地中海实蝇生物芯片检测方法

地中海实蝇生物芯片检测方法

国家标准 GB/T28065一2011 地中海实蝇生物芯片检测方法 BiochipdeteetionofCeratitiscapitatawiedemann 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28065一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;深圳出人境检验检疫局、北京出人境检验检疫局， 本元正阳基因有限公司、深圳市检验检疫科学研究院 本标准主要起草人;余道坚、李建光、任鲁风,徐浪、周琦、章桂明、陈枝楠、汪万春,康林、仲建忠、 向才玉
GB/T28065一2011 地中海实蝇生物芯片检测方法 范围 本标准确定了地中海实蛆Ceratitiscabilalawiedemann双翅目Dptera实蝇科Tephritidae) 的生物芯片制备,检测和结果判定方达 本标准适用于相关贸易和有害生物监测中地中海实蝇卵、幼虫、蛹的鉴定和成虫的鉴定或复核 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2039地中海实蝇检疫鉴定方法PCR法 缩略语 sN/T2039界定的缩略语适用于本文件 方法原理 选择实蝇科昆虫线粒体DNAco1基因核苷酸片段为分子标记探针,将探针按预先设置的排列固 定于特定的固相支持载体(如;醛基化基片)的表面形成微点阵,利用反向固相杂交技术,用cy3标记脱 氧胞苷三瞬酸(Cy3dCTP)荧光标记的样品分子与微点阵上的探针杂交,实现多个分子之间的杂交反 应,并通过芯片扫描信号的判读来检测样品中特定基因片段的存在,最后确定是否为地中海实蝇 仪器和用具 PR扩增仪、芯片点样仪、芯片扫描仪、离心机水浴锅,涡旋器、冰箱、电子天平、烘箱、磁力搅 拌器 醛基化基片,多孔板、芯片盖片、芯片分隔围栏、芯片粘贴工具,湿盒,杂交盒、计时器,磁柱、芯片架、 2L烧杯,15ml离心管、量简、移液器等 试剂 昆虫基因组DNA提取试剂盒 DNA快速纯化/回收试剂盒 去离子水 50%二甲基亚碱(DMSO) 6.50.2%十二烧基磺酸钠(SDS) 6.60.2%棚氢化钠
GB/r28065一2011 6.710×SSPE20×SSPE:3mol/L氯化钠,200mmol/L磷酸二氢钠,25mmol/LEDTA，pH7.4) 6.80.3XSsC,0.06×SsC(20×SsC;3mol/L氯化钠,300mmol/L柠檬酸钠. 6.910×PCR缓冲液(MMg+,15mmol/L .10dATP,dTTP,dCTP,dGTP(10pmol/L. 6 1 6 Cy3-dCTP 12Tu酶 6. 13 6. 引物(10pmol/L. 6. 14探针(50mol/L) 6 15阳性质粒 6 16乙醉(70%和99.9%) 6. 17 洗液I0.3XSsC,0.2%SDS) 6 18洗液I(0.06×sSsC) 生物芯片检测方法 7.1样品前处理 按照SN/T2039进行 7.2基因组DNA制备 按照sN/T2039进行 生物芯片探针 7.3.1 检测探针 检测探针包括以下类型的探针(见A.1): 实蝇科通用探针; 地中海实蝇与纳塔尔实蝇近缘种特异探针; 地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种特异探针; 地中海实蝇种特异探针; 纳塔尔实蝇c.rosa种特异探针; 非洲芒果实蝇C.cosyra种特异探针 注1:检测探针是一条20nt一29nt的寡核背酸;序列为实蝇科昆虫的特异性序列,5'端氨基修饰 注2;实蝇科通用探针能够特异检测实蝇科昆虫,近缘种探针能够特异检测相应的两个近缘种,地中海实蝇,纳塔尔 实蝇和非洲芒果实蝇种特异性探针分别可特异检测上述三种实蝇 质控探针 7.3.2 质控探针包括以下四种类型探针(见A.2) 定位点探针; 阳性对照探针; 阴性对照探针; 空白对照 7.4芯片制备 7.4.1芯片基片:选择光学级醛基基片
GB/T28065一2011 7.4.2探针稀释:探针用50%DMsO溶解至终浓度为50Amol/L,按照探针点阵排布顺序,将探针溶 液用移液器加人多孔板中 7.4.3点样;用芯片点样仪将探针点至基片上 实蝇芯片探针阵列排布图参见B.1 一张基片四个探 针点阵的示意图参见B.2 注:每个阵列共5行10列,第1行和第1列为定位点探针,其他探针各设三个重复 每张基片可以根据实际需求点 个或多个相同探针点阵 一体积水),在烘箱37笔水合12h 7.4.4 水合:基片置湿盒(内盛三分之 7.4.5固定:将基片放在芯片架上,置盛有0.2%SDs溶液的烧杯中磁力搅拌漂洗5nmin 取出再放人 盛有去离子水的烧杯中磁力搅拌漂洗3次,每次2nmin 注:漂洗时溶液应没过基片,洗涤时应在洗液中加人磁柱,打开磁力搅拌器搅拌;每漂洗一次,更换去离子水 7.4.6封闭;将固定的基片放人盛有0.2%NaBH封闭液的烧杯中先磁力搅拌漂洗5min,关闭磁力 搅拌器,静置5min,再磁力搅拌漂洗5min;最后用去离子水磁力搅拌漂洗3次,每次2min 质检:基片置15mL离心管中,2000r/min离心2min n除去水分;用芯片扫锚仪对基片进行预 扫描质检,质检合格后芯片避光冷藏保存 注，基片表面无残余固定剂,探针阵列完整,定位点清晰的为合格的芯片 7.5荧光标记PCR 荧光标记PCR反应在常规PCR仪上进行,引物P和P序列见c.1,标记PCR反应体系见c.2 扩增条件;94c90s;94c30s,5530s、72c30s,30个循环;72c5min 待测样品模板DNA和 实蝇阳性质粒平行进行荧光标记PCR,阳性质粒基因序列见C.3. 注，阳性质粒是一段人工合成的DNA片段,其5'端和3'端核苷酸序列分别为引物P和P的互补链 7.6杂交反应 7.6.1杂交液预热 10×SsPE芯片杂交液在水浴锅中预热至50C 7.6.2变性 分别取杂交液10L和PCR产物10L(实蝇模板扩增产物8L和阳性质粒扩增产物2pAL)到一 个灭菌的50AL岗心管中,岗旋混匀在R仪上9七空性了min 7.6.3杂交 盖上芯片盖片,取变性后的产物20L加人点样区,芯片用锡箔纸包装,置湿盒中在烘箱46C避光 杂交3h 7.6.4清洗 杂交后的芯片依次在42C预热的洗液I、,洗液I中磁力搅拌清洗2nmin 7.6.5离心 芯片置15mL离心管中,2000r/min离心2min除去水分 芯片扫描 杂交后的芯片用芯片扫描仪在远红外光区532nm处进行扫描,PMT值设为800 通过扫描仪软 件获得所有探针阵列的荧光数据 注;芯片扫描结果存人计算机,扫描后芯片避光室温保存
GB/r28065一2011 7.8结果判读 芯片杂交信号判读原则见附录D 在质控探针和定位点探针杂交信号正常的情况下,检测探针杂 交信号满足以下情况判定为地中海实蝇 实蝇科探针(teph)杂交信号阳性; -地中海实蝇和非洲芒果实蝇近缘种探针(caro)杂交信号阳性; 地中海实蝇和纳塔尔实蝇近缘种探针(caco)杂交信号阳性; 地中海实蝇特异探针(ccca)杂交信号阳性
GB/T28065一2011 附 录A 规范性附录 地中海实蝇生物芯片检测探针,质控探针及探针阵列 A.1地中海实蝇生物芯片检测探针见表A.1 表A.1地中海实蝇生物芯片检测探针 探针类型 探针名称 探针序列(5'-3’ 特异性说明 科通用探针 teph AGCAAAGACTGCTCCTAT'TGATAAT 实蛹科通用探针 地中海实蝇和非洲芒果实蝇 近缘种特异探针 ATAGCTGGGGAATAATTTAATTG caco 近缘种探针 地中海实蛹和纳塔尔实邮 近缘种特异探针 CGTTAAACCTCCAACTGTAAA caro 近缘种探针 种特异探针 AGAACAACGCCCGTTAAACC 地中海实蝇特异探针 ccca 种特异探针 CTGTTAAACCCCCAACTGTGA 非洲芒果实蝇特异探针 ccco 纳塔尔实蝇特异探针 种特异探针 pro ACATAATGGAAGTGTGCTACAAC A.2地中海实蝇生物芯片检测质控探针见表A.2 表A.2地中海实蝇生物芯片检测质控探针 长度 类型 代码 序列(5'3' nt A 定位点探针 TGGATACCCAACTTAGCTATTAATAGTC 28 阳性对照探针 TGAGAccAAccAAcTGAAAcG P 21 阴性对照探针 N GAcTATAG;TATAAGcGcGG;TccAN 23 B 空白对照 空白对照为水对照
GB/r28065一2011 B 附 录 资料性附录 芯片检测探针点阵图及在基片上布局示意图 B.1地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图见图B.1 A A teph teph teph A caco caco caco aro caro caro A ccca ccco ccco ccco ccca ccca cpro epro cpro P P P B 图B.1地中海实蝇芯片检测探针阵列示意图 B.2探针点阵在基片上布局示意图见图B.2 单位为毫米 川栏芯片 n 鸟 -1z1B.豆-IB.5_IB豆 说明 每张基片有四个探针点阵(小正方形区域)》. 图B.2探针点阵在基片上布局示意图
GB/T28065一2011 c 附 录 规范性附录 荧光标记PCR引物反应体系和阳性质粒序列 C.1地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物(李文芬等2008)见表c.1 表C.1地中海实蝇生物芯片检测荧光标记PCR引物 长度 引物序列(5'-3’y 正/反向 来源基因 引物名称 nt 27 T'TTTAGTTGACTGGCTACATTACATGG 正向 CO1 CTGGAGGGGTATTTGAAGTcATT 24 反向 C.2荧光标记PCR反应体系见表C.2 表C.2荧光标记PCR反应体系见表 PR反应体系终浓度 试剂名称 杂交信号阳性参考体系 10×缓冲液(Mg十) 1.5mmol/1. 1.0Al dNTP 0.2mmol/L 0.2L 正向引物P 0.2mnmol/L 0.2儿 反向引物P 0.2mmol/L 0.2l Ta酶 0.15l DNA模板或阳性质粒 10ng~20ng 0.5Al 去离子水 补足反应总体积到10山 7.75l 反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整 dNTP配方(以10Al为例);dATP1L，dCTP1AL,dGTP1L,dTTP0.65Al，lmMCY3-dCTP3.5Al 去离子水2.85Al. 实蝇芯片阳性质粒序列扩增长度;235bp TTTTAGTTGACTGGCTACATTACATGGCACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATAT TCAGAGCGAATCATCT(GTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAG AGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAA TAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTGAATGACTTCAAAATACCCCTCCAG 注:实蝇芯片阳性质粒载体为T载体
GB/T28065一2011 附 录 规范性附录 杂交信号阳性结果判读原则 每个检测点信号值=该点荧光强度值一该点背景强度值 D.1 D.2空白对照平均信号值=3个空白对照点信号值的平均值 D.3阴性对照平均信号值=3个阴性对照点信号值的平均值一空白对照平均信号值 D.4每条探针的每个检测点信号值一空白对照平均信号值>3倍阴性对照平均信号值即判读该检测 点为阳性 D.5每条探针的3个重复检测点平均值为阳性即判读该条探针杂交结果为阳性 D.6如定位探针部分或全部为阴性,则表明探针与片基结合有问题,实验结果不准确,重做试验 D.7如阳性对照为阴性,则表明扩增标记环节或杂交环节存在问题,实验结果不准确,重做试验

地中海实蝇生物芯片检测方法GB/T28065-2011

地中海实蝇是一种危害性很大的害虫，其幼虫在果实内孵化并发育，使得果实腐烂影响果实品质。为了有效地预防和控制地中海实蝇的危害，需要采用先进的检测技术来保证果实的质量安全。

《地中海实蝇生物芯片检测方法GB/T28065-2011》是一种基于生物芯片技术的检测方法，在地中海实蝇检测领域具有重要意义。该标准通过对地中海实蝇DNA序列的分析，设计出适用于地中海实蝇检测的特异性探针，并将这些探针固定到生物芯片上，形成生物芯片检测体系。

使用该方法进行地中海实蝇检测时，只需要将待检样品DNA提取出来，经过PCR扩增后加入到生物芯片上进行杂交反应。利用光学成像技术的探针-目标反应信号，在生物芯片上实现了对地中海实蝇的快速、准确、高通量检测。

相比传统的地中海实蝇检测方法，该生物芯片检测方法具有检测速度快、敏感性高、操作简单等优点。此外，该方法还可同时检测多个样品，适用于大规模的地中海实蝇检测工作。

总之，地中海实蝇生物芯片检测方法是一种高效、准确的检测方法，可以为果树防治管理和出口检验提供重要的技术支持。未来，随着技术的不断改进与升级，该方法将在地中海实蝇的监测和防控中发挥更加重要的作用。

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