猪水泡病诊断技术

猪水泡病诊断技术

国家标准 GB/T19200一2003 猪水泡病诊断技术 Diagn0stictechniqesforswinevesieulardisease 2003-06-17发布 2003-12-01实施 出,旋金贴是 发布国家标准
GB/T19200一2003 前 言 猪水泡病(SwineVesieularDisease,简称sVD)是猪的一种烈性传染病,被世界动物卫生组织 ationforAnimal [worldOrganizat nalHealth(英),OfficelnternationaldesEpizooties(法),OIE]列为A类 疾病,我国将其列为一类动物疫病 本病主要在猪的蹄踵、蹄冠、唇,舌、鼻及乳头部引起水泡,临床症状 与猪口蹄疫(FootandMouthDisease,简称FMD)相似 本标准提出的实验室方法主要是以世界动物卫生组织(OIE)《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病 诊断试验和疫苗标准手册》为依据,并结合我国实际情况制定,其中“猪水泡病反向间接血凝试验"是我 国建立的方法 本标准的附录A、附录B附录C,附录D,附录E均为规范性附录 附录F为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位:农业科学院兰州兽医研究所 本标准主要起草人;张永光、牢克斌、王永录、刘西兰,方玉珍
GB/T19200一2003 猪水泡病诊断技术 范围 本标准规定了猪水泡病稍毒分岗及整定,反向间接血凝试验(RH)琼脂凝散免疫扩散试验 AGID)和病毒中和试验(VN)的技术要求 本标准适用于猪水泡病的诊断 反向间接血凝试验和琼脂凝胶免疫扩散试验适用于大批样品筛选 试验包括产地检疫、疫情监测、流行病学调查和无本病健康猪群的建立;病毒中和试验(VN)适用于诊 断和进出口猪检疫及抗体水平的评估 病毒分离及鉴定 2.1材料准备 2.1.1灭菌注射器,研钵 2 .1.2pH7.6,0.05mol/L的磷酸缓冲液(PB),pH7.6,50%的丙三醇磷酸缓冲液(GPB),pH7." 2、 0.11mol/L的磷酸缓冲液(PB),配制方法见附录A 2.1.3仔猪肾传代细胞(IBRS-2),乳鼠 2 1.4细胞培养液,见附录B 2.2样品的采集及处理 2.2.1水泡液:将水泡表面用75%酒精棉球消毒用注射器抽取水泡液,直接放人灭菌小瓶中,加盖封 口,避光送至实验室,不做处理直接用于检测 2.2. 水泡皮:采集鼻镜、蹄部新鲜水泡皮,采集量为0.5g以上,放人预先加有pH7.6,50%的GPB 2 的灭菌瓶中,加盖封口,送至实验室 2.3细胞分离 2.3.1新鲜水泡液不做任何处理,可直接使用 当BRs-2长满单层细胞后,弃去培养液,加人水泡 液,以能淹没细胞单层为宜,于37C感作30min,然后补加4倍于水泡液的细胞培养液,置37C培养 每天在倒置显微镜下观察2次,48h终判,若细胞培养液对照孔成立,分离病毒的细胞孔细胞出现变圆 乃至脱落,则视为细胞病变(CPE)判为阳性若48h不出现CPE,则应冻融2次,再育传3代,不出现 CPE,判为阴性,出现CPE,则需做进一步鉴定 2.3.2水泡皮的分离,将水泡皮用pH7.2,0.1lmol/LPB洗2次3次,用灭菌滤纸吸去水分,称其 质量后置于加少量石英砂或玻璃砂的研钵中,按质量体积比(1:2)(1:5)加人pH7.2,0.11mol/1 PB研磨,制成悬液,室温浸毒1h或4C12h,以3000r/min离心20min一30min,取上清液用于病毒 分离 乳鼠分离 2 .4.1乳鼠为2~3日龄小鼠,每份材料接种4只小鼠,每只颈背部皮下接种0.1mL0.2nmL..在母 鼠哺乳下观察5天 .4.2若5天内出现神经症状乃至死亡,剥皮去头及内脏,将肌肉及骨胳一起称量,按质量体积比加 2 9倍的细胞培养液,加玻瑞砂研磨制成悬液,置4C浸毒过夜,以1000r/min离心10nmin,取上清液用 于进一步鉴定 2.5反向间接血凝试验(RIHA)鉴定分离物
GB/T19200一2003 2.5.1材料准备 2.5.1.196孔V型聚乙烯血凝滴定板(110度),微量振荡器或微型混合器,0.025nml,0.05ml稀释 用滴管、乳胶吸头或25L,50L移液加样器 2.5.1.2稀释液I、稀释液I,配制方法见附录C 2.5.1.3标准抗原、标准阳性血清 2.5.1.4敏化红细胞诊断液,效价滴定见附录D. 操作方法 2.5. 2 使用标准抗原进行猪水泡病与口蹄疫A、O,C,Asia-I型鉴别诊断 被检样品的稀释;把8支试管排列于试管架上,自第1管开始,每管加0.5mL稀释液I 第 管加0.5 m 被检样品,由左至右做二倍连续稀释即1;6、1;12、l;24l;768),每管容积 0.5ml 2.5.2.1.2按下述滴加被检样品和对照 在血凝滴定板上的第一排至第五排,每排的第8孔滴加第8管稀释被检样品0.05mL,每排的 aa 第7孔滴加第7管稀释被检样品0.05mL,以此类推至第1孔; b)每排的第9孔滴加稀释液I0.05mL,作为稀释液对照; 第一 一至第五排的第10孔按顺序分别滴加猪水泡稍和口踪疫A.o.c.Aiw-I" 型标准抗原 1:30稀释)各0.05mL,作为阳性对照 滴加敏化红细胞诊断液;先将敏化红细胞诊断液摇匀,于滴定板第一排至第五排的第1一 10孔分别滴加猪水泡病和口蹄疫A,O,C,Asia-I型敏化红细胞诊断液,每孔0.025ml,置微量振荡器 上振荡1min一2min,206 -35C放置1.5h一2h后判定结果 使用标准阳性血清进行猪水泡病与口蹄疫0型鉴别诊断 2.5.2. 2. 在血凝滴定板上的第一排至第四排,每孔先各加人25nL稀释液 2.5.2.2.2每排第1孔各加被检样品25Al,然后分别由左至右做二倍连续稀释至第7孔(竖板)或第 1孔(横板) 每排最后孔留作稀释液对照 2.5.2.2.3滴加标准阳性血清;在第一排,第二排每孔加人25稀释液l;第二排每孔加人25L稀 释至1;100的猪水泡病标准阳性血清;第四排每孔加人25Al稀释至1;20的口蹄疫0型标准阳性 血清;置微型混合器上振荡1nmin2min加盖置37C作用30min 2.5.2.2.4滴加敏化红细胞诊断液:在第一排和第二排每孔加人猪水泡病敏化红细胞诊断液25AL; 第三和第四排每孔加人口蹄疫型敏化红细胞诊断液25L;置微型混合器上振荡1min2min,加盖 于20C一35C放置2h后判定结果 2.5.3结果判定 2.5.3.1按以下标准判定红细胞凝集程度;“十”为100%完全凝集,，红细胞均匀地分布于孔底周 围;“”为75%凝集,红细胞均匀地分布于孔底周围,但孔底中心有红细胞形成的针尖大的小点; “十十”为50%凝集,孔底周围有不均匀的红细胞分布,孔底有一红细胞沉下的小点;“十”为25%凝集,孔 底周围有不均匀的红细胞分布,但大部分红细胞已沉积于孔底;“一”为不凝集,红细胞完全沉积于孔底 成一圆点 2.5.3.2操作方法2.5.2.的结果判定:稀释液I对照孔不凝集、标准抗原阳性孔凝集时试验方成立 2.5.3.3若只第一排孔凝集,其余四排孔不凝集,则被检样品为猪水泡病;若只第二排孔凝集,其余四 排孔不凝集,则被检样品为口蹄疫A型;以此类推 2.5.3.4致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价
GB/T19200一2003 2.5.3.5如出现2排以上孔的凝集,以某排孔的凝集效价高于其余排孔的凝集效价2个对数(以2为 底)浓度以上者即可判为阳性,其余判为阴性 2.5.3.6操作方法2.5.2.2的结果判定;稀释液I对照孔不凝集试验方可成立 2.5.3.6.1若第一排出现2孔以上的凝集(“”以上).且第二排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑 制,第三排、第四排不出现凝集,判为猪水泡病阳性 若第三排出现2孔以上的凝集(“十”以上),且第 四排相对应孔出现2个孔以上的凝集抑制,第一排、第二排不出现凝集则判为口蹄疫O型阳性 如水 泡病与口蹄疫均出现阳性反应,则判为同时感染水泡病与口蹄疫 2.5.3.6.2致红细胞50%凝集的被检样品最高稀释度为其凝集效价 琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID) 3.1材料准备 3.1.1平m(直径6,0em)、打孔器、微量注射器或加样移液器,印相暗盒或台灯 3.1.2琼扩精制抗原、标准阳性血清 3.1.3琼脂糖凝胶缓冲液(AGB),饱和硫酸铵,pH7.2,0.01nmol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.2、 0.01nmol/L的PBS),配制方法见附录E 3.1.4琼脂糖 3.2操作方法 3.2.1琼脂糖平板制备 取琼脂糖1.0g加人99mLAGB,103kPa10min融化灭菌 吸取8m琼脂液加到直径6em的 平皿内,制成3mm厚的琼脂板 待琼脂冷却凝固后加盖置于湿盒中,放4C冰箱备用 3.2.2打孔 孔径、孔距均为3mm,按图1所示式样打孔 用针头将孔内的凝块挑出,并用烧热的大头针沿孔 底部周围划圈封底 图1打孔式样 3.2.3被检血清样品的处理 3.2.3.1检疫用样品的处理56C水浴灭活30min 3.2.3.2与口蹄疫鉴别及其分型诊断用样品的处理;吸取56C水浴灭活30min的被检血清0.4mL 加pH7.2.0.0lmol/1的PBs0.4ml混匀,逐滴加人饱和硫酸铵溶液0.2ml,摇匀,室温静置20 rmin,8000r/min离心15min;取上清液逐滴加人饱和硫酸铵0.2mL,摇匀,室温静置20min,8000r 离心15min,沉淀物用0.2ml0.4mLpH7.2,0.01mol/L的PBS重新悬浮 此悬浮液供正式 min 试验用 3.2. 4 加样 每4份被检样品取5块平皿,按图2所示方式加样
GB/T19200一2003 SVD FMDA FMDC FMD0 Asin-I 图2加样方式 即中央孔分别加sVD,FMDA,O,C,Asia-I型精制抗原30l,每个平皿的1、4孔相应地加人 sVD,FMDA、O.C,Asia-I型阳性血清(用PBS做1:10稀释)30AL,作为阳性对照;每个平皿的2,3、 5,6孔分别加人被检1、2,3、4号血清样品30L 室温放置2h一3h,待样品扩散人琼脂层后,置于潮 湿小室中37C下扩散 3.2.5观察 扩散24h后开始观察 观察时可借助灯光或自然光源,也可用暗背景或用产生暗视野的观察箱， -般观察5d7d后做最终判定 3.3结果判定 3. .3.1每个平皿的1、4孔与中央孔之间均出现沉淀线试验方可成立 .3.2每个平皿的23、5、6四个样品孔与中央孔之间若出现沉淀线,则判为阳性,并与中央孔所加的 3 抗原同病(型!);若未出现沉淀线,则判为阴性 病毒中和试验(N)y 材料准备 50L移液加样器,微量细胞培养板,100ml细胞培养瓶,温箱,二氧化碳培养箱,倒置显微镜 4.1.2细胞;仔猪肾传代细胞(IBRS-2) 4.1.3细胞培养液(细胞生长液、细胞维持液),配制方法见附录B 标准病毒、标准阴性血清、标准阳性血清 4.2操作方法 本试验是50L量的等体积试验 4.2.1被检血清和阴性、阳性血清处理56C水浴灭活301 min 4.2.2稀释病毒:用细胞维持液(见附录B)将已测病毒滴度的病毒液稀释至含100TCD D 并按式 1)计算病毒稀释倍数(X X=(A一B)的反对数
GB/T19200一2003 式中:X 稀释倍数; -已测得50L病毒稀释液中所含病毒TCID数量的常用对数 B -中和试验要求每孔病毒量(100TcIDm)的常用对数,本试验为2 4.2.3稀释血清:从1:4稀释开始,将血清在板上横向做二倍连续稀释,每份血清做两排孔 4.2.3.1被检血清的稀释;用细胞维持液从1;4开始做二倍连续稀释,一般至1;64,若进行中和抗 体效价评估可进一步做二倍连续稀释 4.2.3.2阴性血清的稀释;用细胞维持液做1:4、1;8稀释 4.2.3.3阳性血清的稀释;用细胞维持液将已知效价的阳性血清从1:4开始做二倍连续稀释,直至血 清效价后两个稀释度 若血清效价为1;256,稀释至1:1024 4.2.4病毒-血清中和;向被检血清和阴性、阳性血清各稀释度的微量板孔中,逐孔加人等量(50L)的 稀释病毒液(每50l悬液中病毒含量为100TCID),加盖后于37C孵育1h 4.2.5接种细胞:向每个血清-病毒混合物及对照孔中加人50L浓度为每毫升10"个细胞的IBRS-2 细胞悬液 细胞对照孔加维持液100AL,阴性、阳性血清对照孔各加血清50AL和维持液50L,病毒 滴度复测对照孔加各稀释度病毒100Ala 4.2.6培养与观察:微量板加盖,用透明胶带密封,于37C温箱中孵育48h一72h;也可选用合适的盖 子将板盖紧,置于含5%二氧化碳的培养箱中,在37C孵育48h~72h 每天用倒置显微镜观察致细胞 病变(CPE),并记录结果 猪水泡病病毒(SVDV)的CPE:在光学显微镜下SVDV致病变的细胞变圆,固缩而成颗粒状,聚集 成堆或散在,大小均匀,折光率强,细胞质内有空泡,部分细胞脱落或崩解成碎片 在观察时应注意区分 病变与衰老或理化等因素造成的细胞变性死亡 4.3结果判定 7C孵育72h后,可将板最后固定并进行常规染色 用10%福尔马林盐水固定30min,再将微量 板浸人用10%甲醛配制的0.05%亚甲蓝中染30nmin,并将板在水龙头下冲洗干净,做最终判定 4.3.1判定条件 细胞层蓝染是阳性,不着色为阴性 正常细胞对照;生长良好,无CPE,细胞层蓝染 阴性血清对照;效价1:4及以下,细胞层不着色 阳性血清对照;再现原血清效价或允许误差在原效价的2倍以内(2=1) 原血清效价为1:256,允 许误差范围为(1:125)(1:512). 病毒滴度复测对照;再现原病毒滴度或允许误差在原滴度的士0.5以内(士0.5lgTcIDa) 如病 毒原滴度为10-了", ,病毒复测滴度应在10-乱百10-了之间 当上述对照正常时,该中和试验成立并按下列方法和标准判定 4.3.2判定 4.3.2. 两孔的细胞都病变,细胞层不着色,判定为中和抗体阴性 4.3.2.2两孔的细胞都不病变,细胞层蓝染,判定为中和抗体阳性 4.3.2. 其中一孔细胞病变,不着色,另一孔细胞不病变、蓝染,判定为可疑 4.3.2.4中和抗体效价评估;病毒-血清混合物能使细胞孔50%不发生CPE的血清最高稀释度,即为 该血清的中和抗体效价 4.3.3判定标准 根据OIE(《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册>(2000版)推荐的水泡病 诊断方法,被检血清中和滴度达1:45或更高判为阳性,按凯波尔(Karber)氏计算方法计算血清中和滴 度,计算方法参见附录F,1:161:32判为可疑,l;11及以下判为阴性 如果必要,可疑及个别阳性 样品应重检
GB/T19200?2003 ? A 淶?? ?? A.1p7.6,0.05mo/L??(PB) ?;(NaHPO12H.o) 17.9g ?1000ml ?;(NaH.PO2H.O) 7.8g ?1000mL ??870mL.?130ml,?pH7.6,0.05mol/LPB A.2p7.6.50"%???(GPB) 1??(?)ptr.6.0.Gmml/LB,0kPa?10mm A.3pH7.2.0.11mo/L??(PB) ?;(Na,HPO12H,O) 39.4g ?1000ml ?;(NaH.PO2H.o) 17.2g ??1000ml ??720ml?280ml??pH7.2,0.llmol/LPB B ? 淶?? ??? ??: 10% ?? 45% Eagle-MEM(Eagle????? 45% 0.5%LH(?鵰,LactalbuminHydrolysate)-Hanks(Earles) 1oU/nl.Io'nl ?ù 7.5%? pHH7.2 ???:????
GB/T19200?2003 ? 淶?? ??? c.1??I ?-12000 0.5g ?(62C??30min 0.0mL (NaN, 1.0g pH7.2,0.11mol/LPB10001 ml,4C8C c.2??I 115.0mL 0.1mol/(NaHPO2Hl.O) 385.0mL 0.1mol/L(NaHPO12H.O) 8.5g ?(NaCI 25.0 ??(PVP mg 0.05mL -80(Tween-80 1.0g (NaN ??1000mL,???5mL,4C8C D ? 淶?? ??ζ ??1:10?(???130),????,1:601:120 l;3840,μ???1:60??á ? E 淶??) ?? E.1??(AGB) ? 15.0g ? 0.52g l.0g ?200mL.,0.2mol/LpH7.9 E.2pHH7.20.01mo/Lλ?(PBs) 39.4g ?;(Na;HPO12H.O) ?1000 ml
GB/T19200一2003 乙液;磷酸二氢钠(NaH_PO2H.O) 17.2g 加燕憎水至1000ml 取甲液720mL、乙液280mL混合,即为pH7.2,0,01mol/儿的PBS E.3饱和硫酸铵的配制 将760只硫酸铵加人1000mL蒸馏水,加温完全溶解(温度不超过80C);室温放置冷却后,用浓氨 水调pH至7.2~7.4 在室温下有少量硫酸铵析出,其上清液即为饱和硫酸铵 附录 资料性附录 凯玻尔(Kirber)计算方法 固定病毒-稀释血清法(B法 这种方法是将不同稀释度的血清与固定量病毒液(一般为100个TCID.)混合,置适当的条件下感 一定时间以后,再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞中,测定被检血清阻止组织培养细胞发生病毒 作一 感染的能力及其效价 以能够保护50%组织培养细胞不发生稍空.感染或死亡的血请最商稀释信数 作为该血请的s0%中和效价PD.) 按式(F.1)计算 PDm(以对数表示=L十d(s一0.5) 式中 最低稀释度用对数表示); -组距,即稀释系数(用对数表示); -各组死亡(或感染)或保护的比值[死亡(或感染)数/接种数]的和(用对数表示) 举例说明如下(见表F.1): 表F.1Karhe法计算中和滴度示例 血清稀释度 保护比率 血清稀释度 保护比率 1/4=10-0," 4/4=1 1/256=10 0/4=0 l.2 3.W 3/4=0.75 0/4=0 1/16=10 1/1024=10 -1.8 2/4=0.5 -10 1/64=l0 注，接种剂量为0.1 lml L=一0.6 d=一0.6 S=2.25 PD.以对数表示)=一0.6一0.6(2.25一0.5 =一1.65 即待检血清的50%中和效价=10-l的=1/45,也就是1:45稀释的待检血清可保护50%的组织培 养细胞免于感染,死亡或出现CPE F.2固定血清-稀释病毒法(a法 这种测定方法是在固定量的血清中,加人等量不同稀释度的病毒,用对照非免疫血清(对照组)和待 检血清同时进行测定,计算每一组的TCID0,然后计算中和指数表F.2) 按式(F.2)计算 试验组TCID. 中和指数= F.2 对照组TCD
GB/T19200一2003 表F.2固定血清稀释病毒法计算中和指数示例 病毒稀释度 10-" 10- 10- 10- 10- 10" 10" TCID 5，5 对照血清组保护率 4/4 3/4 1/4 0/4 10 一2. 待检血清组保护率 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 10 根据表F.2计算 10-2， 试验组TCID =1995 中和指数 对照组TCD 0 说明待检血清中和病毒的能力为对照血清的1995倍 通常,待检血清的中和指数大于50者,即可 判为阳性;10一49为可疑;小于10为阴性
GB/T19200一2003 参 考文献 世界动物卫生组织(OIE).农业部畜牧兽医局译 哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和 疫苗标准手册 农业科学技术出版社.2002 1o