柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法

柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T40453一2021 柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法 DeteectionandidentifnieationofPhylostieteiriearpa(MeAlpine) Aa 2021-08-20发布 2022-03-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/40453一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本文件起草单位;福州海关、广州海关,浙江大学、林业科学研 究院华北林业实验中心、福建省农业科学院农业生物资源研究所、湖南省植物保护研究所 本文件主要起草人:李敏、王卫芳、李红叶、王兴红、李新芳、周先治、虞、张卓、沈建国、陈细红
GB/40453一2021 柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法 范围 本文件规定了柑橘黑斑病菌的检疫鉴定方法 本文件适用于柑橘属及其杂交种苗木和果实中柑橘黑斑病菌的分离检测和鉴定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 SN/T2455进出境水果检验检疫规程 SN/T4648柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 分类信息 学名;Phylostictacitricara(MeAIpine)Aa，1973 异名:GuignardiaciricarpaKiely，1948 PhomnacitricaraMcAlpine，1899 Phylostictinacitricara(McAlpine)Petrik，1953 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),座囊菌纲(Do thideomycetes),葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales),叶点霉科(Phyllostictaceae),叶点霉属(Phyostie ta 柑橘黑斑病菌的寄主范围、地理分布传播方式、为害症状和形态学特征参见附录A 方法原理 S 根据柑橘黑斑病菌在寄主植物上的症状,对可疑样品进行病原菌分离培养,按照病原菌的形态学特 征和实时荧光PCR特异性反应进行鉴定 仪器和用具 6.1仪器 体视显微镜、生物显微镜、电子天平(感量0.lg,培养箱、离心机、超净工作台,高压灭菌锅,水浴 锅、旋涡振荡器、制冰机、冰箱、实时荧光PCR仪
GB/T40453一2021 6.2用具 样品袋、标签、放大镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、烧杯、三角瓶、量筒、培养皿、毁子、剪刀、解剖刀、接 种针,研钵,液氮罐、离心管、移液器(0.1L一2.5AL,1Al10AL,10l10L,20AL200L， 100Al~1000AL)、移液器枪头 试剂和培养基 7.1试剂 1%次氯酸钠溶液、70%乙醇、无水乙醇、液氮,c'TAB缓冲液、蛋白酶K、三氯甲炕、异戊醇、异丙醇、 Tris-HCI,EDTA,DNA提取试剂盒 7.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、燕麦琼脂培养基(OA)和麦芽提取物琼脂培养基(MEA),具体配 制方法参见附录B 检疫鉴定方法 8 8.1现场检疫 柑橘属及其杂交种生产与加工包装基地检疫按照sN/T4648进行,抽样与取样按照sN/T2455 进行 8.2症状检查 病菌为害症状常见为硬斑型、黑星型、假黑点型、毒斑型病斑等 观察果实,枝条、叶片上是否有疑 似病斑,注意病斑上是否有黑色小颗粒状分生袍子器,落叶上是否有黑褐色假囊壳 病菌为害症状参见 附录A 8.3镜检 8.3.1分生袍子器镜检 如有黑色小颗粒状分生袍子器的病斑,置于体视显微镜下观察记录病斑和分生袍子器的形态、颜色 及大小,对病斑组织进行徒手切片或冷冻切片,置于生物显微镜下观察记录分生抱子的形态特征,同时 将分生袍子转接到PDA平板上进行分离培养 8.3.2假囊壳镜检 如有黑褐色假囊壳的落叶,置于体视显微镜下观察记录假囊壳的形态特征,用接种针挑取假囊壳制 成玻片,置于生物显微镜下观察记录假囊壳、子囊、子囊抱子的形态特征 8.4病菌分离 未发现分生袍子器的病斑进行组织分离,在病健交界处剪成大小1mm×1mm组织块,70%乙醇 表面消毒30s或1%次氧酸钠溶液表面消毒10min,无菌水洗涤3次,组织块转移至PDA平板上,置于 22C黑暗条件下培养5d7d,发现疑似菌落,转移边缘菌丝至PDA平板上纯化
GB/40453一2021 8.5实时荧光CR检测 刮取疑似分离物菌丝或切取病果、叶片、枝条上的症状组织块,用商品化试剂盒或改良的CTAB方 法(见附录C)提取DNA,并进行实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测方法按附录C执行 8.6形态学特征观察 将实时荧光PCR检测结果为阳性的分离物分别转接至PDA,OA、,MEA平板上,置于25C黑暗条 件下培养14d 培养3d后开始观察记录PDA平板上菌落形态,7d后体视显微镜下观察分生弛子器 产生情况,10d后生物显微镜下观察测量分生袍子的形态和大小,胶质鞘厚度、尾端附属丝长度;观察 记录OA平板上是否产生黄色色素以及MEA平板上菌落形态、颜色 鉴定 9.1形态学特征 9.1.1培养性状 PDA上初生菌落白色、平铺状,菌丝致密 后期菌落中央开始变为灰橄榄色黑灰色至黑色,逐渐 隆起、变硬,菌落边缘菌丝体颜色也逐渐加深至浅橄榄绿色,边缘呈裂瓣状,且有白色菌丝体构成的半透 明区域 7d后菌落上形成黑色隆起的硬块状子座,炭质、坚硬、表面凹凸不平,子座上密集散生大量黑 色颗粒状分生袍子器 分生袍子器半埋生,10d -14d后或熟,从中滋淋乳白色附性分生宿子团,内贪 大量分生抱子 OA上常产生扩散性黄色素 MEA上菌落中央黑橄榄色,边缘灰白色(参见附录A. 9.1.2无性态形态特征 分生袍子器近球形黑色炭质直径70Hm一330m.壁厚,孔口深稍乳头状突起 分生抱子器 成熟后溢出大量分生袍子 分生袍子倒卵形至椭圆形,无色透明,大小(9.生Am12.7Am)×(5.0m~ 8.5m),外覆盖一层透明的胶质鞘,胶质鞘厚度通常小于1.5m,尾端常有一条无色胶状物形成的附 属丝,长度4m104m,胶质鞘及附属丝遇水均易溶化 培养状态及寄主落叶上,病菌有时可见小型 分生抱子,短杆状,圆柱形.直或稍弯,大小(5m8m)×(0.54mm~1Mm) g.1.3有性态形态特征 假囊壳球形至梨形,深褐色至黑色,埋生,直径125m360m,具乳状突或喙,表面常着生不规 则菌丝 子囊圆柱形或棍棒形,双囊壁,大小(404m~65m)×(12m154m),束状排列,内有8个 子囊抱子 子囊袍子无色,纺锤形或圆柱形、无隔膜、中部凸起、略呈弧形,大小(12m164m)× 4.5Mm~6.54m) 有性阶段假囊壳仅在落叶中产生,不在果实、枝条,新鲜叶片以及培养基上产生 9.2与近似种的区别 柑橘黑斑病菌与近似种的区别主要表现在分生袍子大小胶质鞘厚度、附属丝长度等形态特征以及 在培养基OA、MEA上培养性状等方面(参见附录A和附录D) 其中,OA上柑橘黑斑病菌和P aracilricarpa菌落常产生黄色色素扩散至菌落周围的培养基中,其他近似种菌落不会产生黄色素 MEA上尸.paracitricara菌落中央由黄色逐渐变成浅橄榄色,边缘黄色;柑橘黑斑病菌和其他近似种 菌落中央为橄榄绿色、黑橄榄色至黑褐色,边缘灰白色至棕褐色
GB/T40453一2021 10结果判定 病菌形态学特征与9.1.1,9.1.2描述相符合，且实时荧光PCR检测为阳性,判定检出柑橘黑斑 病菌 1 材料保存 11.1样品保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存 阳性样品应保存于4C冰箱中,以备复核,保存期满后须经 高压灭菌后方可处理 11.2菌株保存 阳性分离物应妥善保存,将菌丝块转人0%灭菌甘油中于一80笔下保存,或在rDA平板培养后于 4 C下保存,每90d定期转接 保存期满后高压灭菌处理 11.3记录资料 妥善保存检验报告包括症状,病菌形态学特征等图文资料,以备复验,谈判和仲裁 检验报告必须 注明检验日期、方法、结果等,并有检验人员和审核人员签字
GB/40453一2021 附 录 A (资料性) 柑橘黑斑病菌的相关信息 A.1寄主范围 芸香科柑橘属植物(Cit trusspp.)[柚(C )和波斯青柠(C.latifolia)除外]及其杂交种植物 na.工ia 均感病 其中柠檬(C.limon)最易感病 注查《FloraofChina(2008),积属(Ponrirws rwspp.),金橘属(Forlwnela sp.)已划人柑橘属,本文件中涉及寄主植 物柑橘属已包含原积属和原金橘属植物 A.2分布 非洲安哥拉,加纳肯尼亚、莫桑比克,纳米比亚,南非、突尼斯、乌干达、赞比亚,津巴布韦; 亚洲:不丹、福建、广东、广西、江苏、四川、香港、云南浙江、台湾、印度(马哈拉施特拉邦、印 度尼西亚爪哇、菲律宾; 北美洲;美国佛罗里达); 中美洲和加勒比地区:古巴; 南美洲:;阿根廷、巴西(亚马孙、圣埃斯皮里图米纳斯吉拉斯,巴拉那、里约热内卢,南里奥格朗德、 圣卡塔琳娜、圣保罗,乌拉洼; 大洋洲;澳大利亚(新南威尔士州,昆士兰州,维多利亚州) A.3传播方式 病菌可通过带菌果实、苗木或其他植物组织进行远距离传播 田间仅在腐败落叶上产生假囊壳,遇 水1h可释放子囊抱子,子囊抱子能弹射1cm一2cm,再经气流传播侵染寄主表皮组织,经过4一6个月 潜伏期后,果实开始转色和成熟时出现症状,产生病斑和分生抱子器 分生抱子器在成熟的果实、叶片 和枝条上产生,分生袍子以黏液形式自孔口涌出通过水流和雨水飞溅进行短距离传播 A.4为害症状 A.4.1果实症状 病菌潜育期长,果实接近成熟时才表现症状,无症状果实在运输和贮藏过程中仍会发病 常见症状 包括硬斑型、黑星型、假黑点型和毒斑型病斑,这几种类型病斑有时混合发生,条件适宜时,硬斑型、黑星 型、假黑点型均可发展为毒斑型症状 A.4.1.1硬斑型 硬斑型为最典型的症状,病斑小而浅,仅限于果皮,直径3mm一10mm,边界黑褐色微隆起,有时 病斑外围有黄色或绿色的晕圈 病斑中央凹陷,灰色至棕褐色,通常会产生凸起的黑色小颗粒(分生弛 子器) 硬斑型症状参见图A.1 A.4.1.2黑星型 tmm3 病斑小,直径1 nm,灰色至红棕色,或浅红褐色,中央稍凹陷,周围无晕圈,且很少黑色小 颗粒(分生抱子器) 黑星型斑症状常在果实近成熟时表现,并常出现在硬斑周围 黑星型症状参见图
GB/T40453一2021 A.1 A.4.1.3假黑点型 通常发生在绿色果实上,呈小型凸起的深褐色至黑色病斑,周围常有深色小斑点,无黑色小颗粒(分 生袍子器) 黑星型症状参见图A.1 A.4.1.4毒斑型 生长末期果实被严重侵染时,多个病斑联合形成凹陷不规则的红褐色至黑色大病斑 在高湿条件 下会产生大量黑色小颗粒(分生袍子器),且病斑发展很快,可深人果皮内很快蔓延至整个果实,引起全 果腐烂 毒斑型症状参见图A.1 A.4.2叶片及枝条症状 叶片症状与果实上硬斑型病斑类似,常发生在老叶上,通常圆形、直轻可达》mmm,病斑中央稍凹 陷,灰白或浅褐色,常有黑色小颗粒(分生袍子器),边缘深褐色至黑色,有黄色晕圈 枝条上的病斑症状 与叶片上类似 叶片症状参见图A.2 黑星型症状 a b 硬斑型症状 e 假黑点型症状 毒斑型症状 //www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest 注a)引自wangetal.(2012);b)d)引自htps:; anddiseaseprograms/pests-anddiseases/eitrus/citrus-black-spot/eitrus-back-spot. 图A.1为害果实症状
GB/40453?2021 ?htt htps;//www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/planmtheah/plantpestanddiseaseprograms/pestsanddi eases/eitrus/eitrus-lack-spot/eitrus-black-spot ?A.2????? 1mm PDA?(14) doA?(14d ?A.3??
GB/T40453一2021 会 10m 10 分生袍子团(标尺=1 分生袍子(标尺=10m) e 1mm g 小型分生袍子(标尺=10wm" 注:b引自SN/T46482016,图C.1 图A.3(续) P eirierp菌落特征 尸preirirp菌落特征 b 注:引自Guarnaceiaetal.2017) 图A.4MEA上P.eiriarp和P.paraeiriearpa菌落特征
GB/40453一2021 附录 B 资料性) 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) B.1 200g马铃薯去皮切成小块后加水煮沸30min,双层纱布过滤后加人20旦葡萄糖、18g琼脂，继续 煮至琼脂完全溶化后加蒸憎水补足1o00ml.,121C下灭菌15min 也可采用商品化PDA培养基按 使用说明进行配制 B.2燕麦琼脂培养基(oA) 称取30【燕麦片放人纱布中,加水慢煮2h,用纱布挤压过滤,加人20g琼脂,继续煮至琼脂完全溶 化后加燕憎水补足1000mL,在121C下灭菌15min 也可采用商品化OA培养基按使用说明进行 配制 B.3麦芽提取物琼脂培养基(MEA 称取麦芽膏或麦芽汁粉30g,琼脂15g,加蒸僧水加热溶解,完全溶化后加蒸僧水补足1000mL 在121C下灭菌15min 也可采用商品化MEA培养基按使用说明进行配制
GB/T40453一2021 附 录 C 规范性) 实时荧光CR检测方法 DNA提取 C.1 取可疑病果、病叶、病组织,用液氮研磨,取0.lg,或挑取菌丝块至1.5mL离心管中,加人300L 500l.CTAB缓冲液和0.1g蛋白酶K,混匀,65C水浴1h,13000片离心5min~10nmin,保留上清 液;加500L的氯仿;异戊醇(24:1)混匀,13000越离心5min10min,保留上清液;再加500AL的 氯仿;异戊醇(24:1)混匀,13000及离心5min~10min,保留上清液;加1mL异丙醉混匀,一70C下 放置1h,或一20C过夜;13000g离心10min,可见DNNA沉淀;加1mL.70%乙醉清洗DNA沉淀2 次,室温干燥;用30l50L.Tris-EDTA缓冲液溶解DNA,保存于一20C下备用 也可选用商用植 物组织DNA提取试剂盒 PCR级DNA溶液的OD/OD丽比值应为1.71.9 C.2实时荧光PCR c.2.1引物及探针 引物为Gc-F2(5'-aggtgatggaagggaggcctt3'/Ge-R2(5'-caggcgtcetggcctagag-3'),探针为Gc-P(5' FAM- -aaaaagccgcccgacctaccttca-TAMRA-3' C.2.2反应体系和程序 实时荧光PCR反应体系25AL,包括2×PrenmixExTaq12.5Al、上下游引物(10mol/儿L)和探针 10mol/L)各1AL模板DNA2AL,加无菌水补至25AL 柑橘黑斑病菌DNA作阳性对照、不含柑橘黑斑病菌DNA作阴性对照,以无菌水作空白对照 反应程序95C3min;然后95C15s,60C60s,共40个循环 注:本检测方法引自Schirmachereal.(2019),可将柑橘黑斑病菌与其他6种近似种区分开来,但不能区分P 声arcitricarpa C.2.3结果判定 在阳性对照、阴性对照、空白对照正常的情况 疑似分离物;出现典型扩增曲线判定为阳性;无典型扩增曲线判定为阴性 样品检测:出现典型扩增曲线,且Ct值35,判定为阳性;35GB/T40453?2021 ? ? ? ? ? 1
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GB/40453一2021 考文 参 献 AaHAvander.SstudiesinPhyos xictaI.SstudiesinMycology，1973,5:1-110 isolatesofthecitrusblack PJM，VerkleyG，e'a/. Nonpathogemie [2]BayenRP,Bonants spot ofwoodyplants，G ungus,Guigurdideitrierpa，identifiedas.acosmopolitanendophytec angi 2002，92:464-477. erae Phyo lotictacapitalensis).Phytopathology [3]EPPO.PM7/172):Gt uignardiaciricarpa，EPPOBuletin,2009，39(3);318-327. [门 EPpPOo.PM7/17 Diagnosticprotocolforregulatedpests:Phyotietaciriearpa[under revision].2020.https://gd.eppo.int/standards/PM7 [5]FAO2016ISPM DiagnosticprotoeolsforregulatedpestsDP5:PhylostieaCiri McAIpineAaonfruit.InternationalPlantProtectionConventionIPPC)，FAO，Rome. carpa [6]GlienkeC，Pereira Stringari etal.Endophyticandpathogenic Phyostiecta Spec1eS withreferencetothoseassociatedwithCitrusBlackSpot.Persoonia，201l，26:47-56. Guarnaceia GroenewaldJZ， al.FirstreportofPhyllostictacitricarpaandde scriptionoftwonewspecies， aracapitalensisandPparacitricar，fromcitrusinEurope. StudiesinMycology，2017，87:l61-185 [8 NAPPO.Phytosanitary AlertSystem:Confirmationofcitrusblackspot(Guigardiacitricara inFlorida-UnitedStates.NAPP(O,2010.http: www.pestalert.org/oprDetail.cfm?oprlD=421. Species-speeifcrealtimePCRfordd Schirmacher Toml ATnS IlnsOn agnosisof EPP(OBulletin，2019，49:306-313. C1tir1carpOn 10 Sutton Waterston citricarpa.CMIdescriptionsofpathogenicfungi andbacteriaNo.85.wallingford ImtP rnational.1966. Chen l1 Wang Huang .Phyllostictaspeciesassociatedwithcitrusdiseases 2012 209 inChina FungalDiversity 12 Wulandari Toanun Hyde etal，Phyllostictacitriasianasp，nov.，thecause GfCitrustanspotofCitrusma.rimainAsia.FungalDiversity，2009，34:23-39. Wi [13 eal.Aphylogeneticre-evaluationofPhyllosxticta ikeeS，lombard Nakashima Botryoshaeriales).StudliesinMycology,2013,76:1-29. [[14] ZhangDx，Mabberley，FloraofChinaEditorialcommittee(Eds) FloraofChina Englished.).Rutaceae.Vol.11[M].SeiencePress，Beijing/MissouriBotanicalGardenPress，St. Louis.2008;90-96. [15]王兴红，陈国庆，王卫芳，等 柑橘黑斑病(Citrusblackspot)发生危害现状和研究进展 果 树学报，2011，28(4):674-679. 13

柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法GB/T40453-2021

柑橘黑斑病是一种由真菌引起的病害，其主要危害柑橘果实，导致质量下降、销售受阻等问题。检疫机构需要对从外部进口的柑橘进行检疫和鉴定工作，以避免该病在国内传播。

为了更有效地控制柑橘黑斑病的传播，国家标准化管理委员会于2021年发布了最新的柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法GB/T40453-2021。该标准主要针对柑橘黑斑病菌的检测和鉴定，包括样品采集、处理、分离、培养、鉴定等各个环节。

GB/T40453-2021标准的发布，为柑橘黑斑病菌的检疫工作提供了更科学、更规范的方法，使我国柑橘行业在全球市场中更具竞争力。

首先，该标准明确了样品采集的步骤和注意事项。在采样的时候需要选择健康的果实，并且避免污染。接着，样品处理和分离是重要的步骤，该标准详细描述了不同样品类型的处理方法，并且建议使用多种培养基进行分离。

其次，标准规定了如何进行柑橘黑斑病菌的鉴定。通过观察病原菌形态和生理特性等方面，可以确定是否为柑橘黑斑病菌。除此之外，标准还介绍了一些常用的分子生物学方法，如PCR技术，来帮助鉴定。

总之，GB/T40453-2021标准的发布对于柑橘黑斑病菌的检疫和防治工作具有重要意义。遵循该标准进行检测与鉴定，可以更有效地控制病害的传播，从而保障我国柑橘业的可持续发展。

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2022/7/13 11:55:59 现行