牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法

牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法

国家标准 GB/T22990一2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 DeterminationofoXytetracycline,tetracycline,chlortetracycline dosyeyelimeresidwesinmilkandmilkpowder HPLC-UVmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22990一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:郭春海、窦彩云、陈瑞春、马育松、艾连峰、吕红英、贾海涛、姚春毅、庞国芳
GB/T22990一2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱-紫外检测测定 方法 本标准适用于牛奶和奶粉中土霉素,四环素、金霉素,强力霉素残留量的测定 本标准的方法检出限:牛奶中土霉素、四环素为5g/kg,金霉素、强力霉素为104g/kg 奶粉中土 霉素、四环素为25g/kg、金霉素、强力霉素为50g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义(GBT6379.1 2004,ISO5725-1:1994,IDT) G;B/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分:确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) 原理 用0.1mol/ILNaEDTA-Mellvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留,OasisHLB或相当 的固相萃取柱和梭酸型阳离子交换柱净化,液相色谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3磷酸氢二钠(Na.HPO.12H.O). 4.4柠檬酸(C,H,O,Hl.O) 4.5 乙 ,二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H,(O). 4.6草酸(C,H,O2H,O. 0.2mol/几磷酸氢二钠溶液.称取71.63只瞬酸氢二钠(4.3),用水溶解,定容至1000ml 4.80.1mol/L柠檬酸溶液;称取21.04g柠檬酸(4.4),用水溶解,定容至1000ml Mellvaine缓冲溶液;将625ml.0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(4.7)与1000ml0.1mol/几L柠檬酸 溶液(4.8)混合,必要时用NaOH或HCl调pH=4.0士0.05 4.100.1mol/INa,EDTA-Mellvaine缓冲溶液;称取60.50g乙二胺四乙酸二钠(4.5)放人1625ml Mellvaine缓冲溶液(4.9)中,使其溶解,摇匀
GB/T22990一2008 4.110.01nmol/L草酸溶液;称取1.26g草酸(4.6),用水溶解,定容至1000 mlo 4.12甲醇-水(1十19);量取5mlL甲醉(4.1)与95mL.水混匀 4.130.01mol/几草酸-乙睛溶液(l十l);量取50ml草酸溶液(4.11)与50ml乙睛(4.2)混匀 4.14土霉素(oxytetraeycline,CAs;:2058-46-0),四环素(tetraeycline,CAs;64-75-5,金霉素(chle lortet- aeydlne.CAs.64-72-2),强力霉素(doxyey ycdline,CAs,24390-14-5)标准物质;纯度大于等于96% 4.150.1 mg/mL土霉素、四环素,金霉素、强力霉素标准储备溶液:准确称取适量的土霉素、四环素、 金霉素,强力霉素标准物质(4.14),分别用甲醇配成0.1mg/ml 的标准储备液 储备液于一20 保存 4.16土霉素,四环素,金霉素、强力霉素混合标准工作溶液;根据需要用流动相将土霉素,四环素,金霉 素,强力霉素标准储备液(4.15)稀释成所需浓度的混合标准工作溶液,储存于冰箱中,每周配制 417OasisHLB固相草取柱》或相当者500mg.Gnl 使用前分别用5mL甲醇和10nl水预处 理,保持柱体湿润 18梭酸型阳离子交换柱:500mg,6mL 使用前用5mL甲醇预处理,保持柱体湿润 仪器 5.1液相色谱仪;配有紫外检测器 5 分析天平;感量0.1mg,0.01g 5.3涡旋振荡器 55 4 冷冻离心机:转速大于5000r/min 5.5固相萃取装置 5.6真空泵 5.7氮气吹干仪 5.8pH计:测量精度土0.02 5.9刻度样品管;l0mL.精度为0.1mL 试样的制备与保存 6.1试样的制备 将牛奶从冰箱中取出,放置至室温,摇匀,备用 6.2试样保存 牛奶置于0C一4C冰箱中避光保存,奶粉常温避光保存 测定步骤 7.1提取 牛奶试样称取10g(精确到o.0lg),置于50mL具塞塑料离心管中 奶粉试样称取2g(精确到 0.01g),置于50ml具塞塑料离心管中 向试样中加人20mlL0.1mol/INaEDTA-Mclvaine缓冲 溶液(4.10),于涡旋振荡器上混合2" ,于10C,5000r/min离心10min,上清液过滤至另一离心管 2mln， 中 残渣中再加人20mL缓冲溶液,重复提取一次,合并上清液 7.2净化 将上清液(7.1)通过处理好的Oasi、HILB柱(4.17),待上清液完全流出后,用5mL甲醇-水(4.12 淋洗,弃去全部流出液 减压抽干5min,最后用5ml甲醉醇(4.1)洗脱,收集洗脱液于10ml.样品管中 1 OasisHLB固相萃取柱是waters公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22990一2008 将收集的洗脱液通过叛酸型阳离子交换柱(4.18),待洗脱液全部流出后,用5mL甲醇(4.1)洗柱， 减压抽干,用4ml0.01mol/L.草酸-乙晴溶液(4.l3)洗脱,收集洗脱液于l0mL样品管中,45C氮气 吹至1.5ml左右,流动相定容至2ml,供液相色谱-紫外检测器测定 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a)色谱柱:Kromasil100-5C,5um,150mm×4.6mm(内径)或相当者; 流动相:0.01mol/1草酸溶液-乙睛-甲醇(77十18+5): D) e)流速;l.0mL/min; 柱温:40C; d) 检测波长:350 e nm; f 进样量;60AlL 7.3.2液相色谱测定 将混合标准工作溶液(4.16)分别进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标 准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的 线性范围内 在上述色谱条件下,土霉素、四环素,金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09min、 3. .73min,8.27min和12.53min 土霉素、四环素、金霉素,强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A 中的图A. 1 7.4平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5空白试验 除不称取试样外,按以上步骤同时完成空白试验 7.6回收率试验 向阴性试样中添加标准溶液,均按上述步骤操作,测定后计算试样中添加的回收率 添加浓度及回 收率范围参见附录B中的表B.1 结果计算 被测物残留量的测定按式(1)计算 l000 x= xY 1000 m 式中 X -试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); -从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度;单位为纳克每毫升(ng/mL); -样品溶液定容体积,单位为毫升(mL) -样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 计算结果应扣除空白值 精密度 9 一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算 9 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,牛奶和奶粉中土霉素、
GB/T22990一2008 四环素、金霉素、强力霉素添加浓度范围及重复性方程见表1和表2 表1牛奶中四环素族抗生素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 重复性限r" 化合物名称 添加浓度范围 再现性限R 土霉素 550 g"=0.88!lgm一0.812 lgR=0.899lgm一0.574 gr=1.06ls 四环素 550 gR=1.00lg朋一0.612 lg朋一l.00 10100 金霉素 一1.08lgm一1.15 gR=0.819lIg g"一0.430 Igr 强力霉素 10~100 g尸=0.963lgm-0.903 lgR=0.838lg朋-0.465 注:m为两次测定结果的算术平均值 表2奶粉中四环素族抗生素添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R 土霉素 25一250 lgr=0.872lgm-0.791 lgR=0.834lgm-0.500 四环素 gR=0.877 25一250 gr=0.996lgm-1.07 lgm一0,542 50500 gr=0,997 1.12 lgR=1.12lgm-1.04 金霉素 lgm 50500 g尸=0.817lg朋一0.738 强力霉素 gR=0.860lg从一0.464 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 9 3 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,牛奶和奶粉中土霉素、 四环素、金霉素、强力霉素的添加浓度范围及再现性方程见表1和表2
GB/T22990一2008 附 录A 资料性附录 标准物质液相色谱图 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图,见图A.！ 35 30 四环素 25 土霉素 20 15 金霉素 10 强力霉素 -10 T23 /min 图A.1土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图
GB/T22990一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围试验数据,见表B.1 表B.1土霉素、四环素,金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围试验数据 牛奶 奶粉 化合物名称 添加浓度/(g/kg 回收率范围/% 添加浓度/4g/kg 回收率/% 71.3一87.6 25 71.9~98.7 10 81.294.6 50 76.590.0 土霉素 25 125 80.5~95.1 77.098,4 50 80.193.8 250 81.4~99.2 63.774.3 25 71.9~84.8 10 71.384.6 50 70.389. 四环素 25 70.280.3 125 80.293.6 50 70.086.3 250 81.8一92.9 10 71.7一85.7 71.5一84.3 50 20 70.688.3 100 81，490.8 金霉素 50 72.589.9 250 80.5~92.9 100 80.3~90.9 500 82.8~90." 10 71.185.7 72.6~93.6 50 20 70.890.5 100 80.2~89.l 强力霉素 50 74.0~88.5 250 82.894.5 100 500 82.l一94.8 81,4一90.7