国家标准 GB/T29664一2013 化妆品中维生素B,烟酸、烟酰胺)的测定高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法 DeterminationofitaminB,nicotinicacidandnicotinamnide ineosmeties一HLCandHPLC-MS/Ms 2013-09-06发布 2014-02-15实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29664一2013 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会(SAC/TC257)归口本标准起草单位;大连市产品质量监督检验所(国家日化产品质量监督检验中心),上海市日用化学工业研究所国家香料香精化妆品质量监督检验中心,大连标准检测技术研究中心本标淮主要起草人;毛希琴,郑顺利,胡侠,孙稚菁、吴海霞、潘炜,武晓剑、康微
GB/T29664一2013 化妆品中维生素B:(烟酸、烟酰胺)的测定高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法范围本标准规定了化妆品中维生素B,烟酸、烟酰胺)测定的高效液相色谱法及高效液相色谱串联质谱法本标准适用于膏霜、乳液,化妆水、皂基如美容皂、蜡基如唇膏等化妆品中维生素B,烟酸、烟酰胺的定量测定,其中高效液相色谱法对烟酸、烟酰胺的检出限均为24g/g,定量限均为64g/g;高效液相色谱串联质谱法对烟酸,烟酰胺的检出限均为1004g/kg,定量限均为3004g/kg" 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法原理烟酸、烟酰胺为极性化合物易溶于水相,化妆品中的油溶性成分易溶于有机相,而化妆品中的表面活性剂则富集于有机相与水相界面处利用水和二氯甲炕(或异辛烧)双液相体系将目标物与化妆品中油溶性成分及表面活性剂初步分离酸性条件下用反相及强阳离子交换混合型固相萃取材料吸附富集目标物,脱除干扰物质后,洗脱,定容,用反相高效液相色谱分离,二极管阵列检测器检测(高效液相色谱法)或串联四级杆质谱检测(高效液相色谱串联质谱法),标准曲线外标法定量试剂和材料除非另有规定,所用试剂均为分析纯水为GB/T6682规定的一级水甲醇;色谱纯 4.1 甲醇;分析纯 4.2 4.3氨水;分析纯甲酸色谱纯 4.4 45甲酸;分析纯 4.6二氯甲婉分析纯 4.7异辛烧;分析纯 4.82%甲酸水溶液;移取2mL甲酸(4.5),用水稀释定容至100ml 4.92%氨水氨化甲醇;移取2ml氨水(4.3),用甲醇稀释定容至100ml 4.101%甲酸水溶液:移取1ml 甲酸(4.5),用水稀释定容至100mL
GB/T29664一2013 411sSitrarna-xC固相拳取小桂或相当者60mg,3mL 使用前,依次用2mL甲醉和2nL水活化 4.12标准储备液;准确称取烟酸和烟酰胺标准物质各250mg分别置于两个25ml的棕色容量瓶中，用蒸僧水溶解定容,配置成浓度为10mg/ml.的标准储备溶液,于4C一6笔条件下保存保存期一般不应超过2周 4.13系列标准溶液 4.13.1系列标准溶液A;首先将两种标准储备液等体积混合,配置成5mg/m的混合标准溶液,然后用2%甲股水(4.8)稀释配置成烟股和烟酰胶浓度均分别为1E/ml.s /mL、10 k/ml g 504g/ml,1004g/mL、5004g/mL、10004g/m的系列标准混合溶液用于液相色谱测试以上系列标准溶液,均需现用现配 4.13.2系列标准溶液B;首先将两种标准储备液等体积混合,配置成5mg/ml的混合标准溶液,然后用2%甲酸水(.8)稀释配置成烟酸和娘肤胶浓度均分别为5pe/L.l0pxL.0尾儿L..048儿L. 5004g/儿L、10004g/L的系列标准混合溶液用于液质联用测试以上系列标准溶液,均需现用现配 4.140.2um微孔尼龙滤膜 4.15标准物质见表1 表1标准物质英文名称、,INCI名称、,CAs号,分子式,分子结构式、相对分子质量、纯度化合物名称酸烟酰胶英文名称 Nicotinicacid Nicotinamide INC1名称 Niacin Niaceinamide CAs号 59-67-6 98-92-0 CH,N.O 分子式 CHNO HO H. 分子结构式相对分子质量 12311 122.13 纯度 >99,0% 仪器和设备 51高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(高效液相色谱法. 5.2高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪(Es源)(高效液相色谱串联质谱法) 5.3分析天平;感量0.1mg;0.01mg 5.4氮吹仪漩涡混合器 5.6超声波清洗器 5.7离心机转速不小于5000r/min,离心试管容量15ml 5.8移液枪或移液器
GB/I29664一2013 6 试样制备膏霜,乳液、化妆水,洗发水等化妆品样品的制备 6.1.1称取0.2g样品(精确至0.01g)于15mL具塞塑料离心管中,60条件下氮吹,尽量除去样品中的水分向离心管中准确加人4ml2%甲酸水溶液(4.8),涡旋混合使样品均匀分散后超声15min~ 30min， ,向离心管中加人3ml二氯甲烧(4.6),涡旋混合2min, 1,然后于5000r/min离心5 min一 20min 6.1.2准确移取1ml上层溶液过Strara-X-C固相萃取小柱(4.11),待自然流干后,依次加人1ml. 1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲醉(4.2)淋洗柱床,最后添加4mL2%氨水氨化甲醉(4.9)进行洗脱待自然流干后,吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液,氮吹挥干溶剂,准确添加1ml.水溶解,涡旋混合 ,确保瓶内残留物全部溶解后,用0.2m微孔尼龙滤膜过滤,待测 min，美容皂等固态基类化妆品样品的制备 6.2.1用刮铲或小刀将皂基样品刨成碎屑或丝状薄片,刨碎后迅速密封在容器中,并尽快进行称量称取0.2g(精确至0.01g),于15ml具塞塑料离心管中,先向离心管中准确加人4ml2%甲酸水溶液 (4.8)并置于沸水浴中5min 10min使皂基融化,涡旋混合使样品溶解并均匀分散,待冷却,继续向离 min20min 心管中加人3mlL二氯甲烧(4.6),涡旋混合2min后,于5000r/min离心5” 6.2.2余下步骤与6.1.2相同注:由于皂基变成碎屑或薄片时,样品表面积显著增大,皂中的水分会迅速挥发,带来称量误差因此建议尽量缩短取皂,碎皂及称量的时间,且实验室湿度高于50%,温度低于25C 6.3唇膏等蜡基化妆品样品的制备 6.3.1称取0.2g样品(精确至0.01g)于15ml具塞塑料离心管中,向离心管中加人2ml异辛婉 5min， 4.7),涡旋若样品不能够完全分散,需将离心管置于80C水浴中3min ,待样品完全融化后，向离心管中准确加人4ml.2%甲酸水溶液(4.8)(80C水浴预热),涡旋1min后,将离心管重新置于 80C水浴平衡5 min 1,取出再涡旋1min 若样品能够完全分散,则无需水浴加热,直接向离心管中准确加人4ml2%甲酸溶液(4.8)(80C水浴预热),涡旋2min 必要时于5000r/min离心5 min一 20min 取1mL下层水相,0.2Am微孔尼龙滤膜(4.14)过滤,待测如遇干扰,可参照步骤6.1.2对样品进行净化处理注:对烟酸、烟酰胺含量超过1%的化妆品样品建议将提取溶液2%甲酸水溶液的体积增加为8ml,其他条件不变，以避免超出固相萃取小柱的柱负载量,导致目标物回收率的降低分析步骤 7.1 高效液相色谱法 7.1.1液相色谱分析参考条件液相色谐测定的参考条件如下: 色谱柱SsBAq或相当者),1.84m,3mm×100mm; a b 柱温;30C; 流动相:A为100%水(含0.1%甲酸);B为100%甲醇(含0.1%甲酸); c
GB/T29664一2013 d 流速:0.3mL/min; 检测波长;260nm e 进样量:2L; f g)液相色谱分离条件见表2 表2液相色谱分离条件时间/min 流速/mL/min 流动相A/% 流动相B/% 0.3 100 100 6.0 0.3 60 6.1 0.3 60 9.0 0.3 40 9.1 0.3 100 13.0 0.3 100 min~13min 注1.0一6min为色谱分离过程,6 为色谱柱重新平衡 min9 min为洗脱强保留杂质的过程,9 过程注2:若上述液相色谐条件下遇到干扰,可改用100%水含0.1%乙酸为A相重新进行测试 B相相应改为 60%甲醉水溶液(含0.1%乙酸),相应流动相切换时间也需根据情况进行调整注3:柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱谐分离情况自由选择 7.1.2定性分析将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较,若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰,并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致,则可确认样品中存在该物质 0.1%甲酸为流动相及 0.1%乙酸为流动相的标准物质的液相色谱分离谱图分别参见附录A中图A.1及图A.2,标准物质紫外吸收光谱谱图参见附录A中图A.3,实际样品液相色谱分离谱图(0.1%甲酸为流动相)参见附录B 中图B.1 7.1.3定量分析各取1ml系列标准溶液A(4.13.1)过Strara-X-C固相萃取小柱(4.11),待自然流干后,依次加人 1mL.1%甲酸水溶液(4.10)和1mL甲醇(4.2)淋洗柱床,最后添加4mL2%氨水氨化甲醇(4.9)进行洗脱,待自然流干后,吹出柱床内溶液,收集所有流出溶液,氮吹挥干溶剂,准确漆加1mL水(80C水浴 Am微孔尼龙谴膜过滤,得测，中预热)定容溶解,涡旋混合1min,确保瓶内残留物全部溶解后,用0.2 移取上述系列溶液,注人高效液相色谱仪中进行测定,以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线样品溶液中烟酸和烟酰胺的含量,用标准曲线外标法确定化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按式(1)进行计算样品中维生素B的含量则等于样品中烟酸和烟酰胺的含量之和对样品溶液中目标物的含量高于10004g/mL的样品,为提高定量的准确性,建议减少进样量或适当稀释后进样 cX 样品中目标物的含量(mg/g)一 ×10 n1
GB/T29664一2013 式中: 从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); 按稀释倍数折算的被测样液总体积,单位为毫升(mL); 称取样品的质量,单位为克(g) 7 计算结果至少保留两位有效数字 7.1.4回收率和精密度在添加浓度0.01mg/g10mg/g的范围内,回收率在80%100%之间,相对标准偏差为0.2%~ 6.2% 7.15允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10% 7.2高效液相色谱串联质谱法 7.2.1液相色谱分离参考条件液相色谱测定的参考条件如下 a)色谱柱SBAq(或相当者),1.8Am,3mm×100mm 柱温:30C; b 流动相:5%甲醇水溶液(含0.05%甲酸); c d 流速:0.2ml/min 进样量:2L 注:柱的内径和长度及色谱填料粒径可根据色谱分离情况自由选择 7.2.2质谱参考条件质谱测定的参考条件如下 a)电离方式;电喷雾电离,正离子模式,ESI(十); 雾化气;氮气,241.325kPa(约合35psi); b 干燥气;氮气,流速10L/min,温度;350C; c 碰撞气;氮气; d 毛细管电压:3500V ee 检测方式;多反应监测(MRM); f 其他质谱条件见表3 g 表3烟酸和烟酰胺质谱分析参考参数炯烟酰胺酸母离子 124.1 123,1 碎裂电压 l10 l10 定量子离子(碰撞电压) 79.9(22 80.0(22) 78.0(24 78.0(24 定性子离子1(碰撞电压 52.9(32 53.1(32 定性子离子2(碰撞电压
GB/T29664一2013 7.2.3定性分析在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定,如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰的保留时间一致,所选择的3对子离子的质荷比也一致,而且样品定性离子的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较,相对偏差不超过表4规定的范围,则可判定样品中存在该物质标准物质总离子流质谱图和提取离子(定量)质谐图见附录A中图A.4 表4定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/% 50 2050 1020 10 士25 允许的相对偏差/% 士20 士30 士50 7.2.4定量分析各取1ml系列标准溶液B(4.13.2)过strara-X-C固相萃取小柱(4.1l),待自然流干后,依次加人 1ml.1%甲酸水溶液(4.10)和1ml甲醉(4.2)淋洗柱床,最后添加3ml2%氨水氨化甲醉(4.9)进行洗脱,待自然流干后,吹出柱床内溶液并收集所有流出溶液,氮吹挥干溶剂,准确添加1mL水(80笔水浴中预热)定容溶解,涡旋混合1 h,确保瓶内残留物全部溶解后,用0.2Mm微孔尼龙滤膜过滤,待 mln 测移取上述系列溶液,以色谱峰的峰面积对目标化合物的原始浓度制作标准曲线样品溶液中烟酸和烟酰胺的含量,用标准曲线外标法确定化妆品样品中烟酸和烟酰胺的含量则按公式(2)进行计算样晶中维生素B的含量则等于样品中烟酸和烟酷胶的含量之和 (对样品游液中目标物的含量高于10004g/L的样品,为提高定量的准确性,建议减少进样量或适当稀释后进样 c×V 样品中目标物的含量(4g/g)- 2 ×10 *-- n 式中: 从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度,单位为微克每升(4g/L); 按稀释倍数折算的被测样液总体积,单位为毫升(mL); 称取样品的质量,单位为克(g). 计算结果至少保留两位有效数字 7.2.5回收率和精密度在添加浓度0.14g/g10g/g的范围内,回收率在80%~110%之间,相对标准偏差为0.5%7% 7.2.6允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的10%
GB/I29664一2013 附录A 资料性附录烟酸,烟酰胺标准物质液相色谱图、紫外吸收光谱图及总离子流质谱图和提取离子(定量)质谱图烟般 E 烟肤酸 1/min 图A.1标准物质液相色谱图(0.1%甲酸水为流动相烟酸烟所胶 10/min 图A.2标准物质液相色谱图(0.1%乙酸水为流动相
GB/T29664一2013 烟肤胶烟酸 90210230250270290310330350370390 190210230250270290310330350370390 放长/mn 波长/nm 图A.3标准物质紫外吸收光谱图 +Tc总离子流质讲图 MRM124.1>79.9烟酸 fMRM123.1>80.0)烟肤胶 5.10 61/min 图A.4标准物质总离子流质谱图和提取离子(定量)质谱图
GB/T29664一2013 附录 B 资料性附录实际样品液相色谱图炯秩胶烟酸 /minm 图B.1实际样品液相色谱图(0.1%甲酸水为流动相

化妆品中维生素B3的测定方法

维生素B3是一种重要的维生素，也称为烟酸或烟酰胺。它具有促进皮肤健康和改善皮肤色泽的作用，在化妆品中被广泛使用。然而，过量摄入维生素B3可能会引起毒性反应，因此，在化妆品中控制维生素B3的含量十分重要。GB/T29664-2013标准中规定了用高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法两种方法来测定化妆品中维生素B3的含量。下面将分别介绍这两种方法。

高效液相色谱法

高效液相色谱法是一种可靠的检测化妆品中维生素B3含量的方法。具体操作步骤如下：

实验仪器和试剂

仪器：高效液相色谱仪、紫外探测器。

试剂：

甲醇
水
磷酸二氢钾
烟酰胺标准品

实验步骤

将待测化妆品样品加入锥形瓶中，加入甲醇与0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液混合，振荡后离心；
取上层清液过0.22微米滤膜后进样；
使用高效液相色谱仪进行分离和定量测定。

高效液相色谱串联质谱法

高效液相色谱串联质谱法是一种更加精确的测定化妆品中维生素B3含量的方法。具体操作步骤如下：

实验仪器和试剂

仪器：高效液相色谱-质谱联用仪。

试剂：

甲醇
水
氢氧化钠
乙腈
烟酰胺标准品

实验步骤

将待测化妆品样品加入锥形瓶中，加入氢氧化钠与乙腈混合，振荡后离心；
取上层清液过0.22微米滤膜后进样；
使用高效液相色相色谱-质谱联用仪进行分离和定量测定。

结果分析

根据所得数据，可以计算出化妆品中维生素B3（烟酸、烟酰胺）的含量。如果化妆品中维生素B3含量超标，则该化妆品可能会被召回或下架。因此，这两个方法有助于保障公众健康和利益。

总之，GB/T29664-2013标准中规定的高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法是快速、准确、可靠的测定化妆品中维生素B3（烟酸、烟酰胺）的方法。它们可以对化妆品进行准确的检测，保障公众健康和利益。