脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法

脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法

国家标准 GB/T35939一2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法 Indirectenzymelinkedimmun0sorbentassayfordeteetingthe antibodyagainsteneephalomyoearditisvirs 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35939一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:南京农业大学、动物卫生与流行病学中心 本标准起草人:白娟、王岩、姜平、蒋康富
GB/35939一2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法 范围 本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法 本标准适用于猪脑心肌炎病毒抗体的检测、猪脑心肌炎血清流行病学调查和实验室诊断 注:脑心肌炎疫病简介参见附录A 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集,保存与运输技术规范 s/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 缩略语 下列缩略语适用于本文件 BSA;牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin) ELISA;酶联免疫吸附试验(En2zyme-linkedimmunosorbentassay) EMCV;脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus) HRP-SPA:辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(Horseradishperoxidaselabeledstaphylococcal proteinA TMB;四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine) VP1;病毒结构蛋白1(Viralprotein1) 仪器、材料与试剂 41试验仪器 4.1.1酶联免疫检测仪 4.1.2高速台式冷冻离心机 4.1.3微量移液器 规格0.5Al10AL.20L200AlL100Al1000AL 4.1.412道可调微量移液器: 规格10AL100"L 4.2试验材料 4.2.196孔酶标反应板 4.2.2注射器(5mL
GB/T35939一2018 4.2.3微量离心管(1.5mL) 4.2.4吸头(可与移液器配套) 4.3主要试剂 4.3.1重组EMCVVPI抗原制备方法见附录B中的B.1) 4.3.2EMCV阳性血清和EMCV阴性血清制备方法见附录B.2). 4.3.3HRPSPA 4.3.4TMB(见附录C). 4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒 5 EMC间接ELISA抗体检测方法 5.1样品采集,运输与保存处理 5.1.1样品要求 按NY/T541采集猪血液,按SN/T2984处理待检猪 另外,按GB19489进行检测 5.1.2样品采集与运送 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL,若无血清分离条件,待血液凝固后24h内在冷藏条件 下送到实验室 5.1.3血清分离,保存与运送 取5.1.2凝固血液,2000r/min离心5min,收集上清,放人无菌微量离心管中,用于抗体检测,或 置一20C保存,并在冻结状态下送往实验室 要求血清清亮,无溶血 5.2ELISA操作步骤 5.2.1EMCVVP1蛋白包被板的制备 a 抗原包被;用pH9.6抗原包被液(见C.1)将纯化的重组EMcVVP蛋白稀释成2.0"/mL 加人96孔酶标反应板,每孔100"L,置37C2h b 洗涤;弃去孔中液体,加洗涤液洗涤(PBST,见C.5),每孔300AL,洗涤3次,每次3min,洗涤 后甩去孔中液体,最后一次甩掉后,在吸水材料上用力扣磕反应板,但应避免孔壁变干; 封闭;加人含5%脱脂乳粉的PBST,200AL/孔,置37C下封闭2h:; c 洗涤:同5.2.1b); d 加保护剂溶液;加人抗原保护剂(见C.3),100"L/孔,置37C下作用1h; ee n 密封:置37C干燥,用锡箔纸真空包装,密封 5.2.2加被检血清及对照血清:每份被检血清各取4AL,分别加到有196L稀释液的微量离心管中 作1;50倍稀释 混匀后分别取100"L依次加人间接ELISA板反应孔中,每份血清加两个孔 每块 反应板设阴性血清和阳性血清(1;50倍稀释)对照各两孔,每孔100L 盖好包被板置37C湿盒内孵 育1h 待检血清样品数量较多时(>10份),应先使用血清稀释板稀释所有待检血清,再将稀释好的血清 转移到抗原包被板,尽可能使反应时间一致 5.2.3洗涤同5.2.1b). 5.2.4加酶标记抗体和孵育;加人PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体(HRPSPA
GB/35939一2018 13000稀释),100L/孔37C孵育0.5h 5.2.5洗涤同5.2.1b). 5.2.6加底物缓冲液和孵育:每孔加新配制的底物溶液(见C.6)100AL,37避光孵育5min15minm 参见附录D) 5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色,阴性对照血清孔无色或基本无色,加人2mol/I H,sO溶液(见C.7),50L/孔,终止反应 5.2.8酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值,15min内完成 5.3结果判定 5.3.1结果计算 P/N计算,P/N一被检血清的两孔平均OD值/阴性对照血清的两孔平均OD,值 5.3.2判定 阳性对照血清平均OD,值>0.5,阴性血清两孔平均OD值<0.2,判定试验条件成立 当P/N>2.1,判为阳性,P/N<2.1则判为阴性 或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒,其操作和判定按其说明书进行
GB/T35939一2018 附 录 A 资料性附录) 疫病简介 脑心肌炎是由脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)引起的多种脊椎动物共患的传 染病,以脑炎、心肌炎以及心肌周围炎为主要特征 猪和鼠是受感染最普遍的动物 临床上可引起仔猪 急性致死性心肌炎和脑炎及母猪繁殖障碍等疾病 人可呈现轻度脑炎临诊症状 1960年巴拿马首次 从急性死亡猪脾脏和肺脏分离到病毒,此后,澳大利亚,南非,新西兰、古巴、加拿大、意大利、希腊、瑞士、 比利时和塞浦路斯多次暴发流行,引起严重经济损失 我国于2007年在发病猪群中也发现脑心肌炎病 例,并分离到病毒,但常表现为亚临床感染 本病实验室诊断方法有小鼠感染试验、病毒分离鉴定、RT PCR方法、酶联免疫吸附试验(ELISA),血清中和试验和间接免疫荧光试验等
GB/35939一2018 B 录 附 规范性附录 抗原抗体的制备 B.1重组EMCvVP1抗原制备 B.1.1菌种 表达EMCVVP抗原蛋白的菌种为BL21-VPl,由EMCVVP1基因原核表达质粒pET-VP1转化 大肠杆菌BL21(DE3)获得 B.1.2菌液培养 取BL.21-VP1种子液按培养基体积1%量接种于含氨节青霉素的LB液体培养基中,200r/min 37C摇床振荡培养1.5h2h,菌液浓度OD值达到1时,加人终浓度为0.7mmol/L的PTG 7振荡培养8h B.1.3重组蛋白的表达及纯化 B.1.3.1菌液收集 将B.1.2收集的细菌样品4C7500r/min离心15min收集菌体,按照商品化的重组蛋白纯化系 统试剂盒说明书,在变性条件下纯化重组融合蛋白EMCVVP1 B.1.3.2重组菌裂解液的制备 具体制备过程如下: a)将呱盐细胞裂解缓冲液的pH调至7.8,并于37C预热 b) 00mlLB液体培养基表达的重组菌液,7000r/min离心10min,收集菌体沉淀; 用8mL腻盐细胞裂解缓冲液,pH7.8条件下重悬上述菌体,室温下震摇5min10min,使菌 c 体充分裂解; d 在功率200w的条件下超声波裂解细菌,超声裂解5s,停顿5s,直至菌液变得清澈,在冰盒上 操作; 将上述裂解物4C80o0!/min离心10min,沉淀菌体醉片将上清转移至新的离心管中 B.1.3.3亲和层析柱的准备 具体准备过程如下 检查柱子下端的帽子完好无破损; a b 从4C冰箱取出树脂小瓶,颠倒重悬树脂使均匀; c 吸取树脂2ml注人柱中,使树脂自然下沉,缓缓吸出上清 加人6mL无菌去离子水,上下颠倒使树脂重悬、再自然下沉后缓缓吸出上清 d 加人6ml结合缓冲液，上下颠倒使树脂重悬;使树脂自然下沉，缓缓吸出上清 e 重复d)e)2次 fD B.1.3.4变性条件下的纯化方法 具体纯化方法如下
GB/T35939一2018 30 将8ml菌体裂解液加人准备好的柱子中,室温下轻轻震摇15min~ min,使树脂在裂解液 a 中充分悬浮,让蛋白与磁珠上的抗体充分结合; 室温下使树脂自然下沉，缓缓吸出上清 b 加人4mlL结合缓冲液(pH7.8)重悬树脂,充分震摇2min,使树脂自然下沉，缓缓吸出上清 重复本步骤2次; d 加人4mL洗涤缓冲液(pH6.0)重悬树脂,充分震摇2min,使树脂自然下沉,缓缓吸出上清 重复本步骤1次2次; 加人4mlL洗脱缓冲液(pH5.3)重悬树脂,充分震摇2min,使树脂自然下沉，缓缓吸出上清 重复本步骤1次2次; fD 加人5ml洗脱缓冲液(pH4.0),除掉柱子下端的帽子,使液体自然流出,每500"I1管,分 0管收集洗脱的蛋白 紫外分光光度计测蛋白浓度 B.1.4重组蛋白质量和性能检验 蛋白纯度鉴定取上述收集的样品20L,加人5L.5×蛋白样品上样缓冲液充分混匀后 B.1.4.1 上样前瞬时离心,吸取上清,用12%的丙希酰胺sDs 00煮沸5min立即置冰上1nmin2min PAGE分析,电泳结果52kDa处应出现单一条清晰条带,且无其他杂带,用凝胶成像系统扫描分析其纯 度,纯度不低于90% 蛋白抗原性鉴定上述收集的样品30L.按 B.1.4.2 B.1.4.1 1方法进行sDsPAGE电冰 然后5 恒压下,转印45min,使目的条带转印至NC膜上 用PBST配制的5%的脱脂乳封闭2h,PBST洗涤 后,加适量稀释的EMcvVP1单克隆抗体,作用1h,PBST洗涤,再加1;20000稀释的羊抗鼠lgG HRP作用1h,洗涤后加显色液于暗室曝光,应在52kDa处出现单一条清晰条带,且无其他杂带 B.1.4.3蛋白浓度的测定;用紫外分光光度计分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的光吸收 值(OD),按公式1.45×ODm一0.74×OD. 计算抗原浓度,浓度不低于0.5mg/mL 260nm B.1.44蛋白免疫学活性鉴定:采用ELISA方法对抗原的免疫学活性进行鉴定 用抗原包被液将纯化 的蛋白从1.04g/mL稀释至0.24g/mL,包被抗原包被板,进行ELISA检测 选择阳性血清的s/P值 高于阳性判定标准时的抗原最高稀释倍数作为抗原包被浓度 抗原浓度应不低于0.204g/mL B.1.5分装及保存 将合格的蛋白分装到1.5m微量离心管中,分装量为1nmL/管,置一70C下保存,有效期为12个 月 避免反复冻融和污染 B.2EMCV对照血清制备 B.2.1EMCV阳性对照血清 B.2.1.1血清来源动物;4周龄5周龄健康EMCV抗原和抗体双阴性猪(ELISA检测血清中EMCV 抗体阴性,PCR检测EMCV阴性),隔离观察7d B.2.1.2免疫接种;取EMCVNJ08株(TCID>10"/mL)病毒液,颈部肌肉注射2mL/头,间隔28d 用相同剂量EMCVNJ08株再次接种,二次接种后20d一40d采血分离血清,用病毒血清中和试验检测 EMCV抗体,中和抗体效价>1:32时,即可用于采血并分离血清 B.2.1.3血清制备;采取颈部动脉采血方式,无菌采集血液,离心分离血清,用样品稀释液适量稀释,用 0.45声m滤膜过滤除菌,置一70以下保存,避免反复冻融和污染,有效期24个月
GB/35939一2018 B.2.2EMCV阴性对照血清 B.2.2.1血清来源动物:同B.2.1.1 B.2.2.2血清制备;选用上述合格仔猪,采取颈部动脉采血方式,无菌采集血液,离心分离血清,用样品 稀释液适量稀释,用0.454m滤膜过滤除菌，置一70以下保存,避免反复冻融和污染,有效期 24个月
GB/T35939一2018 附 录 规范性附录) 溶液的配制 C.1抗原包被液pH9.6,0.05moL/L) 称取Na,cO1.59g、NaHCO2.93g,加去离子水800mL,用1mol/1的NaOH或1mol/L的 HCl调至pH9.6,加去离子水定容至1000mL C.2封闭液 称取脱脂乳粉5只,溶解于100mPBST洗涤液中,0.22m滤膜过滤,分装后4C保存 c3保护剂溶液 称取BSA0.5g,蔗糖2g,加去离子水溶解并定容至100ml,0.22m滤膜过滤,分装后2C8C 备用 C.4 样品稀释液 取NaCl8g,KHPO2H.o0.2g、NaHPO12H.02.9g、KCl0.2g和Tween-200.5mL,溶 于灭菌去离子水中,定溶至1000mL,0.22Am滤膜过滤,分装,20nmL/瓶 2C8C下保存 C.,510xPBsT浓缩洗涤液(0.1molpH7.4) 取NaCl80g,KH,PO2H,02g、NaHPO12H.,O29g,KCl2g,Tween-205mL,加人灭菌 去离子水充分溶解,定容至1000mL.0.22Mm滤膜过滤,分装,80mL/瓶 2C8C下保存 洗涤液配制将10倍浓缩洗涤液恢复至室温,并摇动使沉淀溶解(或于37C水浴锅中加热5nmin 10min),然后用去离子水作10倍稀释,混匀,稀释好的洗涤液在2C8C可以存放7d C.6底物溶液 A液配制取Na,HPO14.6g、柠檬酸9.33g、30%H,O2mL,加去离子水至1000mlL,调至 pH5.0一5.4; B液配制:取3,3,5,5-四甲基联苯二胺20mg,无水乙醇10ml,加去离子水至1000mL 使用前将A液和B液等量混合,分装于棕黑色瓶内,20mL/瓶,2C一8C下避光保存 C.7 终止液(2mol/LH,Sso) 取去离子水177.8mL,缓慢加人H.sO.(96%)22.2mL 分装,10mL/瓶,2C8C下保存
GB/35939一2018 录 附 D 资料性附录 底物溶液作用时间的说明 底物溶液的作用时间与环境温度有关,如温度较高,酶催化作用就快,颜色反应则快 如温度低,酶 催化作用就慢,颜色反应则慢 因此,底物的作用时间以阳性和阴性对照血清颜色变化为准 当阳性对 照血清孔呈鲜明的蓝色,而阴性对照血清孔无色或基本无色时终止反应 本标准中规定的底物作用时 间5min~15min,是在不同温度条件下的大致范围

脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法GB/T35939-2018

什么是脑心肌炎病毒？

脑心肌炎病毒是一种RNA病毒，属于小型病毒家族。它主要通过蚊子叮咬传播，也可以通过食物、饮水或与感染者密切接触而传播。该病毒可引起严重的神经系统和心肌疾病，包括颅内高压、脑膜炎、脑炎以及心肌炎等。

什么是ELISA抗体检测？

ELISA抗体检测是一种常用的生物技术检测方法，可以检测体液中的抗体水平。该方法利用特定抗原与相应抗体结合的原理，通过对样本中的抗体进行检测，来判断患者是否感染了某种病原体。

什么是GB/T35939-2018？

GB/T35939-2018是中国国家标准，是一种脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法。该标准规定了实验室在进行脑心肌炎病毒抗体检测时所需的试剂、设备和操作步骤等。

脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法GB/T35939-2018的步骤：

1. 取血样本：采用无菌技术取静脉血。
2. 制备血清：离心分离血清并保存。
3. 准备试剂：准备好包括ELISA板、稀释缓冲液、酶标记抗体等试剂。
4. 加样：将待测血清和阳性对照血清、阴性对照血清等加入ELISA板中。
5. 孵育：将ELISA板放入恒温箱中孵育。
6. 洗板：用洗板缓冲液清洗ELISA板，去除未结合的物质。
7. 加酶标记抗体：加入与待测血清抗体相匹配的酶标记抗体。
8. 二次孵育：再次将ELISA板放入恒温箱中进行孵育。
9. 显色：加入显色底物，使阳性样本发生颜色反应。
10. 终止反应：加入终止液停止反应，然后用酶标仪读取吸光度。

结论：

GB/T35939-2018是一种常见的脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法，可以有效地诊断感染了脑心肌炎病毒的患者。该方法操作简便、结果准确，因此被广泛应用于实验室对脑心肌炎病毒感染的检测中。同时，GB/T35939-2018标准的制定也使得该方法在国内得到了统一的规范和标准化。 需要注意的是，在进行脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测时，需要严格按照标准操作，确保结果的准确性。同时，还需要结合临床症状和其他检测手段来进行综合分析，以确定是否存在脑心肌炎病毒感染。 总之，脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法GB/T35939-2018是一种重要的生物技术检测方法，可以为临床医学提供有力的支持和帮助。

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