猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T22917一2008 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测方法 ProtoeoloffluorogenicRT-PCRforswinevesiculardiseasevirus 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22917一2008 前 言 本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)》 第5版) 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位:深圳出人境检验检疫局、云南出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;花群义、卢体康、吕建强、阮周曦、杨云庆、周晓黎、杨素、董俊、陈书堪
GB/T22917一2008 猪水泡病病毒荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了猪水泡病病毒荻光RT-PCR检测的操作方法 本标准适用于动物及其产品中猪水泡病病毒的检测 缩略语 下列缩略语适用于本标准 2.1荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应 2.2C值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数 2.3RNA 核糖核酸 2.4DEPc 焦碳酸磷酯 2.5PBS 磷酸盐缓冲盐水,配方见附录A . 2.6Iaq酶 TaqDNA聚合酶 2.7SVDV 猪水泡病病毒 原理 根据猪水泡病病毒的基因特定序列,合成-一对特异性引物和一条特异性的荚光双标记探针 引物 和探针通过严格的设计和筛选,涌盖已报道的所有猪水泡病病毒的毒株 茨光探针的5'端标记FAM 荧光素,3'端标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号 扩增时， 由于Taq酶的5'-3'的外切活性,在延伸到荧光探针时,将其切断,两基团分离,淬灭作用消失,荧光信 号产生 因此,可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测 材料与试剂 仪器与器材 4.1.1荧光RT-PCR检测仪 4.1. 2 高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上) 4.1.3台式离心机或手掌式离心机(离心速度3000r/min) 混匀器 4.1.5冰箱(2C~8C和一20C两种). 4.1.6微量可调移液器(5AL,10AL,100AL,l000L.)及配套带滤芯吸头 5mL硅化Eppendor管将Eppendorf管和滴头浸泡于含有0.1%DEPC的三蒸水 4.1.71.5ml. 0. 中过夜,121C士2C高压灭菌15min,40C烘干备用 市售Eppendorl管和滴头已经硅化,可直接
GB/T22917一2008 使用 4.1.80.2ml透明薄壁PCR管 4.1.96×6孔或5×8孔冰盒 4.1.10水浴锅;0C100C 4.1.11旋涡振荡器 4.2试剂 4.2.1本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭 菌)分装 4.2.2三氧甲婉 4.2.3异丙醉;一20C预冷 4.2.4Ps,;配制方法见附录A 4.2.575%乙醉用新开启的无水乙醉和DEPC水配制,一20C预冷 4.2.裂解液;配制方法见附录A. 4.2.7酚(分析纯 4.2.8无水乙醉(分析纯》 4.2.9AMV反转录酶(5U/L.)一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 4.2. 10dNTPs;含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/L 4.2.1RNA膊抑制剂(RNasin,0U/Al)一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 4.2.12TaqDNA /L):一20C保存,不要反复冻融或温度剧烈变化 聚合两(GU" 4.2.13反转录和PCR缓冲液(5×);配制方法见附录A 4.2.14氯化镁(25mmol/1L) 4.2.15引物(15Amol/L)上游引物5'GGcAAcGcATACAGCATGTT3';下游引物5'GccG TATGTccCTTGcTTGT-3' 4.2.16荧光双标记探针(10mol/L):(FAM)5'-TATGACGGG GGCCAGGTT-3'(TAMRA G 4. .2.17DEPC处理水;按0.1%加人DEPC,摇匀,室温静置过夜,121C士2C高压灭菌20min,冷却 备用 抽样 5.1采样工具 5 1.1下列采样工具应经121C士2C,15min高压灭菌并烘干 1.2棉拭子 5 5 .1.3剪刀、锻子 5.1.4注射器 55 .1.51.5m Eppendorf管 5 .1.6研钵 .1.7真空采血管 5. 5. .1.8记号笔 55 .1.9低温保藏箱或冰盒 5 样品采集 5 .2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织,水泡液、血液、口腔分泌物和组织 采集后立 即冷藏送检或置于含抗生素的PBS缓冲液中4C环境下保藏 编号并作好记录 5.2.2水泡液及水泡皮:只有当水泡完整时才能采集到水泡液,用75%酒精轻轻消毒水泡表皮,尽量 去掉污物,用灭菌生理盐水擦去酒精,然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液,置于含抗生素的PBS缓
GB/T22917一2008 冲液灭菌瓶中 水泡液采取后,将水泡皮以无菌术剪下,放人含抗生素的PBS缓冲液中 5.2.3口腔分泌物和咽喉拭子;用拭子采取口腔分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次5次取分泌 液,拭子一并放人盛有1.0ml含抗生素的PEBS缓冲液的1.5ml.Eppendor管中 也可用食道探杯刮 取咽喉液体,放人加有抗生素的PBS中 编号,冷藏送检或低温保藏 5.2.4血液;用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendor管中,密封、编号后保存于4C环 境中送检 5.2.5肌肉或组织脏器;无菌采集待检样品,装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,冷藏送检或低 温保藏 5.3样品贮运 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放人一个塑料袋内),于保温箱中加冰,密 封,送实验室 5.4样品制备 5.4.1水泡液、血液和口腔分泌物 样品在混匀器上充分混合后,用高压灭菌镀子将拭子中的液体挤出,室温放置30min,取上清液转 人无菌的1.5mLEpendorl管中,编号备用 水泡皮,肌肉或组织脏器 5.4.2 取待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mLPS混匀4c下以300r/minm 离心15min,取上清液转人无菌的1.5ml.Eppendor管中,编号备用 5.5样本存放 制备的样本在2C8C条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置一70C以下,但应避免反复 冻融(冻融不超过三次). 操作方法 6.1实验室要求 猪水泡病病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域;样本制备区、反应混合 物配制区和检测区;各工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用;每一区域应有专 用的仪器设备;进人各个工作区域应严格遵循单一方向顺序,即只能从样本制备区、扩增反应混合物配 制区至检测区 6.2样本的处理 6 5.2.1在样本制备区进行 样品中总RNA提取的试剂盒,有商品化试剂盒出售,也可自行配制 .2.2取n个灭菌的1.5mLEppendorf管,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和， 6 编号 6.2.3每管加人600L裂解液,分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各200AL,一份样本换用一 个吸头,再加人200l三氯甲烧,在混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可以用 手颠倒混匀) 于4C以12000r/nin离心15min. 6.2.4取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管,加人500L异丙醇(一20C预冷),做标记 吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500L,不能吸出中间层,颠倒 混匀 6.2.5于4C、以12000r/min离心15min(Eppendorl管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒 去上清液,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加人600L.75%乙醇,颠 倒洗涤 6.2.6于4C、以12000r/min离心10minEppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒 去上清液,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干
GB/T22917一2008 6.2.7以4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液 体甩到管底部,小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀 -面,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶 6.2.8各管加人1lL.DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,以2000r/min离心5s,冰上保存备 用 提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存应放置于一70C冰箱内 6.3检测 6.3.1荧光RT-PCR反应液的配制 在反应混合物配制区进行 设所需荧光RTPCR检测总数为n(n=u十2十1),其中u为被检样品 数、2为阳性对照数、1为阴性对照数,按表1配制反应体系混合液 配制在冰盒中进行 表1反应体系混合液配制 序号 每管用量/aL n管总用量/ 组 分 AMV反转录酶(5U/L) dNTPs(每种均为10mmol/L n×5 RNasin(40U/lL n×1 TaqDNA聚合酶(5U/AL) 0.5 n×0.5 10 反转录和PCR缓冲液(5× n×10 氯化钱(25mnmol/L n×6 上游引物(15pnmol/L) 下游引物3mL) n×l 探针(10amol/L n×1 10 DEPC水 13,5 n×13,5 6.3.2荧光Rr-PCR反应液分装 将6.3.1中配制的荧光RT-PCR反应液充分混合均匀,按每管40nl分装于0.2ml透明PCR 管,将PCR管放于96孔板上,一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管 转移至样本 处理区 6.3.3加样 在样本处理区进行 在各设定的PCR管中分别加人6.2.8中制备的RNA溶液10AL,盖紧管盖 以500r/min离心30s 转移至检测区 6.3.4荧光RT-PCR检测 6 3. .4.1在检测区进行 将7.3.3中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内,在96孔板内表 内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(PC)、阴性对照(NTC) 设置探针:5'为FAM,3'为 TAMAR 6.3.4.2循环条件设置: -第一阶段,反转录42C/30 min -第二阶段,预变性94C/3min; -第三阶段,94C/20s,60C/30s,40个循环 试验检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和C值判定结果 结果判定 结果分析和条件设定 直接读取检测结果 基线和阀值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以闵值线刚好超过正常阴
GB/T22917一2008 性样品扩增曲线的最高点为准 7.2质控标准 7.2.1阴性对照无C'值,并且无扩增曲线，一直为水平线 7.2.2阳性对照的C'值应小于30,0,并出现典型的扩增曲线,2个阳性对照扩增曲线基本重合 否 则,此次实验视为无效 7.3结果描述及判定 7.3.1阴性 无C值并且无扩增曲线,表示样品中无猪水泡病病毒 7.3.2阳性 C值小于等于30.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在猪水泡病病毒 7.3.3有效原则 C'值在30.038.0的样本建议重做 重做结果无C值或者大于30.0为阴性,否则为阳性
GB/T22917一2008 附 录A 规范性附录 试剂的配制 A.1磷酸盐缓冲盐水(Ps)的配制 A.1.1A液 0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液;磷酸二氢钠(NaH,POH,O)27.6g,溶于蒸水中,最后稀释至 l000mL A.1.2B液 0.2nmol/L 磷酸氢二钠水溶液;磷酸氢二钠(Na,HPO7H,O)53.6g(或NaHPO12H,O 1.G民.或Na.lHuro.”2H.035.G日,加燕溜水游解-最后稀释至100ml A.1.30.01mol/Lpl7.2磷酸盐缓冲盐水(Ps)的配制 取A液14mL，B液36mL,加氯化钠(NaC)8.5g,用蒸水稀释至1000mL 经121C士2C 15min高压灭菌,冷却后,无菌条件下按每毫升加人1000IU青霉素、1000ug链霉素 A.2裂解液 裂解液的主要成分为异硫汛酸呱和盼,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4C保存;可直接购 买商品化的Trizol试剂 A.3反转录和CR缓冲液(5×)配制 A.3.1Tris-HCl;250mmol/LpH8.3 A.3.2氯化钾;250mmol/L A.3.3氯化镁;50mmol/L A.3.4DTT;50mmol/儿L A.3.5TritonX-100:1%