杨树（细菌性）枯萎病菌检疫鉴定方法

杨树（细菌性）枯萎病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36807一2018 杨树细菌性)枯萎病菌检疫鉴定方法 Detetioandidentifeaton.fEanterobaetercanerogenis(Ursei)Diekeyet Zumoff 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/36807一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:烟台出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、沈阳出人境检验检疫局、南海出人境检验检疫局 本标准主要起草人:李金庆、厉艳、段效辉、张京宣、付海滨,封立平,谈堪、管旭芳,粟智平、王简、 刘宁、王英超、耿金培
GB/36807一2018 杨树细菌性)枯萎病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了杨树(细菌性)枯萎病菌[Enterobacter cacerogeus(Urosevi)DickeyetZumof们的 检疫鉴定方法 本标准适用于进出境苗木,原木等植物及其产品中杨树(细菌性)枯萎病菌的检疫鉴定 杨树(细菌性)枯萎病菌基本信息 中文名:杨树(细菌性)枯萎病菌 学名;Enernhacercanerokenus(Uroe)DickeyetZumoadr 异名:ErwiniacancerogenaUrosevic1966 英文名Cankeranddieback,Canker rofpoplar 中文别名;生癌肠杆菌 杨树(细菌性)枯萎病菌的其他信息参见附录A 分类地位 杨树(细菌性)枯萎病菌属细菌域Bacteria,变形菌门Proteobacteria,7-变形菌纲Gammaproteobae teria,肠杆菌目Enterobaeteriales,肠杆菌科Enterobaeteriaceae,肠杆菌属Enterobucter,生癌肠杆菌 Enteroacter cacerogenuus 方法原理 杨树(细菌性)枯萎病菌主要通过带病的树干树枝等传播其症状特点、培养性状和生理生化特征、 PCR特异性鉴定结果是该病菌的鉴定依据 仪器设备和试验用具 5.1仪器设备 PCR仪电泳仪、凝胶成像系统、Biolog仪、显微镜、高速冷冻离心机、恒温培养箱,超净工作台、高 压灭菌器、水浴锅、台式小型离心机,超低温冰箱、常规冰箱、pH计、旋涡振荡器、微量可调加样器(2.5L 0AL、20AL、100AL,200AL、1000AL)等 5.2试验用具 剪刀、灭菌解剖刀、手持放大镜、全钢大号指甲钳,玻璃棒,接种环、子,培养皿、酒精灯、三角烧瓶、 量筒、离心管、滤纸等
GB/T36807一2018 6 试剂和培养基 6.1试剂 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水 PCR反应体系用双蒸水 其他试剂如备 种溶液和培养基都是检测方法特有的,都应按附录B、附录C的要求准备 商品化试剂参见其使用 说明 70%乙醉醇、1%次氯酸钠(NaCIO),CTAB缓冲液、TE缓冲液、蛋白酶K(ProteinaseK)、氯化钠 (NaCl)、Tris饱和酚、三氧甲烧(CHCl.),异戊醇(CHeO)、澳化乙锭(EB)、,PCRPremix,DL2000DNA Marker,特异性引物,生理生化相关试剂 6.2培养基 营养琼脂培养基(NA) 培养基配制方法及步骤见附录B 鉴定 7.1症状检查 逐一对抽样产品进行症状观察 仔细观察树皮、树枝是否有溃疡斑或者开裂现象(参见附录D图 D.1),树枝顶端是否产生坏死 该病菌可导致树皮开裂,树枝顶端坏死 病菌侵染后,茎周围产生比较 宽的开口或封闭的溃扬斑或者数不清的裂缝,从而导致树皮脱落 感病品种在一定条件下产生的溃疡 斑更深并且呈纵向排列图D.2) 疑似的病组织要带回实验室进行显微镜检查和病原菌分离 7.2病原细菌的分离纯化 选取产生症状的树枝等病组织,用流水冲洗干净、晾干,剪成小段后用70%乙醇(或1%次氯酸钠 表面消毒1min一2min,用无菌水冲洗3次,晾干后剪碎,于200L无菌水中浸泡,并用灭菌解剖刀或 灭菌玻璃棒破碎组织,尽量使内部细菌释放出来 15nmin~20min后用接种环蘸取浸液,在营养琼脂 培养基(NA)上划线分离,平板在30下培养24h一48h后,挑取单菌落划线纯化备用 7.3病原细菌的菌落及菌体形态观察 将纯化的菌株在营养琼脂培养基(NA上划线培养,观察细菌在营养琼脂培养基上的生长及菌落 形态 显微镜下观察菌体大小和形态 7.4生理生化特性测定 取可疑菌株,应用BOL0G微生物全自动鉴定系统(GEN皿)或细菌微量生化鉴定管对可疑菌株 进行相关生理生化指标测定 7.5PCR特异性扩增检测 在上述检测和鉴定的基础上,通过杨树细菌性)枯萎病菌PCR特异性扩增检测进一步确定和验 证,具体检测方法见附录C 7.6测序 对PCR扩增结果为阳性的样品,需将PCR扩增产物进行测序,并与扩增靶标片段进行比对,以进
GB/36807一2018 -步确证是否是杨树细菌性)枯萎病菌 结果判定 若经症状检查并分离的细菌菌株的培养性状与描述相符,生理生化鉴定结果与Enterobactercan cerogenus特征相符,且PCR检测结果为阳性,扩增片段经测序比对结果与靶标序列片段相符,则可以 判定为检出杨树(细菌性)枯萎病菌;否则判定为未检出 样品及检测结果保存 9.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出杨树(细菌性)枯萎病菌的样品应妥善保存,以备复 核 该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 9.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为杨树(细菌性)枯萎病菌的菌株,应妥善保存 可采用甘油冷冻保存法 或冻干保存法保存 对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理
GB/T36807一2018 附 录 A 资料性附录) 杨树(细菌性)枯萎病菌其他信息 地理分布 A.1 欧洲:波兰、捷克、斯洛伐克 A.2寄主 寄主植物包括杨属(Populw)桦木属(Bewla),云杉属(Picea) 据报道还可机会性侵染人体导 致伤口感染和败血病 A.3 症状 该病菌可导致坏死,引起树皮下组织显著生长,伴随着明显的树皮开裂,造成云杉等树枝顶端坏死 现象 侵染后茎周围产生比较宽的开口或封闭的溃疡斑或者数不清的裂缝从而导致树皮脱落 感病 品种在一定条件下产生的溃疡斑更深并且呈纵向排列 A.4病原菌形态及培养性状 杨树(细菌性)枯娄病菌为革兰民阴性菌,菌体直杆状,两端呈椭圆形,周生鞭毛,能游动,大小 (0.6m1.0m)×(1.2Am~3.0Am) 不产生芽抱 在NA平板培养基30培养48h后,单个菌落呈圆形,表面平滑,呈灰白色,不透明,边缘完整 将纯菌落穿刺接种于NA试管培养基,可沿穿刺线和培养基表面生长良好,偶有气体产生 A.5病原菌生理生化特征 兼性厌氧,接触酶反应阳性,产酸产气,运动,柠檬酸和丙二酸反应阳性,能产生精氨酸双水解酶、鸟 氨酸脱梭酶和脱氧核糖核酸酶,Voges-Proskauer反应及明胶液化阳性,不产生赖氨酸脱梭酶、氧化酶、 淀粉酶,不能还原硝酸盐,甲基红和呵噪测试阴性 A.6杨树细菌性)枯萎病菌与肠杆菌属其他相关种的表型特征区分 杨树(细菌性)枯萎病菌与肠杆菌属其他相关种的表型特征区分见表A1
GB/36807?2018 A.1(?)??????? ? ??? ? ?? ? E.cloacae ??γ? ?鳦? ? E.nimipress subsp E.ori E.yrim4s E.eloacae E.sakazaki uralis E.cuerogeu lissolzens VP? Voges-Proskauer reactIon MR? Methylredtest ?? ? Ornithine decarb0xylase ??? ? X Argininedihydrolase ? Motility ?? Aeseulinhydrolysis ?? Lysinedecarboxylase Sucrose ? Melbiose D DArabitol D?洼 DSorbitol L L-Fucose ND Putrescine e-LRhamnose
GB/T36807?2018 A.1() ? ??? ? ?? ? ??γ? ?鳦? E.clocae" ? E.nimipres subsp E.mori" E.pyrinws E.cloacae E.sakazaki uralis E.cueougeus dissolens ND Citrate ? Mucate -D? ? -D(Galactopyranos ?;??;v?;ND?δ ?:
GB/36807?2018 ? B 淶?? ? ??(NA)? ? 10g ? 3g ? 5g ? 17g pH7.2,?1000ml,121C?15min
GB/T36807一2018 录 附 C 规范性附录) 杨树(细菌性)枯萎病菌PCR特异性扩增检测方法 病原细菌DNA模板的提取(改良CTAB法》 C.1.1用接种环挑取两环新鲜菌昔(NA培养基,30C培养24h)于灭菌1.5ml离心管中,加人570 TE缓冲液(10mmol/1Tris-HC1.1mmol/LEDTA.pH8.0),充分振荡混匀 c.1.2依次加人30AL10%SDs溶液和60l蛋白酶K,混匀,37C水浴1h后,再加人100AL 5mol/LNaCl和804lLCTAB溶液,充分颠倒混匀,65C水浴10min. C.1.3混液用等体积的酚;三氯甲婉:异戊醇(25:24:1)混匀,13000片离心1min,取上清液 C.1.4加人等体积的三氯甲炕;异戊醇(24:1)混匀,13000离心1min,取上清液 C.1.5DNA上清液用两倍体积的冰冻乙醇沉淀,再分别用70%乙醇洗涤两次,室温干燥,用50l灭 菌超纯水溶解,紫外分光光度仪测定DNA质量并分装保存于一20C冰箱 注也可采用适用的商品化试剂盒进行DNA提取 C.2 引物序列 YskwUP.5'-GCGTTcTTTGTTTGAcTGAATGGTG3 YskwNP,5'-ATcGTcGATcTcGCrTGcGGATA-3 c.3CR扩增 采用25LPCR反应体系;PCRPremix12.5L,H.o8.5L,10mol/L引物各1L,DNA模板 2.0AL 每次CR检测应设立相应的阳性对照,阴性对照和空白对照 PCR反应条件:预变性:94C5min;变性:94C45s,退火:55C45s,延伸:72C1" 1min,30个循环; 延伸72c7min. 注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 C.4 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观 察是否扩增出预期718p的DNA条带,并拍摄记录 C.5 结果判断 PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测 送检样品、阳性对照均出现718bp条带,而阴 性对照和空白对照均未出现相应条带,PCR扩增结果判定为阳性;送检样品、阴性对照和空白对照均未 出现718bp条带,仅阳性对照出现718bp条带,PCR扩增结果判定为阴性 扩增靶标片段序列如下
GB/36807?2018 GCGTTCTTTGTTTGACTGAATGGTGTGGCTGAGCATGGATTCAAGGcGAGGCGcCTGG rGATAATATTCATCAGAACGGTGCGGGAAGCATGGC GCAGATAGAGCCCGAACAGCAC GGTGCCTTTCAAACGGCC TCGGTGAAGTAGTCC TTGCTGAAGGAGCTGGCCTCGGCCTGGG CGACAAACCACGGGCGGGT TTTGCTTTTATCGGTCGGCAGCACTTC TGGCGCACGCAGATAGTGCCCCTCTGTATCCGCAAGCGAGATCGACGAT
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GB/36807一2018 考文 参 献 [1]UroseviB.Cankerofpolar edbyEruwinia.cancerogenasp.[inCzech][].LesnickyCa cauSed s.1966,12 493-505 sopis. UroseviB.RelationshipsbetweenErweiniacancerogena Dbacterimn pwli Ur.andAplal JournalofForest tPathoogy. y.1973,32),83-97 Ride.EBuroeam. comb.nov.(for [3灯]DickeyRS,ZumoffCH.EmendeddeseriptionoEnlerohaclercancerogenus Mhierobioogy merlyErwinidcacerogena[].InternationalJournalofSystematieandEvolutionary 1988,38:371-374. [4]GrimontPAD,AgeronE.1989,.EnterobactercancerogeusUrosevi,1966>DickeyandZu mof1988,aseniorsubjectivesynonymofEnterobactertayoraeFarmeretal].ResearchinMierobi dlogy.1985,l40(7)459-465. [5BradburyJF.Guidetoplantpathogenicbacteria[M].FarnhamRoyal,Slough,UK:CABIn- ternational.1986. [6]ZhuB.,L.ouM.M.,XieG.Letal.Enterobactermoil sp.nov.associatedwithbacterialwilt Mierobhiolegy." onMor4sal6alJ门.InternationalJournalofSystematicandEvolutionary y,201l,61: 2769-2774. [7WangG.F.,PraphatK.,XieG.I.etal.IdentificationandcharacterizationoftheEntero/acter complexcausingmulberryMorusalbawiltdiseaseinChina.EuropeanJournalofPlantPathology 2010,126:465-478 [[8]weisburg,w.G.,s.M.Barns,D.A.PelletierandD.J.L.ane.16sribosomalDNAamplification forphylogeneticstudy[].JournalofBacteriology,1991,173(2)697-703 [[9]AbbottsL1,JandaJM.Enterobactercancerogenus(“Enterobactertayorae”)InfectionsAs- sociatedwithSevereTraumaorCrushInjuries[].Americanjournalofclinicalpathology,1997,107 (3):359-361