国家标准 GB/T26612一2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程 PreeduresofThoroughbrelparentageverifieation withDNAtestingtechniques 2011-06-16发布 2011-11-01实施中华人民共利国国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T26612一2011 前言本标准的附录A,附录B,附录C,附录D,附录E为资料性附录本标准由农业部提出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口本标准起草单位;农业大学马研究中心,马业协会本标淮主要起草人;赵春江,吴常信、韩国才、张浩,吴克亮、杜丹、韩文朋
GB/I26612一2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程范围本标准规定了纯血马DNA亲子鉴定所用的方法、过程、结果的记录和解读等本标准适用于纯血马的亲子鉴定规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T1119进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求术语和定义下列术语和定义适用于本标准 3.1 纯血马Thoroughbred ernationalStudBookCommitte' 符合国际纯血马登记委员会(Inter e,ISBC)规定、在ISBC批准的成员国登记委员会登记了的马匹微卫星NA亲子鉴定方法prmteetestina withDNAteehniue 以微卫星DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法原理根据微卫星DNA的侧翼序列设计引物,对微卫星DNA位点进行扩增,其中包括国际动物遗传协会(InternationalSocietyofAnimalGenetics,Is,AG)和ISBC要求的九个微卫星位点通过凝胶电泳判定个体的基因型根据孟德尔遗传规律,比对亲代个体和子代个体各微卫星DNA位点的基因型是否相符,从而达到亲子鉴定的目的试剂与器材 5.1试剂 5. .1.1乙醇(ethanol),分析纯 55 1 异丙醉(isopropanol),分析纯 1.3氢氧化钠(Na(OH),分析纯 55. 5.1.4 乙二胺四乙酸二钠(EDTA),分析纯 5 1.5氯化钠(NaCl),分析纯 55 1.6十二炕基硫酸钠(SDS),分析纯 5.1.7乙酸钾(CH.c0OK),分析纯 5.1.8氯化锂(LiCI),分析纯
GB/26612?2011 5.1.9?(KCI), 5. 1.10??CMgCl), 5. 1.1130%)??;29%?1%N,N'-?????. ????,??档 5.1.12, 1.13(boricacid), 5 5.1.14, 5.1.15, 1.16, . S .1.17(AgNo.), 5.1.18?, 5.1.19??, 1.20TaqDNA?? 5 .1.21?, 5 (HCl), 1.22 5 5.1.23(?)(TrisIBase), Tris-Hcl;TrisBaseHcl??? 5.1.24 (dNTPs);(dGTP)ι 5.1.25 dATP),(dTTP)(dCcTP)? ? 5.1.26???;200mmol/1NaOH 5.1.27к?;200mmol/1Hcl,100mmol/1Tris-Hcl,pH8.5 5.1.28? ?????(BuferA):100mnmol/LTis-HHCl(pH7.5),100mnmol/LEDTA,100mmol/L NaCl,0.5%)sDs; b??(BufferB):200ml5mol/L.CH,coOK,500mL6mol/1LiC?? e)DNA???(TE):10mmol/1Tris-HCI,1nmmol/LEDTA,pH=8.0; d)???5TBE:446mmol/TrisBase,445mmol/LBoricAeid,10mmol/EDTA pH8.0) e)???50TAE:2nmol/1Tris,1nmol/L,0.1mol/LEDTA(pH8.0); f ?:30mmol/IEDTA,36%(),0.05%/) pH=7.0s 10PCR?;100mmol/LTris-HCl(pH8.0),0.5mol/KClI,15mmol/IMgC g 5 .1.29?() 5. .1.30N,N,N',N'-???(TEMED). .1.31?;??????,??????,DNA? 55. 2 .2.1??DNA? 5 5 2 ?,10000g 2 2.3 ???? 5 2 ?,0.1l~1000 AlL 5 2. 5 PCR,96? 6 5.2. ???,31 cm
GB/T26612一2011 5.2.7垂直电泳槽,长度24cm. 5.2.8凝胶成像系统 5.2.9漩涡振荡仪 5.2.10剪刀 DA亲子鉴定规程 DNA的提取采取血液或带有毛囊的马毛发,从中提取DNA 具体方法参见附录A DNA样品操作注意事项见SN/T1119 亲子鉴定所用NA微卫星位点 6.2 亲子鉴定所用DNA微卫星位点应包括1sAG和IsBC要求的如下九个微卫星位点:AHT4 在所扩增的位点中还可包括 AHT5,ASB2，HMS3，HMS6，HMS7，HTG4，HTG10，VHL20 HTG6,HTG7,HIMs2等三个微卫星位点或其他若干个已被证实在纯血马群体中多态性丰富的微卫星位点,以进一步提高亲子鉴定的准确性引物序列参见附录B. DN八微卫星位点的扩增 6.3 可用荧光物质标记用于扩增上述12个位点的引物,采用PCR方法扩增这些微卫星位点 PCR条件参见附录c PCR操作中防止污染等注意事项见GAT383 基因型的检测 6 使用根据荧光信号探测PCR产物大小的全自动DNA分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染(参见附录D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述12个位点的基因型在分析中设置对照样本上述操作技术要求见sN/T1193 6.5基因型的表示方法基因型用国际通用的字母表示在所检测的微卫星位点中,等位基因数为奇数的,片段长度居中的基因型记为“M”;如等位基因数为偶数,居中的两个基因型中片段较小的定义为“M” 其他等位基因对照“M”按升序排列微卫星位点基因型的记录参见附录E 亲子关系的判断根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系基因型的读取和亲子关系的判断由两人分别独立完成,其结果互相印证否定个案的重复检测对于亲本和子代个体的基因型不符的个案,重新采取DNA样品进行鉴定,两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系亲子鉴定结果的记录亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型相符的个案,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型,并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测,不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系”,并由亲子鉴定负责人签字 7.2亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案,记录亲本及子代个体的上述已测定的微卫星位点的基因型,并记录“根据上述微卫星位点的基因型检测,可排除子代个体与两亲本存在亲子关系”,并由亲子鉴定负责人签字
GB/26612一2011 附录A 资料性附录从血液或毛囊中提取DNA 马血液样品DNA的提取 A.1.1从马颈静脉采取血样5mL,用移液器量取100lL10%(质量分数)EDTA抗凝 A.1.2取50L血液样品放人1.5ml离心管中 1.3加人400AlBufferA,充分混合至凝块消失 A. 65C温浴2h~4h 1.5加人800LBuferB,颠倒混合,然后冰浴10min(或放人一20C冰箱内5min一10min) 1.6用离心机在室温下以12000r/min离心15min 吸取1mL上清液于另一新的1.5mL离心管中注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物,必要时可重复离心去除沉淀物 A.1.8加人600L异丙醇(isopropanol),颠倒混合几次 A.1.9室温12000r/min离心15min A 1.10弃上清液,然后用70%(体积分数)乙醇(ethana)清洗两次,室温干燥,加人150LTE室温溶解30min. A.1.11在水平电泳槽内用1.0%质量分数)琼脂糖胶电泳检测DNA的质量;采用紫外可见分光光度计,以260/280吸光度检测DNA浓度 A.1.12一20C保存 A.2马毛囊样DNA的提取 A.2.1采取马的臊毛,应该带有毛囊,10支以上 A.2.2取0.2ml离心管,标记样品号 A.2.3取6根10根带有毛囊的毛样,在根部用剪刀剪切约0.5cm(避免粘在剪刀上),放人离心管中加人80l毛囊裂解液(此浓度为黑毛样品的用量,粟毛加23浓度的毛囊裂解液)于毛囊处 A.2.4 漩涡振荡仪上退速漩涡混合3mim 在PCR仪上用如下程序进行一个热循环:75C1 A.2.5 1min,80C2min,90C1min,97C10min 从热循环仪上取下样品,加人80AL中和液(此浓度为黑毛样品的用量,果毛加2/3浓度的中 A.2.6 和被,藏爵混合了mnt -20丫保存 A.2.7
GB/I26612一2011 附录 B 资料性附录用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物如表B.1所示表B.1用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物位点名称序列(5'一3' 2 正向;AAccGccTGAGcA.AGGA.AG AHT4 反向;(GCTCCCAGAGAGTTTACCCT 正向:ACGGACACATcCCTGcCTGC AHT5 反向:ATCTAGCAGGCTAAGGAGGCTCAGC 正向:CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG ASB2 反向;GATcATATGcccTTATCTCTTTGcGc 正向:CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG HTG7 反向:ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT 正向;cCcAACcTCcTTTGTcAcATAACAAGA HMS83 反向:CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT 正向;GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG HMS6 反向;crccATcTTGTGAAGTGTA.AcTcA 正向:CAG;GAAACTCATGTTGATACCATC HMS7 反向;TGTTGTTGAAACATAccTTGAcTGT 正向;CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC HTG4 反向:CTCCCTCCcCTCCCTCTGTTCTC 正向AcGGTGGcAACTGccAAGGAAG HMS2 反向:CTTGCAGTcGAATGTGTATTAAATG 正向;CCTGC'TTGGAGGCTGTGATAAGAT HTG6 反向:GTTcAcTGAATGTcAAATTcTGcT 正向:CAATTccCGccCCACCCcCGGCA HTG1o 反向:TTTTTATTCTGATCTGTCACATTT 正向;CAAGTccTcTTAcTTGAAGACcTAG VHI20 反向:AACTCAGGGAGAATCTTcCTCAG
GB/26612一2011 附录 c 资料性附录扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的CR条件 C.1CR条件扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的PCR条件如表C.1所示表c.1用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称标记颜色退火湿度/ 片段大小/bp Mgt十浓度/mmol/L AHHT4 蓝色 151167 60 1.5 黄色 60 AHT5 133~147 1.5 AsB2 绿色 212248 60 2.5 HTG7 118~128 55 2.5 绿色 HIMS3 150~172 60 2,5 绿色 HMS6 黄色 159173 60 2.5 HMS7 蓝色 170~186 60 2.5 蓝色 HTG4 129~l41 55 1.5 黄色 HMS2 216一238 60 2.5 HTG6 绿色 5 2. 84106 HTG1o 94114 1.5 黄色 60 VHL20 蓝色 87105 55 2.5 c.2PCR反应体系 PCR反应体系如下;50L 反应体系:10×PCR缓冲液5L,dNTPs5mmol/L1AL,引物 504mol/L)各2l,Ta9DNA聚合酶(5U/L)0.5l,模板DNA10L.(50ng500ng),ddH,O 31.5AL,扩增每个位点所需的最佳镁离子浓度参见表C.1 反应条件;PCR反应条件随仪器不同略有改变 94C预变性1min3nmin 94C变性30s,退火 30s(扩增每个位点所需的最佳退火温度参见表C.1),72C延伸45s,30个循环 72C延伸30min 4C保存检测过程中分别设阳性对照,阴性对照和空白对照用已知可成功扩增的马DNA样品作阳性对照;用等体积的重蒸僧水代替模板DNA作空白对照 c.3PCR扩增产物的电泳检测 PCR扩增产物电泳检测取2.5g琼脂糖,放人100mL电泳缓冲液(将电泳缓冲液50×TAE用去离子水稀释50倍)加热充分熔解后制胶在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面没过凝胶将4L PCR扩增产物和适量上样缓冲液混合后上样 9V/em恒压电泳,澳酚蓝迁移至凝胶中部停止将胶放人澳化乙锭溶液(浓度为0.54g/mL)中染色15min,采用凝胶成像系统观察电泳结果并记录
GB/T26612一2011 附录D 资料性附录采用银染进行微卫星NA基因型的分析方法 D.112%(质量分数)聚丙烯胺凝胶(25mL体积.0.1e胶条)制作及电泳 D.1.1清洗制胶用的玻璃板并用蒸榴水冲洗干净,晾干后上垫条,用夹子夹好 D.1.2在100mL烧杯内加人30%质量分数)聚丙烯酰胺10mL,2.5ml50%(体积分数)的甘油，电泳解缓冲液5×TBE5ml,10%质量分数)过硫酸铵0.175ml,TEMED8AL,加人燕憎水 77 .325ml,混合均匀后迅速灌胶上述为一块胶的量,多块胶时按比例加倍 D.1.3当灌胶至玻璃板上沿0.1enm时停止,插人梳子,室温放置至其聚合 D.1.4凝胶聚合好后,向垂直电泳槽加人1×TBE,用注射器冲洗加样孔 D.1.5预电泳10nmin,然后上样、电泳 D. 硝酸银染色方法 .2 D.2.1用去离子水冲洗胶 min3 D. .2.2用25%体积分数)的乙醇浸泡胶2 min D.2.3去离子水冲洗2遍 min40min D.2.4用0.1%质量分数)AgNO染色液染色301 D.2.5去离子水冲洗2遍 D.2.6用显色液(取15gNaOH,加去离子水至500mL溶解,加0.076g四酬酸钠和800L甲醛)显 min20t 色10 mina D.2.7用去离子水冲洗多余的显色液 D.2.8显色后的胶用保鲜膜封好,观察和照相
GB/T26612一2011 附录 E 资料性附录纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记如表E.1所示表E.1纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记表位点名称 VHL.2oHTG4AHT4HMS7AHT5HMS6ASB2HTG1oHMS3HMS2HTG6HTG7 子代基因型母马基因型公马基因型子代基因型母马基因型公马基因型

纯血马DNA亲子鉴定技术规程GB/T26612-2011

1. 背景

纯血马是指具有完整家族谱系且祖先均为同一品种的马。在繁殖过程中，需要通过亲子鉴定技术来判断后代是否为纯血马，保证品质和价值。

2. 鉴定原理

纯血马DNA亲子鉴定技术基于DNA遗传学原理，通过比较被测个体（即后代）与其父母的DNA序列，确定亲子关系。

3. 鉴定流程

根据GB/T26612-2011标准，纯血马DNA亲子鉴定通常包括以下步骤：

样品采集：采集被测个体、父母的血液或口腔黏膜细胞等样品。
DNA提取：使用特定试剂盒将样品中的DNA提取出来。
PCR扩增：利用聚合酶链式反应技术，扩增目标DNA序列。
电泳分离：将PCR产物进行电泳分离，并通过比较DNA条带长度，判断亲子关系。

4. 实验室设备

纯血马DNA亲子鉴定需要一系列专业实验室设备，主要包括：

PCR仪：用于PCR扩增反应。
电泳仪：用于DNA条带的电泳分离。
荧光检测仪：用于检测DNA条带长度。
纯化仪：用于对PCR产物进行纯化和提纯。

5. 结论

纯血马DNA亲子鉴定技术是保证纯血马品质和价值的重要手段。GB/T26612-2011规程提供了详细的鉴定流程和实验室设备要求，可以确保鉴定结果的准确性和可靠性。