国家标准 GB/T28075一2011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPseudomonassavastanoipv. phaseolicola(BurkholderGardanetal. 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28075一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 rnationalSeedTest 本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会(Intern Association,ISTA)的 sting SeedHealthTestingMethods第7-023号标准《豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测》编制,与 7-023:2008标准的一致性程度为非等效本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;厦门出人境检验检疫局,上海出人境检验检疫局本标准主要起草人;林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣,吴媛、陈红运、王宏毅
GB/T28075一2011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法范围本标准规定了萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的生物学,血清学和分子生物学的检测鉴定方法本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料及其产品中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测与鉴定萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息中文名;萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型(菜豆晕疫病菌) 学名:Pseudomona、saastanopvphaseolicokaBurkholder，1926Gardan，Bollet，Abu Ghorrah，Grimont Grimont，1992 病害英文名:haloblightofbean 同物异名;Bacte riummedicagini haseolicola(Burkholder)Link&.HIull,1927 Bacteriumn Hedges,l927 Sackett)var.phaseolicolaBurkholder,1926 Hedges)Bergeyetal.,1930 medicaginisvar.haseolicola(Burkholder)stapp&.Kotte,1929 phaseolicola(Burkholder)Dowson,1957 seudomonasmedicaginisBurkholder,1926 seudomonasphaseolicola(Burkholder)Dowson,1943 Pseudomoassyringaepv.haseolicola(Burkholder)Young,Dye8.wilkie,1978 Xanthomonasmedicaginisvar.phaseolicola(Burkholder)Eliot,1951 属原核生物界Procaryotes,变形细菌门Proteobaeteria、-变形细菌纲Gammaproteobacteria、假单胞杆菌目Pseudomonadales、假单胞杆菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas、萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A 方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态,碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA、基于体外DNA合成技术的聚合酶链式反应(PCR)以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂: 蛋白陈、氯化钠,硫酸镁,磷酸氢二钾,蔗糖、酪胺酸、甘油,碉酸、头抱氨节、万古霉素、澳酚蓝、放线菌)酮或制霉菌素、三氯甲熔、异戊醉,异丙醇、Tris-盐酸,EDTA,SDs十二婉基硫酸钠,CTAB(十六烧基三甲基澳化胺),溴化乙锭等PCR相关试剂
GB/28075一2011 主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备;超净工作台、高压灭菌锅、显微镜,培养箱,电子天平、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、BOL0G微生物鉴定仪、酶标仪病菌分离种子样品的制备检查种子表面的为害状与异常情况,感病豆荚的种子可能皱缩,种皮有奶黄色的斑块每份检测样品至少检测2000粒种子根据检测种子样品的质量(g),按照1:1.5(质量:体积)的比例,在样品种子中加人无菌燕儡水,如500g种子则加人750ml;于4C5下静置12h~18h 取种子浸出液 10mL,用15550g离心5min,用蒸僧水分2次(每次1mL)洗下沉淀物,制成种子浸出液 6.2种子中病菌的分离培养取100aL的种子浸出液涂布于MT和(或)MSP培养基平板(培养基的配制见附录B) 每个处理一;个重复,无菌水作为空白对照至少3个在27C士2下培养,3d后开始观察发现可疑菌落菌落形态特征见6.4),将菌落转移至KB 平板上培养1d2d培养基的配制见附录B),纯化3次后进行生化鉴定,或DAsE:LISA,或PCR等方法鉴定植物组织中病菌的分离培养仔细检查症状(参见图A.7),用无菌刀片将感染组织切成细的切块,加一滴无菌水置于载玻片上" 然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌脓如有,直接蘸取菌脓,或将菌脓转移人lml无菌水中，在MT和(或)MSP平板上划线分离(培养基的配制见附录B) 选择新鲜症状的叶片,豆荚等组织,切取病斑前沿部分2mm~7mm的组织,用70%酒精表面消毒 15s,无菌水洗2次3次,在MT和(或)MSP平板上培养在27C士2下培养,3d后开始观察发现可疑菌落(菌落形态特征见6.4),将菌落转移至KB 平板上培养1d2d(培养基的配制见附录B),纯化3次后进行生化鉴定,或DAS-ELISA,或PCR等方法鉴定菌落形态特征 6 可疑菌落在KB培养基上划区培养至少20个菌落,在28下培养24h一48h,观察有无荧光色素产生,并进行革兰氏染色及鞭毛染色菌落在以下培养基上产生如下特征,可以确定可疑菌落在MSP培养基上;Psph菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅 3d后,菌落边缘的培养基变成淡黄色(参见图A.6) 在MT培养基上:Psph菌落奶油状.、乳白色扁平,圆形直径4.5mm n5.0m mm;在紫外光下,多数菌落产生淡蓝色的荧光(参见图A.7) 在KB培养基上;Psph的菌落扁平,乳白色和奶油状;3d后,产生蓝绿色荧光丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseoomomas syringaepv.syvringae)的一些菌株与Psph一样,在 MSP培养基上培养3d后,菌落边缘的培养基也变成淡黄色但是,Psph的菌落边缘不整齐
GB/T28075一2011 病菌鉴定 7.1生化鉴定采用BOL.OG微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定 7.2DAs-ELISsA方法将可疑菌落配制成1o'cFU/nL悬浮液,取10L悬浮液作为检测样晶每个检测样晶重复 -次用已知菌株作阳性对照,用缓冲液作空白对照具体操作步骤见附录C 7.3PCR方法将可疑菌落制备成10'CFU/nmlL的细菌悬浮液,进行PCR扩增或者把可疑菌落转到NB培养基中(培养基配制见附录B),在25C士2C下振荡培养过夜,离心后提取沉淀的DNA,进行PCR扩增用已知菌株作阳性对照,用无菌水作空白对照具体操作步骤见附录D. 致病性测试 7.4.1概述如果生化鉴定、或DAsELIsA、或PCR方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性,则进行致病性测试以确认鉴定结果致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法 7.4.2针刺接种用牙签或解剖针蘸取在KB培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落,在弯颈期的小苗上刺伤接种子叶的近胚轴面用无菌水接种叶片作空白对照最少接种10个菌落,每个可疑的菌落接种10株以上小苗，每株接种至少2个接种点每次接种前,牙签或解剂剖针都要消毒接种4d5d后,子叶内部可以见到典型的“油脂”状斑点如果8d10d后没有出现症状,则可判定为非致病菌 7.4.3浸泡接种将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上,保湿,25C黑暗条件下培养2d 可疑菌落在KB上培养1d~2d后,用无菌水配制成10*CFU/mL的悬浮液用解剖针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮,在悬浮液中浸泡10min15min 每个可疑菌落接种10粒以上种子设无菌水作空白对照将浸泡后的种子种植在无菌的土壤中,20C下高湿培养 5d7d. 种子萌发后,在子叶上出现“油脂状”的斑点,第一真叶也可能出现症状如果8d~10d后没有出现症状,则可判定为非致病菌结果判定与检测报告结果判定 8.1.1未分离到可疑菌落如果经MT或MSP培养基分离培养,7d后仍未产生可疑菌落,则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生
GB/28075一2011 致病型 8.1.2分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落,应经生化鉴定、或DAs-ELIsA或PCR方法检测,并通过致病性测试的确认如果生化鉴定、或DAsELIsA,或PcR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性,致病性测试也产生典型症状,则判定为阳性,检出萨民假单胞杆菌菜豆生致病型，如果生化鉴定、或DAsELIsA、或PCR的结果为阴性,则判定为阴性,未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型如果生化鉴定、或DAsELISA、或PCR检测中一种或一种以上方法的结果为阳性,但致病性测试为阴性,则应重新进行致病性测试致病性重新测试后,如果仍然未产生典型症状,则判定为未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型 8.2检测报告检测报告应包含所采用的检测方法所产生的数据,包括DAs-ELIsA检测结果的吸光值数据报告、菌落形态特征照片,PCR检测的电泳图片或致病性测试结果的照片等
GB/T28075一2011 附录A 资料性附录萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型相关资料 A.1检疫重要性属2007年公布并实施的《进境植物检疫性有害生物名录》 A.2地理分布非洲;埃及、马达加斯加、尼日利亚、南非等美洲:阿根廷,巴巴多斯、百慕大,巴西,加拿大,哥伦比亚,多米尼加、古巴、格林纳达、牙买加、墨西哥,波多黎各、圣文森特、美国、乌拉洼、委内瑞拉等亚洲;缅甸、柬埔寨,菲律宾、韩国、日本,印度尼西亚、以色列,文莱,黎巴嫩,马来西亚、尼泊尔,斯里兰卡,印度等欧洲,保加利亚,英国,芬兰、法国、德国,希腊、荷兰,匈牙利、意大利、摩洛哥、葡萄牙、罗马尼亚土耳其,俄罗斯、西班牙、前南斯拉夫、瑞士等大洋洲;澳大利亚、新西兰、西萨摩亚等 A.3寄主植物多花菜豆(P 菜豆Phaseol4sulgaris)、大豆Gyciea.r、 7muli/orus、碗豆Pisum sativum)、绿豆(Vignaraiale)、豇豆(V.unguiculalta、扁豆(Dolichoslablab)、赤豆(Phaseolu4sangus laris),木豆(Cajianuscajan),野葛(Puerariathunbergiana)和桑橙(MMacluraomi/era)等传播途径病菌附着在种子表面,多在种皮的外表和里面,严重为害时才侵人子叶,但不会侵人胚乳种子带菌率一般在1%10%之间.一般的商业用种子带菌率为1%以下病菌可通过种子进行远距离传播田间可通过风吹雨溅,洒水灌慨传播,但沟灌或畦灌不会传播冬季在土壤或菜豆植株残体上不能存活,但在于野葛的溃疡病斑上能越冬 A.5症状特征该病菌可通过气孔侵人,引起系统侵染,叶、茎,荚和种子等部位均可发病病菌产生毒素导致黄色褪绿晕圈,毒素可以转移到无病斑的叶片上,产生类似病毒病的中脉褪绿、花叶和畸形等症状潮湿时叶,茎和荚等部位的病斑上常有黄色粉状物晕疫病的症状随温度等变化而异，一般在16C20C时才会有晕圈产生大雨和低温有助于晕疫病的发生和蔓延,而温暖气候有利于细菌性萎藉病的发生在叶片上,初期在叶的两面产生水溃状小斑点,扩大后成不规则形,深褐色,边缘有黄色晕圈,干燥时似羊皮纸,半透明,质脆易破裂,最后全叶干枯,严重时似火烧状;病斑周围具黄色褪绿晕圈,后期的叶片坏死,畸形
GB/28075一2011 叶片症状见图A.1一图A.3 在茎秆上,病斑为水溃状,红褐色,稍凹陷,长条形,后开裂,有时渗出细菌菌脓,引起茎的环状剥皮或萎蔫在豆荚芙上,病斑(见图A.4)通常表现为类似脂点的暗绿色斑点,凹陷,近圆形或不规则形;豆荚中的种子皱缩(见图A.5),有浅褐色凹陷的小斑,种皮偶有奶黄色的斑块等症状在种子上,严重感染的干燥种子会变色，纵向皱缩或具外缘整齐、稠密的黄色斑在紫外灯 350nm一450nm)下观察,产生白色荧光的表明被感染多数种子没有明显症状图A.1菜豆叶片上的早期症状图A.2菜豆叶片上的症状图A.3绿豆叶片上的后期症状图A.4豆荚上的暗绿色斑点图A.5豆荚皱缩症状
GB/T28075一2011 A.6菌落培养特征该病菌在不同的培养基上产生不同的特征,在MSP培养基上的菌落特征参见图A.6,在MT培养基上的菌落特征参见图A.7 注:图片引自ISTA(2006) 图A.6在MSP培养基上的菌落图A.7在MT培养基上的菌落
GB/28075一2011 附录B 规范性附录培养基的配制 B.1生理盐水将8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中,121C湿热灭菌15min;加人0.2mL吐温-20. B.2NB培养基(NutrientBroth 蛋白陈5.0g,牛肉浸膏3.0g,燕憎水1000mL,121C湿热灭菌15min B.3kB培养基(改良KB培养基,King,etal.,1954 称取以下试剂:3号肮蛋白陈20.0g,磷酸氢二钾(K.HPo,)1.5g,硫酸镁(MgSo7H.O)1.5g 甘油15.OmL,琼脂15.0g,倒人1L的烧杯中,加100ml的燕懈水,搅拌溶解在121下湿热灭菌15min;冷却至45笔50笔后,加人头袍氨节(Cephalexin50mg(溶解于 75%的酒精中,配制成25×10‘浓度) 把培养基缓慢地倒人培养皿内(每个直径9cenm的培养皿20mL),避免产生气泡培养基在超净工作台凝固后直接使用,或者反扣过来装人塑料袋中,在4C下保存最长的保存时间是2周~3周,否则抗生素会失效 B.4M培养基(牛奶土温琼脂培养基,Goszczynska&Serfonten,1998) 称取所有的A原液(见表B.1)倒人适宜的容器内,加500mL蒸僧水;将脱脂奶粉倒人500mL水中溶解;准备10mL的吐温-80;将A,B,C原液分别在121C下灭菌消毒15min;在无菌的条件下,将 BC原液(见表B.1)加人A溶液中;待冷却到45C一50C时才加人抗生素(见表B.1);缓慢地倒人培养m内(每个直径9cm的培养m20mL.),避免产生气泡表B.1M培养基配方比例成原液 ml或g/L 3号肮蛋白陈 10,0g 氧化钙 ,25x 0 瞥胺酸 0.5g 琼脂 15.0g 蒸僧水 500ml 脱脂奶粉 10.0g 燕憎水 500ml.
GB/T28075一2011 表B.1(续) 比例成原液 ml或g/L 吐温-80(10% l0,0ml 放线(菌)酮(eyeloheximide)或40×10-"的制霉菌素 200mg 头袍氨节(eephalexim) 80.0mg 万古霉素(vancomycein 0.0mg 在超净工作台凝固后直接使用,或者反扣过来装人塑料袋中,在4c下保存最长的保存时间是 2周~3周,否则抗生素会失效 B.5sP培养基(改良的蔗糖蛋白膝琼脂培养基,.ohan&Schaad,1987 称取所有的A原液(见表B.2)倒人适宜的容器内,加1000mL蒸僧水将试剂溶解;在121下灭菌消毒15min;将培养基冷却到45一50C时加人抗生素(见表B.2);缓慢地倒人培养皿内(每个直径 9cmm的培养皿20mL),避免产生气泡表B.2MSP培养基配方比例成分原液 ml或g/L 蔗糖 20.0g 3号肮蛋白贿 5,0g 磷酸氢二钾(KHIPOD 0,5g 硫酸钱(Mgso71Ho) 0,25g 琼脂 20.0g 放线(菌)酬(eycohexinmide)或40×10-"的制霉菌素 200mg 头袍氨节(cephalexim) 3.2ml 万古霉素(vancomycin l1.0m 澳酚蓝(bromothymolblue) 1.0ml 在超净工作台凝固后直接使用,或者反扣过来装人塑料袋中,在4C下保存最长的保存时间是 2周~3周,否则抗生素会失效
GB/28075一2011 c 附录规范性附录 DAs-ELISA方法 C.1检测样品制备以种子浸出液可作为检测样品(制备方法见6.1 将可疑菌落的纯培养物可配制成10'CFU/mL的菌体悬浮液作为检测样品 C.2包被根据DAsELISA检测试剂盒说明,用碳酸钠缓冲液稀释抗体溶液(如1:200),在微孔板中每孔加人100A包被抗体溶液在室温下孵育2h4h或4下包被过夜 C.3捕获抗原倒去孔中的抗体包被溶液,用PBST洗3次(可在洗板机上完成) 加人样品提取物,每孔100AL 每个样品2个孔(重复1次) 并设置阳性/阴性和空白对照在室温下孵育2h或4c下过夜 C.4加入酶标抗体根据说明用酶标抗体缓冲液稀释相应的标抗体(如1:200) 倒去孔中的样品提取液,用PBST 洗3次(可在洗板机上完成) 每孔加人100uL酶标抗体溶液在室温下孵育2h C.5加底物用二乙醇胺缓冲液(pH9.8)配制1mg/mL 的对硝基苯磷酸酯的底物溶液倒去酶标抗体溶液,用 PBST洗3次(可在洗板机上完成) 每孔加人100Al新鲜配制的底物溶液室温下避光放置,直至阳性对照孔明显显色(约30min60min). 在准备底物溶液的过程中,不要接触药剂或暴露在强光中,避免在阴性对照孔中出现背景颜色 C.6结果判定 C.6.1对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔,应该在质量控制范围内,即缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15;阳性对照OD值/阴性对照OD值>2;同一样品的OD值应基本 -致 C.6.2在满足了C.6.1质量要求后,结果原则上可判断如下样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判为阳性; 样品OD值/阴性对照OD值在囤值附近,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证; 样品OD值/阴性对照OD值明显<2,判为阴性 C.6.3若满足不了C.6.1质量要求,则不能进行结果判断 10o
GB/T28075一2011 附录 D 规范性附录 CR方法 D.1PCR模板的制备 D.1.1菌悬液CR模板的制备取3AL的10CFU/ml(OD=0.1)的菌体悬浮液,转人装有100l无菌双蒸水的1.5l离心管中,在99C水浴10min,10000g离心10min.冷却后,取上清液作为PCR反应模板 D.1.2DNA的提取取1mL在NB培养基中振荡培养过夜的菌液,10000g离心2min,提取沉淀的DNA;或者取0.1g 的发病植物组织,研磨后,提取植物总DNA 具体提取步骤根据所采用的DNA提取试剂盒 D.2引物用于检测Psph的特异性引物及其序列见表D.1,可由有关生物公司合成和纯化表D.1用于CR检测的引物及其序列引物名称引物序列扩增片断大小 HB14F 5'-CAACTCCGACACCAGCGACCGAGC-3” 1375bp 5'-CCGGTCTGCTCGACATCGTG;CCAC-3” HB4R D.3PCR反应体系 50AL反应体系中加人:10×PCR缓冲液(含MgCl.)5.0AL,10mmol/L的dNTP混合物1.0L TaqDNA聚合酶(5U/L)0.5AL,104mol/L的上下引物各2.0L.,DNA模板3Al,去离子水补足至 50l D.4反应条件在PCR仪上完成以下程序;95C预变性3min;然后94C变性1min,65C退火1lmin,72C延伸 2min,共35个循环;最后在72C下保持10min. D.5电泳分析取5L扩增产物与1AL的6×上样缓冲液混合均匀,在1×TBE缓冲液配制的1.5%琼脂糖凝胶中,50V电泳45min,用荧光染料或溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中观察,拍照并保存
GB/T28075一2011 D.6结果判定在阳性对照扩增出预期的1375p大小的条带,阴性对照和空白对照没有扩增到预期大小条带的条件下如果检测样品扩增到与阳性对照大小相一致的条带,则PCR检测结果为阳性; 如果检测样品没有扩增到与阳性对照大小相一致的条带,则PCR检测结果为阴性

萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法GB/T28075-2011介绍

萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型是一种危害极大的病原菌，能够对多种蔬菜作物造成严重的危害。为了及时有效地进行预防和控制，需要对其进行准确的检测和鉴定。

国家标准GB/T28075-2011规定了一套完整的检疫鉴定方法，包括了样品采集、处理、分离、培养和鉴定等多个环节。下面将对其中的几个关键步骤进行简要介绍。

样品采集

首先需要在疑似感染区域采集植物样品，建议在病部位（如根、茎）取样。采样时应避免污染，并尽可能保证样品的新鲜度。

处理与分离

取得样品后，需要进行预处理和分离纯化。该标准规定使用高温处理和富集培养法进行分离。具体方法为：将样品加入含有富集剂的液体培养基中，通过高温处理促进菌落生长，然后通过不同的选择性培养基进行分离纯化。

鉴定

最后，需要进行菌株鉴定。该标准规定使用的鉴定方法主要包括：形态学特征观察、生理生化指标检测、分子生物学方法等。通过这些鉴定手段可以准确判断样品中是否存在萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型。

总的来说，国家标准GB/T28075-2011规定了一套可靠、高效的检疫鉴定方法，对于萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测和控制具有重要意义。