灭菌,在5C士1C保存 使用期限为14d A.5精子收集液配制 取20%卵黄TriA液100mL,加人16mL双蒸水,充分摇匀 5C土1C保存,有效期7d.
GB/I31581一2015 附 录 B 规范性附录 细管性控冷冻精液标记方法 细管性控冷冻精液标记由20个字符、5个部分组成,每部分之间空开2个字符位置,排列顺序 如下: 二部分 第三部分 第四部分 第五部分 第一部分 第 公牛注册号 性控标记 生产单位代号品种代号 生产日期 三个字符 二个字符 五个字符 六个字符 四个字符 第一部分公牛站代号以农业部公布的公牛站代号为准(参照NY/T1234标准执行);第二部分品种 代号以GB4143为依据;第三部分公牛号取该牛身份证号码的后五位数;第四部分冻精生产日期六位 数按年,月、日次序排列,年、月、日各占二位数;第五部分性控标记;性控或XK,X为雕性,Y为雄性 每部分之间间隔2个字符位置 标记的字迹应清晰易认 示例 ×××HIs×x×××x×xxxxxK-x 塞封口端 超声波封口端 Xx×为生产单位代号,Hs为荷斯坦公牛的品种代号,×××x×为该公牛身份证号码的后五位 数X×××××为20××年××月××日的生产日期,xKx代表性控x精子

牛性控冷冻精液生产技术规程GB/T31581-2015

牛性控冷冻精液是现代畜牧业必不可少的繁殖材料之一，其质量直接影响到后代的繁殖能力和品质。GB/T31581-2015标准主要围绕“科学合理、规范操作、保证质量、提高效率”的原则，建立了严格的生产技术规程。

首先，在采集和处理精液的环节中，需要对精液来源的公牛进行严格筛选和鉴定，确保精液品质优良、无疾病。在处理过程中，要注意温度和时间的控制，避免精液受到过度损伤。其次，在冷冻精液的保存和运输环节中，要严格按照标准规范进行操作，包括选择冷冻介质、控制冷冻速率、运输温度等，以确保精液质量和活力的稳定性。

此外，GB/T31581-2015标准还对生产环节中的质量控制和管理提出了具体要求。例如，在生产过程中需要建立健全的质量检测体系和监督机制，对每批次产品进行抽样检测和质量评估，并留存相应的检测记录和数据。同时，需要对生产工人进行培训和考核，加强员工素质和技能的提升，确保生产线上的操作规范和质量稳定性。

总之，GB/T31581-2015标准的建立和实施为牛性控冷冻精液的生产提供了科学的指导和规范，有助于提高精液质量和效率，保障畜牧业可持续发展，推动我国畜牧业的现代化进程。

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