白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法

白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法

国家标准 GB/T28630.3一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第3部分:原位杂交检测法 Diagn0sticprotoeolsforwhitespotdisease- Part3:lnsiluhybridizationmethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28630.3一2012 前 言 GB/T28630(白斑综合征(wSD)诊断规程》分为五个部分 -第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 第2部分;套式PCR检测法; 第了部分;原位杂交检测法 第4部分,组织病理学诊断达 第5部分;新鲜组织的TE染色法 本部分为GB/T28630的第3部分 本部分按照GB/Tl.1一209给出的规则起草 本部分由农业部提出 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAc/Tc156)归口 本部分起草单位水产科学研究院黄海水产研究所,农业部全国水产技术推广总站 本部分主要起草人;黄健、杨冰,陈爱平,宋晓玲,史成银、杨丛海、魏琦、,刘莉
GB/T28630.3一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第3部分:原位杂交检测法 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征原位杂交检测法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤和 结果判定 本部分适用于进行对虾及白斑综合征的其他敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估 和疾病的确诊 不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 GB/T28630.1一2012白斑综合征(wSD)诊断规程第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 GB/T28630.4一2012白斑综合征(wSD)诊断规程第4部分;组织病理学诊断法 原理 3.1白斑综合征的病原和病理学特征 见GB/T28630.4一2012的2.1 3.2技术原理 原位杂交检测方法是以非放射性标记物 地高辛(DIG)标记的白斑综合征病毒(wSsV)核酸探 针与存在于切片中的wSsVDNA进行核酸分子杂交,并通过抗原-抗体反应和酶-底物的化学显色反应 在组织切片上显示出wSsV的存在位点 原位杂交可完整保持组织与细胞形态,能在复杂组织中对单 -细胞进行病毒检测,准确反映组织细胞中病毒的分布 试剂和材料 4.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸水或去离子水或相当纯度的水 4.2核酸探针按GB/T28630.1-2012中6.2的规定 碱性磷酸酶偶联的DG抗体(AP抗DG.0.75U/L.4C)生化试剂 4.3 二甲苯 4.4 4.5无水乙醇 4.695%乙醇 中性树胶;生物染色用 4.7 石蜡(熔点52 4.8 "C54"C;切片级 4.9戴维森氏AFADavidson'sAFA)固定液:见附录A的规定
GB/T28630.3一2012 4.1080%乙醇:见附录A的规定 4.1170%乙醇:见附录A的规定 4. 2 50%乙醇;见附录A的规定 4.135004g/ml多聚赖氨酸;见附录A的规定 4. 142×ssC;见附录A的规定 4.151×ssC;见附录A的规定 4.160.5XssC,见附录A的规定 417TNE.见附录A的规定 4.18 100 蛋白酶K:见附录A的规定 4g/ml 9 0.4%甲醛;见附录A的规定 4.20杂交缓冲液见附录A的规定 4.21缓冲液I见附录A的规定 我.22缓冲液l见附录A的规定 缓冲液I;见附录A的规定 缓冲液N;见附录A的规定 显影液:见附录A的规定 4 .260.5%俾斯麦棕Y(BismarkbrownY):见附录A的规定 4.27阳性对照为受wSSV感染且组织病理学上有明显wSSV病灶的对虾组织切片(未脱蜡) 28阴性对照为未受wSsV感染且经原位杂交证明为阴性的对虾组织切片(未脱蜡) 4 器材和设备 51石蜡切片机;满足4Am~7m厚度的石蜡连续切片要求 5.2水浴锅;室温至100,上下波动1 5.3显微镜;带高倍镜(40x)和油镜(100×). ," 5.4微量移液器;量程0.5 10l.5l一40Al、40Al一200l.200Al1000l.各1支 5 普通冰箱:具冷藏箱,并带一18C以下冷冻箱体 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤 55 6 5.7石蜡包埋机或使用手工包埋步骤 5.8程控切片染色机或使用手工染色步骤 5.9切片保湿孵育箱;室温至50C,上下波动1C或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中 .10展片水浴锅敞口,无盖水浴锅或使用自制保温盒内加一定温度的水代替 .11平板烘片机室温至100C或使用恒温箱代替 12 切片染色杯 3 医用锻子 55 14 毛笔 5 15玻片架 55. 16吸管 .17载玻片 5. 55. .18盖玻片 5.19吸水纸 5.20暗盒:可用任何能避免强光直射的盒子
GB/T28630.3一2012 操作步骤 组织切片制备 6.1.1样晶采集的要求、固定方法和修整取材见G;B/T28630.4一2012中附录B的规定 6.1.2样品按GB/T28630.4一2012中5.2一5.5的规定将样品在程控组织脱水机中进行脱水,透明、 浸蜡,在石蜡包埋机上进行包埋,用石蜡切片机进行切片,切片厚度5pm 用毛笔将切片移人展片水浴 锅内展片,用已预包被5004g/ml多聚赖氨酸的载玻片捞出,置于平板烘片机上65烘烤45" m1n 原位杂交 6.2.1组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(3次,5min/次、 无水乙醉(2次,1mim/次),95%乙醉(2次,10s/次),80%乙醉(2次,10、/次).50%乙醉(1次、 10s/次)，然后用蒸僧水冲洗6次(勿让切片干燥). ,而后平放在切片保湿孵育箱中,吸取500AL100 g/ml蛋白爵 6.2.2组织切片置于TNE中5min K溶液,加于每张组织切片上,37C孵育15min 把组织切片上的蛋白酶K溶液吸干,然后将其放人预冷到4丫的0.4%甲醛溶液中浸5min. 室温下,用2×ssC浸洗组织切片5min 把组织切片平放在切片保湿孵育箱中,吸500L杂交缓冲液于每张组织切片上,42C孵育 30min 6.2.6按每毫升杂交缓冲液中加人1l4l核酸探针的用量取核酸探针置于一只微量离心管中 在100C沸水中将含核酸探针溶液的离心管煮沸10min,然后置于碎冰中淬冷 6. 2.7将上述核酸探针与相应量(每张切片应500aL.)的杂交缓冲液混合,吸取500aL混合液于每张 组织切片上,置于90C一95C平板烘片机上保温6min一10min,使组织DNA变性 注意补充切片上 过度蒸发的杂交缓冲液 6.2.8把组织切片放在平整的冰上淖冷5min 6 .2.9在切片保湿孵育箱内42C下孵育16h18h 6.2.10用缓冲液2×sSC(15min,室温)、1×SsC(5min,室温),0.5×SSc15min,42C),0.5× Ssc(15min,42C)、缓冲液I(5nmin,室温)洗组织切片 6.2.11用缓冲液封闭组织切片(500L/片),37C温浴30minl 6.2.12用缓冲液将AP抗DIG稀释至0.75U/mL(1AL0.75U/LAP抗DIG加到1mL缓冲液 I中),把组织切片平放在湿盒中,每片吸250l已用缓冲液I稀释的AP抗DG于组织切片上,37C 温浴30nmin. 6.2.13用缓冲液I(2次,l0min/次,室温)、缓冲液(1次,5min,室温)洗玻片 6. .2.14吸500Al显影液于每张组织切片上,室温下黑暗中放置1h3h 中间可取出短时间在显微 镜下观察显色情况,当阳性对照有明显显色时可中止反应,如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特 异性显色,则应立即终止显色 6.2.15室温下把组织切片置于缓冲液中15min终止反应 6.2.16组织切片上滴加双蒸水(1次,10s/次),0.5%俾斯麦棕Y(1次,1min/次),95%乙醉(3次 10s/次),无水乙醇(3次,10s/次)、二甲苯(4次,10s/次). 6.2.17滴加2滴中性树胶封片 6.2.18在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色的细胞内沉淀物并拍照
GB/T28630.3一2012 结果判定 7.1受wSSV感染的细胞显示阳性反应,即细胞核内有较深的蓝黑色颗粒沉淀,而阴性结果则无此沉 淀 感染程度越深,则着色越明显 对虾甲壳上的显色是非特异性反应所致,如果加有核酸探针和杂交 缓冲液的切片在90C95C平板烘片机上保温6min10min过程中,因缓冲液蒸发而使组织干燥， 干燥部分也会出现非特异性反应 7.2 阳性对照样品不显阳性反应或阴性对照样晶出现与阳性显色反应程度相当的非特异性反应,判断 检测结果无效,重新取样检测
GB/T28630.3?2012 ?A 淶?? ?? A.120Ssc ? 175.32g 2H,0 88.23g ??? 1000ml pH ?,档 A.22SSC 20SSC 100mL 900mL ? ,0.45m??,4C档 A.31SScC 20XSscC 50m ? 950ml ,0.45um??,4C A.40.5SSC 20SSC 50mL 1950mL ? ,0.45m??,4C档 A.510?I Tris 121.1g ? 87.7g" ?? 800ml ?pH 7.5 ?? 1000ml ?,4C档
GB/T28630.3?2012 A.6?I 100 10?I mL ? 900ml .0.45am??C A.710? Tris 121.1 g 58.4 g 800 ?? mL ?pH 9.5 ???(MgCl6H.o) 101.6g ?? 1000mL ,0.45Am??,4C,? A.8? 10? 100m ? 900ml ,0.45um??,4C,? A.9NBT? ?(NBT 100mg 0.931mL ? 0.402ml ??-20C A.10BCIP? 5--4--3--?(CIP) 100mg ? 2mL ???20C A.1110xTNE Tris 60.57g ? 5.84g EDTA2H.O 3.72g 900ml ??
GB/T28630.3?2012 pHH 1000 ? ml ?,4C档 A.12TNEs 10TNE 100ml ? 900m ,0.45um??,4档 A.1310mg/mL?K 100mg ?K 10mL ? ???(0.25mL/),-20±档 A.14100g/mL?K 10mg/ml?K 0.25mL TNE 24.75ml ??,,4C? A.150.4%? ?(37% 5.4mL 500mL ? ???4,?? enhardt's) A.1620?(De ???(5 0.4g 400(ficol400) 0.4g ??360(PVP36o) 0.4g ??? 100mL 0.45um,5mL/???20C档 A.1725%? (dextransulfate 25 g 100ml ? ??????-20C档
GB/T28630.3一2012 A.1810mg/ml鲑精DNA 250 鲑精DNAN mg 水 25ml 将鲑精DNA钠盐加人水中,用玻璃棒搅拌直至完全溶解 用6号针头的注射器反复抽打数次 在100C水浴中加热10min,立即放于冰浴中冷,分装于无菌小试管中,一20C保存 使用前在 100C水浴中加热5min.然后猝冷 A.19杂交缓冲液 20X×SSC 10 ml 100%甲酰胶 25mL 20×丹哈特氏液 2.5ml 10mg/mL 鲑精DNA 2.5ml 25%硫酸葡聚糖 10ml 混匀,4笔贮存 A.20缓冲液I blockingreagent I 0.5g 缓冲液l 100m 在60C一80C水浴中溶解,不断晃动,直至颗粒溶解 4C可贮存2周 A.2110×缓冲液M Tris 12.1 g EDTA-Na,2H,(O 3.7g 加水溶解,并定容至 1000ml 用盐酸调pH至8.0,高压灭菌 4C贮存 A.22缓冲液M 10×缓冲液N 100ml 900 水 mL 混匀,0.45m滤膜过滤除菌 4C贮存 A.2310"%聚乙烯醇 聚乙烯醇相对分子质量30000一70000) 10g 加水溶解并定容至 100ml 搅拌溶解后,分装10mL/管，一20C贮存
GB/T28630.3?2012 A.24?? 90ml ? 24mg 10%? 10ml 4C ???м NBT? 4.5AL BCIP? 3.5L A.250.5"%?Y ?Y(BismarkbrownY) 2.5g ? 500ml ??,?档 A.26500Hg/m (?25000 5mg ? 10ml ?,C档 A.27??AFA(Davidson'AFA)?? 95%? 330ml 220mL ?(37% 115ml ?(??)? 335mL ,?档 A.2880%? 95%? 800mL 950mL ? ,档 A.2970"%? 95%? 700ml ? 950ml ,档
GB/T28630.3?2012 A.3050"%? 500 95%? mL ? 950ml ,档 10

白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法GB/T28630.3-2012

白斑综合征(WSD)是水产养殖业中常见的病害之一，严重危害虾类的健康和养殖业的可持续发展。因此，快速、准确地诊断WSD对于保障水产养殖业的发展至关重要。目前，WSD的诊断方法有很多种，其中，原位杂交检测法是一种比较有效的方法。 GB/T28630.3-2012标准是基于对WSD病原菌白斑综合征病毒（WSSV）感染虾体组织进行研究得出的。该标准采用荧光原位杂交技术，可以直接对样品中的病原体进行检测，不需要扩增目标序列，具有较高的特异性和灵敏度。该方法的操作步骤包括样品制备、探针标记、杂交反应、荧光显微镜观察等。具体来说，首先需要采集虾体组织样品，然后通过蛋白酶K处理，使得病原体释放出来。接着，在制备好的探针上标记荧光素，与病原体目标序列互相结合，进行杂交反应。最后，使用荧光显微镜观察样品中是否产生荧光信号，以判断样品中是否存在WSSV。 GB/T28630.3-2012标准的优点是具有较高的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测出WSSV。此外，该方法还可以同时检测多个样品，具有较高的效率。但是，该方法也存在一些局限性，比如可能会受到样品质量等因素的影响。 总之，GB/T28630.3-2012标准作为一种原位杂交检测法，具有在WSD诊断中的重要作用。未来，随着技术的不断发展，相信会有更加先进、高效的诊断方法应用于WSD的检测中。

白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法的相关资料

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2022/10/28 19:16:17 现行

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白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法

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2022/10/28 18:47:59 现行