牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中甲硝唑、洛硝哒唑、二甲硝唑及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22982一2008 牛奶和奶粉中甲硝陛、洛硝哒陛 二甲硝陛及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofmetronidazole,ronidazole,dietridazoleresidues inmilkandmikpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22982一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:王凤池、艾连峰、郭春海、段文仲、陈瑞春、吕红英、窦彩云、马育松、庞国芳
GB/T22982一2008 牛奶和奶粉中甲硝陛、洛硝哒陛 二甲硝陛及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中甲硝陛、洛硝哒陛、二甲硝陛及其代谢物残留量的高效液相色谱-串联 质谱测定方法 本标准适用于牛奶和奶粉中甲硝陛、洛硝哒陛、二甲硝陛及其代谢物残留量的测定和确证 本标准的方法检出限牛奶中甲稍幽、洛确哒幽、二甲稍幽为0.5g/ke,郑基甲确幽为1g/kg 1-甲基-2-胫甲基-5-硝基眯陛为2.54g/kg;奶粉中甲硝陛、洛硝哒哗、二甲硝陛为2.5ug/kg,胫基甲硝 幽为5g/kg,1-甲基-2-羚甲基-5-硝基咪哗为12.54g/kg" 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义(GB/T6379.1 2004,Is05725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2:1994,IDT (GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696:1987,MOD 原理 用乙睛-乙酸乙酯提取试样中的分析物,阳离子固相萃取柱净化,高效液相色谱-串联质谱测定,内 标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为液相色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1 乙睛 42乙酸乙醋 4.3甲醇 4.4丙酮 4.5乙酸 6 氨水 4 无水硫酸钠,分析纯:经650C灼烧4h,置于干燥器内备用 4.8氨水乙朋1十1)量取百mL氨水,用乙朋定容至10t ml 4.9标准品;甲硝陛(n metronidazole,CAs13182-89-3,洛硝哒哗(ronidazole,CAS;7681-76-7)、二甲 硝幽(dimetridazole,CAs,551-92-8、胫基甲硝(metron nidazole-OH,CAs;7681-76-7)、1-甲基-2-胫甲 基-5-硝基咪陛(hydroxydimetridazole e,CAs.936-05-0),爪代洛硝哒陛(RNZ-D3)、爪代胫基甲硝哒陛 MZNOH-D2)和冗代1-甲基-2-胫甲基-5-硝基咪陛(HMMN-D3):纯度均大于等于98%
GB/T22982一2008 .10标准储备液:分别精确称取适量标准品,用甲醇配制成1004g/mL的标准储备液 又 4.11混合标准中间工作液:取标准储备液各1ml.至100m容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成混 合标准工作液,浓度为1g/ml 4.12内标标准储备溶液;称取适量爪代内标标准品,用甲醇溶解成浓度为2004g/ml储备液 413内标混合标准中间工作液;量取适量标准储备液(4.12)用甲醇定配制成内标混合标准中间工作 液,浓度为1丝g/mL 4.14滤膜:0.45Am 4.15阳离子固相萃取柱:500mg,3mL,使用前依次用3mL甲醇、3ml乙酸乙酯活化 仪器和设备 5.1高效液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(ESI). 5.2离心机 5.3分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.4旋涡混和器 5.5旋转蒸发仪 5.6氮吹仪 5.7固相萃取装置 试样的制备与保存 6.1牛奶 取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样,密封置4C下保存,并标明标记 6.2奶粉 取均匀样品约250只装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记 测定步骤 7.1提取 牛奶样品称取5g(准确至0.01g)于50mL具塞离心管中,奶粉样品称取1g(准确至0.01g)并加 人5mL.水,往称取好的样品中加人25L100ng/mL内标混合液,混匀 在称取好样品离心管中首先加人5mL乙腊以沉淀蛋白,然后再加人20mL乙酸乙酯,振荡提取 2min后，3000r/min离心10min,移取上清液并通过5g无水硫酸钠过滤至鸡心瓶中 再用20mL 乙酸乙酯重复提取一次,合并上清液于同一鸡心瓶中 7.2净化 将提取液于45C下旋转燕发至约2ml左右,然后转移到已活化的固相萃取柱上,再用5ml乙酸 乙酯洗涤鸡心瓶两次,洗液一并转移到固相萃取柱上,以小于2mL/min流速滴下 接着依次用3mL 丙酮,3ml甲醇,2mL氨水-乙睛(5十95)淋洗,最后用5ml氨水-乙腊(5十95)洗脱并收集此过程流 速小于2mL/" 洗脱液在45C水浴上用氮气小心吹至近干,用水定容至1mL,涡漩混合后,过 /min 0.45Am滤膜供HPLC-MS-MS分析 空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品5g,奶粉阴性样品1g(精确到0.01g),按7.1和7.2操作 7.4测定条件 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 ,150mmm×2.1mmm 色谱柱:Cs,5Am. 内径)或相当者; a
GB/T22982一2008 色谱柱温度:30C; D 进样量:15AL c d)流动相梯度及流速见表1 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/(AlL/min 0.1%乙酸水溶液/% 乙睛/% 0.00 200 80 20 35 6.00 200 65 35 8.00 200 65 8.10 200 80 20 10.0 200 20 80 7.4.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 离子化模式;电喷雾正离子模式(EsI+) a b) 质谱扫描方式多反应监测(MRM 鞘气压力.104kPa; c d)辅助气压力:l38kPa; 正离子模式电喷雾电压(Is):4000v e 毛细管温度320C; 源内诱导解离电压;l0V; g h Q1为0.4，Q3为0.7; 碰撞气:高纯氯气; 碰撞气压力:0.2Pa; k)参考保留时间监测离子对和裂解能量见表2 表2被测物的参考保留时间、监测离子对和裂解能量 化合物名称 保留时间/min 检测离子对(m/: 裂解能量/eV 13 188.04/122.96 胫基甲硝陛 3.74 18 188.04/125,94 12 158.06/140.01 4.82 1-甲基-2-胫甲基-5-硝基咪哗 158.06/112.05 19 172.09/128.00 15 4.79 甲硝陛 25 172.09/82.03 12 201.05/139.98” 洛硝哒幽 5.76 17 201.051/110.0 16 12.0796 03" 二甲硝陛 6.43 29 142.07/81.03 12 尔代胫基甲硝哒陛 3,74 190,05/124.97 13 尔代1-甲基-2-胫甲基-5-硝基咪陛 4.82 161.06/143.00 爪代洛硝哒陛 4.79 1 204.04/143.00 为定量离子对,对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谐参数优化到最佳
GB/T22982一2008 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品谐图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过 表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 K>50 20. 71 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r),被测物的添加浓度范
GB/T22982一2008 围及重复性方程见表4和表5 表4牛奶样品五种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r" 再现性限R 胫基甲硝陛 110 r=0.2259m-0.1764 R=0.1812m十0.0496 1-甲基-2-胫甲基-5-硝基咪陛 2.525 lgr=0.929lgm-0.836 lgR=1.009lg从-0.692 甲硝陛 0.5~5 gr=0,952lgm一0,902 lgR=0.898lgm-0,680 洛硝哒哗 0.55 Igr=0.873lgm-0.670 lgR=0.854lgm-0.665 =0,200m一0.0548 R=0.193m十0.0356 二甲硝陛 0.55 注，m为两次测定结果的算术平均值 表5奶粉样品五种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R =1.25971 一1.1738lgR=1.05401 一0,6542 羚基甲硝陛 550 lgr一 lgm lgm 1-甲基-2-羚经甲基-5-硝基咪陛 =0.133m十1.190 R=0.137m十3.694 12.5~125 甲硝陛 2.525 gr=1.033lgm一0.811 lgR=0.985lgm-0,622 洛硝哒哗 2.525 gr=0.928lgm-0.687 lgR=0.924lgm-0,553 二甲硝陛 2.5~25 lgr=l.133lgm-0.916 lgR=0.980lgm-0.562 注，"为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R),被测物的添加浓度范 围及再现性方程见表4和表5.
GB/T22982?2008 ?A ?? ????(MRN)?? ????(MRM)??,?A.1 RT:0.01-10.00 RT:1.00-10.00 RT:4.79 RT:3.74 100% 100% ? Ψ 172.09/128.00 50%6 188.04/122.96 50% RT:4.79 100% RT:3.74 100% 172.09/82.03 50%6 50% 188.04/125,94 RT:5.77 100% ? RT:3.73 100% 20L.05/139,98 50% RT:2.47 50% 190.05/124.97 RT:5.76 100% ? RT:4.82 50% 201.05/110.01 100% 1-?-2-? RT:5.3 50% 100% -5-? 158.06/140.01 204.04143.00 RT:1.86 50% RT:4.82 100% RT:6.43 -?-2-??-5 100% 50% ? ? 142.07/96.03 158.06/112.05 50% RT:4.78 100% RT:6.43 100% ?I-?-2-? -5- 50% 142.07/81.03 161.06/143.00 50% RT:5.96 RT95 10 10 1/min /min ?A.1????(\MIRM)??
GB/T22982一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 五种分析物的添加浓度及其回收率范围数据.见表B.1 表B.1五种分析物的添加浓度及其回收率范围数据 牛奶 奶粉 化合物名称 添加浓度/(g/kg 回收率范围/% 添加浓度/4g/kg 回收率范围/% 89.0108 83.2105 98.0110 87，411 10 经基甲硝陛 91.0~106 89.g109 2o 83.8~105 50 80.1101 10 0.5 82.0102 2.5 82.8~100 90.0l10 91.8~1ll6 甲硝陛 85.5l15 10 88.7105 94.8106 25 81.5109 12.5 94.8~l08 94.3~l09 2.5 98.211o 5o 82.4105 1-甲基-2-羚甲基- 10 5-硝基咪哗 92.1112 100 87.0116 25 89.6106 125 94.3~111 82.0102 82.0~105 0,5 2.5 86.0110 89,6~l09 洛硝哒哗 91.0108 10 81.897.4 88.2l03 25 82.6一97.3 82.098.0 2.5 82.4104 0.5 80.0~97.o 84.4103 二甲硝哗 86.0101 10 80.3103 94.8~l06 25 81.6~107