GB/T28974-2012
马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法
DetectionandidentificationofPotatovirusA-Nanoparticles-enlargedincolloidalgoldimmunochromatographicassay
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
- 文件大小343.60KB
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马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法
国家标准 GB/T28974一2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 DeteetionandidlentifeatioofpotatovirusA一Nanoparticles-enmlargedincolloidal goldimmun0chrommatographicassay 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28974一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:检验检疫科学研究院、湖南出人境检验检疫局
本标准主要起草人:邹明强、张帆、李锦丰、陈艳、戴华、田世民、马吉湘、金涌
GB/T28974一2012 引 言 本文件的发布机构提请注意,申明符合本文件时,可能涉及到6.4.3,B.4与增敏试剂相关的专利 的使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场
该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判
该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案
相关信息可以通过以下 联系方式获得 该专利持有人;检验检疫科学研究院 联系人邹明强 地址:北京市朝阳区高碑店北路甲3号检脸检疫科学研究院邮编l1238 请注意除上述专利外,本文件的某些内容能够仍可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这送 些专利的责任
GB/T28974一2012 马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法 范围 本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测马铃薯A病毒的原理,实验步骤及结果判 定等 本标准适用于植物及其产品组织中马铃薯A病毒的快速筛查
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 引进植物病原生物安全控制技术要求 GB/T236292009 GB/T23632一2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程 马铃薯A病毒基本信息 中文名;马铃薯A病毒 A 学名;potatovinu 缩写;PvA 分类地位;马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Poryirus). 马铃薯A病毒的其他信息参见附录A
方法原理 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理,采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规 胶体金免疫层析试纸条进行处理,提高检测灵敏度,根据试纸条颜色的变化,判定待测样品中是否存在 马铃薯A病毒
仪器设备、用具及试剂材料 5.1仪器设备 天平感量,1/10000g),离心机、组织捣碎机,低温冰箱等
5.2用具 微量移液器(2.5AL10L,20L,100AL,200AL、1000AL),研钵,离心管等
GB/T28974一2012 3 5. 试剂材料 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料(见附录B)
实验步骤 生物安全与废弃物处理 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照 GB/T23629一2009中5.7进行处理
样品制备 称取1g植物或其产品组织,加人2mL样品提取缓冲液用研钵研磨,然后4C下30o0兵 5000 g
取上请液制备成一个样品
离心10min， 样本存放 制备的样品在2笔8条件下保存应不超过24h,若需长期保存,应置一70C以下,避免反复 冻融
病毒检测 4 6. 检测步骤 取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条(即开即用),置于平整的台面上,向样品垫中分别 加人被检样品、阳性对照和阴性对照各100Al,每个试验同时做平行
室温放置15min,观察检测线和 质控线条带
6.4.2质量控制 质控线条带出现颜色,阳性对照检测线条带出现颜色,阴性对照检测线条带不出现颜色,检测结果 有效
如果质控线条带不出现颜色,或阳性对照检测线条带不出现颜色,或阴性对照检测线条带出现颜 色,出现任何一种现象以上者,说明检测结果无效,另选一批次试纸条重新按6.4.1操作
6.4.3增敏实验 向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加人100AL的PBST缓冲溶液进行清洗,反复清洗 3次,每次1nmin,然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加人30L增敏试剂,室温反应5min8min后 观察检测线条带颜色 .4.4结果判定 6. 检测线条带出现颜色,判定为阳性;检测线条带不出现颜色,判定为阴性
注:增敏前条带颜色为红色,增敏后因为氧化还原反应使条带颜色变为黑灰色 结果的确认 可疑阳性样品应采用马铃薯A病毒RT-PCR检测方法进行确认
GB/T28974一2012 样品的保存与复核 种子类样品保存6个月,如果发现带毒样品保存1年
植株中发现病毒的,采集病叶干燥后保存于 -20丫条件
检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档,以便必要时复核
复核程 序按照GB/T23632一2009中第6章进行操作
GB/T28974一2012 附 录A 资料性附录 马铃薯A病毒相关资料 A.1寄主范围 马铃薯A病毒的自然寄主为马铃薯(Solanumtuberosum);人工接种可侵染的植物(包括鉴别寄 主)为番茄Lycoersiconesculentum和L.pimpinelifolium)、假酸浆(Nicandrahysaloides),烟草 (Nicotianadebneyi,N.glauca、N.glutinoxu,N.sanderae、N..syvers/ris,N.tabacumcv.Samsun和 N.tabucumcev.whiteBurley),Solanwmdemissum×S.tuberosumcv.Aquila(一A6hybrid),S.demis n“SdA”和Daturameteloides
sun* A.2病害症状 多数马铃薯受该病毒侵染无明显症状,有的品种表现出轻型花叶脉间叶组织凸起呈褶皱状,叶脉 或叶脉间呈现不规则浅色斑及叶缘呈波状等症状
A.3分布地区 马铃薯A病毒分布于很多马铃薯重要产区,可存在于种薯、组培苗中,在欧洲各国、日本,美国,新 西兰以及的福建、黑龙江、云南等地均有分布
A.4传播方式 gulae、A
na.surli、NMacrosiphonsolaniflu、 该病毒可通过汁液、种薯及介体蚜虫(Aphisfrangu My4ser" rsicae及Neomyusci irum/leru、等)传播
GB/T28974一2012 B 附 录 规范性附录 纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定马铃薯A病毒试剂材料 B.1胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 样品垫为玻璃纤维素片;结合垫是喷好了金标马铃薯A病毒单克隆抗体的玻璃纤维素片,免疫金 释放时间小于5min,释放效率大于80%;硝酸纤维素膜的检测线上包被了马铃薯A病毒多克隆抗体 质控线上包被了1mg/mL的羊抗鼠IgG;吸水垫为吸水纸
其结构见图B.1
样品流动方向 检测线 样晶垫 吸水垫 硝殿纤 维素质 质控线 结合垫 PvC背衬 其中,玻璃纤维素片;吸水速率大于4、/em,吸水量大于50mg/cm; 硝酸纤维素膜(NC膜):毛细流动速率大于25s/cm 吸水纸;吸水速率大于3s/cem,吸水量大于100mg/em" 聚氯乙烯(PVC)板;初粘力大于或等于3号球,持粘力标准条件下大于80h， 图B.1胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条 B.2样品提取缓冲液 PBST 亚硫酸钠(NasO 1.3g PVP(Mw2400040000) 20 g 叠氮钠(NaN, 0.2g 4C储存
B.3PBs缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4) 氯化钠(NaCD) 8g
GB/T28974一2012 磷酸氢二钠(Na,HPO 1.15g 磷酸二氢钾(KHPO 0.2g Q.2g 氯化钾(KCD 0.5ml 吐温-20 蒸僧水定容至1L
B.4增敏试剂 将1%的氯金酸和10mmol/L的盐酸胫胺按1;5的体积比混合,混合后5min内使用 B.5阴性对照 取1《的一下保存的键康叶片组织,用研林微氮研磨粉碎,加人又mL样品提取缓冲液.1仑离 心10min(3000g一5000g)，取上清液制备成阴性对照
B.6阳性对照 取1g的一20C下保存的灭活的病叶组织,用研钵液氮研磨粉碎,加人2mL样品抛取缓冲液,4 离心10nmin(3000越一5000g>)，取上清液制备成阳性对照
马铃薯A病毒检疫鉴定方法纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法GB/T28974-2012
马铃薯是我国重要的农作物之一，但它容易受到多种病毒的侵袭。其中，马铃薯A病毒是造成马铃薯严重减产和死亡的主要病原体之一。因此，对于马铃薯进行A病毒检疫具有非常重要的意义。
传统的A病毒检测方法主要包括ELISA（酶联免疫吸附测定）和RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）等，这些方法具有灵敏度高、特异性好等优点。但是，它们也存在着成本高、操作复杂等缺点。
近年来，纳米技术的发展为病毒检测提供了新思路。基于纳米颗粒的增敏效应，科学家们开发出了一种新型的A病毒检测方法——纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法。该方法利用胶体金纳米颗粒的表面增大效应和局域表面等离子共振（LSPR）效应，极大地提高了检测的灵敏度。
相比传统的检测方法，纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法具有成本低、操作简单、检测时间快等特点。同时，该方法还可以实现多样化的样品处理方式，如直接使用植株组织样品进行检测，无需经过RNA/DNA提取等复杂步骤。
总体而言，纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法是一种非常有潜力的检测方法，将会在马铃薯A病毒检测领域发挥重要的作用。
